Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định hình thái đơn tại vị trí codon 47 của gen P53 ở bệnh nhân ung thư phổi bằng phương pháp giải trình tự gen. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN PRO47SER GEN P53 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Trần Khánh Chi, Trần Vân Khánh, Nguyễn Đức Hinh, Nguyễn Thị Hà, Lê Văn Hưng, Tạ Thành Văn, Trần Huy Thịnh Trư ng H YH N Ngh n th h n ụ t nh t nh h nh th ơn t tr n (Pr r) g n nh nh n ng thư h ng hương h g tr nh t g n nh nh n ng thư h ngư h ng nh ng thư h n ngh n th t g tr nh t g n ụng nh NP Pr r (P4 ) g n t h ng h t h n n g n Pr rt tr n4 g n tr n nh ngh n Từ khóa: ung thư phổi, đa hình thái đơn nucleotid Pro47Ser, gen p53 I ĐẶT VẤN ĐỀ Gen áp chế ung thư p53 (OMIM, 191170) nằm vị trí p13.3 NST số 17, mã hoá protein p53 với 393 acid amin, có trọng lượng phân tử 53kDa [1] Đột biến gen p53 gặp 50 - 70% ung thư người Ước tính có 85 đa hình thái 27.580 đột biến soma gen p53 biết đến [2] Một số đa hình thái gen p53 có liên quan đến khuynh hướng dễ mắc bệnh ung thư làm tăng tính nhạy cảm với bệnh Các biến đổi gen đột biến hay đa hình thái làm chức bất hoạt vai trò protein p53 dẫn đến phát sinh ung thư Nhiều đa hình thái gen phát vùng khơng mã hố vùng mã hố đa số đa hình thái đơn Nucleotid (Single Nucleotide Polymorphisms-SNP)[3,4] Đa hình Pro47Ser nằm vùng exon gen p53 Đa hình codon 47 thay acid amin prolin serin vị trí codon 47 biến đổi nucleotid từ C - T, xác định Felley – Bosco năm 1993 Các biến thể đa hình Ser47 hiếm, với tần số alen 5% dân số có nguồn gốc châu Phi [5,6] Trong điều kiện bình thường, tác động protein p38 (homeodomain - interacting protein kinase 2) HIPK2, p53 phosphoryl hóa vị trí Ser46 dẫn đến tăng cường chép gen liên quan đến trình apoptosis Và alen p53 - Pro47 thay alen p53 - Ser47 phosphoryl hóa vị trí Ser46 bị giảm sút làm giảm hoạt tính tác động lên gen đích trình apoptosis tăng khả mắc h n h Tr n h nh Ch h YH N h h g Ng nh n 2014 Ng h th n 11 2014 nH nh trư ng ung thư Tuy nhiên, mối tương quan tính đa hình thái SNP P47S gen p53 với nhiều loại ung thư có ung thư phổi chưa khẳng định quán quần thể nghiên cứu khác [7; 8] Nhằm góp phần nghiên cứu đặc điểm gen người Việt Nam mối liên quan đến bệnh ung thư phổi, đề tài thực với mục tiêu: Xác định tính đa hình thái đơn vị trí codon 47 (SNP P47S) gen p53 bệnh nhân ung thư phổi phương pháp giải trình tự gen II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng - 170 mẫu máu bệnh nhân ung thư phổi nguyên phát trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học Hạt nhân Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai, chẩn đoán xác định xét nghiệm mô bệnh học - 97 mẫu máu người không mắc bệnh ung thư lựa chọn khoa Khám bệnh - bệnh viện Bạch mai - Hóa chất dùng nghiên cứu hãng QIAGEN, Sigma, Fermentas Quy trình nghiên cứu - Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu theo phương pháp sử dụng enzym protease K phenol: chloroform: isoamyl alcohol - Kiểm tra nồng độ độ tinh DNA phương pháp điện di gel agarose 0,8% đo mật độ quang bước sóng 260/280 nm - Khuếch đại vùng gen chứa codon 47 exon gen p53 phương pháp PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu: F: 5’ - CGT TCT GGT AAG GAC AAG GG – 3’ R: 5’-CAC TGA CGA GAA GCC AAA GG – 3’ TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 + Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10μl) gồm: 1X đệm PCR; 2,5mM dNTP, 0,2μMmồi xuôi ngược, 0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA H2O + Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút Bảo quản mẫu 15oC - Giải trình tự gen: Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen chứa codon 47 exon gen p53 kỹ thuật giải trình tự gen theo quy trình thường quy trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein + Thành phần phản ứng giải trình tự (thể tích 20μl) gồm: Đệm 3μl, BigDye 2μl, mồi xuôi ngược 1μl, 20 - 50ng DNA nước phút, 25 chu kỳ [96oC/10 giây, 54oC/5 giây, 60oC/4 phút] Bảo quản mẫu 15oC + So sánh kết thu với trình tự gen p53 Genbank (NG_017013) Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu + Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự: 96oC/1 Bảng Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Tuổi UTP (n1 = 170) Chứng (n2 =97) Min 33 47 Max 86 87 59,96 ± 9,72 66,42 ± 8,19 X ± SD Giới n % n % Nam 115 67,6 55 56,7 Nữ 55 32,4 42 43,3 - Bệnh nhân trẻ tuổi 33 tuổi, lớn tuổi 86 tuổi, trung bình 59,96 ± 9,72 tuổi - Tỷ lệ nam/nữ 2,09/1 - Nhóm chứng trẻ tuổi 47 tuổi, lớn tuổi 87 tuổi, tuổi trung bình 66,42 ± 8,19 Kết xác định SNP Pro47Ser gen p53 Khuếch đại vùng gen mang SNP Pro47Ser gen p53 M 10 11 511pb Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mang SNP Pro47Ser gen p53 M: Thang chuẩn 100b; 1÷5: sản phẩm PCR nhóm chứng; 6÷11: sản phẩm PCR bệnh nhân ung thư phổi TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 Sản phẩm PCR thu có chất lượng tốt, gồm băng có kích thước đặc hiệu 511bp Kết giải trình tự xác định kiểu gen SNP Pro47Ser gen p53 Hình Kết giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen chứa codon 47 gen p53 (a mẫu bệnh), (b mẫu chứng: đồng hợp tử CCG (Prolin)) Kết giải trình tự DNA bệnh nhân cho phép xác định kiểu gen vị trí codon 47 gen p53 Bảng Tần số alen kiểu gen SNP Pro47Ser gen p53 DNA mẫu nghiên cứu n = 267 Alen/Kiểu gen Nhóm bệnh Nhóm chứng n1 = 70 % n2 = 97 % C(Prolin) 340 100 194 100 T(Serin) 0 0 170 100 97 100 CT(Prolin/Serin) 0 0 TT(Serin/Serin) 0 0 CC (Prolin) Tất mẫu nghiên cứu bao gồm nhóm bệnh nhóm chứng có kiểu alen Prolin (CCG) kiểu gen Prolin/Prolin IV BÀN LUẬN Nghiên cứu thực 170 bệnh nhân ung thư phổi với tuổi mắc bệnh trẻ 33, cao 86 tuổi trung bình 59,96 ± 9,72 97 người không mắc bệnh ung thư xác định tính đa hình thái codon 47 gen p53 để đối chứng Kết nghiên nghiên cứu nhóm bệnh nhân ung thư phổi phù hợp với ghi nhận số nghiên cứu nước thấp so với số nghiên cứu giới Theo Ngô Quý Châu cộng (2012), tuổi trung bình bệnh nhân ung thư phổi 58,9 ± 8,6[9] Yang P CS (2005) nghiên cứu đặc điểm lâm sàng 5628 bệnh nhân ung thư phổi chẩn đoán từ 1997 đến 2003 Mayo Clinic ghi nhận tuổi trung bình bệnh nhân 65,4 ± 11,0 [10] Tuổi mắc bệnh xác định khác khu vực địa lý, chủng tộc điều kiện sống [11] Các nghiên cứu dịch tễ học giới Việt Nam khẳng định ung thư phổi phổ biến nam giới Nghiên cứu gồm 115 bệnh nhân nam giới (67,6%) 55 bệnh nhân nữ giới (32,4%), tỷ lệ nam/nữ 2,1/1 Kết thu phù hợp với nghiên cứu Ngô Quý Châu cộng (2012), bệnh nhân nam giới chiếm 73,3%, tỷ lệ nam/nữ 2,75/1 [9] Theo ghi nhận tình hình ung thư năm 2007, ước tính có khoảng 1.549.121 trường hợp ung thư phổi phát toàn giới, nam giới chiếm 71,6%, tỷ lệ nam/nữ 2,5/1 [11] Mặc dù mối tương quan đa hình codon 47 ung thư phổi cómột số tác giả nghiên cứu, nhiên đa hình chưa có nhiều cơng bố nên chưa cho thấy mối tương quan SNP P47S với ung thư phổi Trong nghiên cứu này, kết giải trình tự gen cho thấy đoạn gen khuếch đại exon gen p53 đặc hiệu, xác cho phép xác định TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 kiểu gen vị trí codon 47 Với kết xác định tính đa hình thái đơn codon 47 170 bệnh nhân ung thư phổi 97 người không mắc ung thư đối chứng thấy 100% có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro Kết phù hợp với nghiên cứu Auer cộng năm 1999 toàn 64 bệnh nhân ung thư phổi nghiên cứu có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro [12] Nghiên cứu Felley - Bosco cộng năm 1993 101 bệnh nhân ung thư phổi ghi nhận trường hợp có kiểu gen Pro/Ser người Mỹ gốc Phi khơng tìm thấy người da trắng [5] Nhiều nghiên cứu tính đa hình thái đơn codon 47 tiến hành đối tượng nghiên cứu khác nhau, nhiên tần suất gặp alen Ser47 thấp Năm 2008, Siraj cộng tiến hành nghiên cứu 223 bệnh nhân ung thư tuyến giáp 229 đối chứng người Ả Rập không ghi nhận alen Ser47 [13] Tương tự, nghiên cứu 100 bệnh nhân ung thư vú 100 đối chứng người Ả Rập Al-Qasem thấy 100% đối tượng nghiên cứu có kiểu gen đồng hợp tử Pro/Pro [14] Sameer cộng nghiên cứu 226 bệnh nhân ung thư đại trực tràng 156 người đối chứng người Kashmir Kết nghiên cứu ghi nhận trường hợp bệnh nhân, trường hợp đối chứng có kiểu gen đồng hợp tử Ser/Ser, nhiên khơng thấy mối liên quan tính đa hình thái đơn codon 47 với bệnh ung thư đại trực tràng [15] Nghiên cứu Jaiswal năm 2011 Bắc Ấn Độ 181 bệnh nhân ung thư bàng quang 176 đối chứng ghi nhận 6% nhóm bệnh, 3,5% nhóm chứng có kiểu gen dị hợp tử Pro/Ser, 3,5% nhóm bệnh 8,5% nhóm chứng có kiểu gen đồng hợp tử Ser/Ser Sự xuất alen Ser47 nghiên cứu đặc điểm chủng tộc đề tài nhánh cấp nhà nước “Đánh giá phân bố kiểu gen số gen liên quan đến ung thư phổi ung thư gan” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam” Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn trung tâm Hô Hấp, trung tâm Y học Hạt nhân Ung bướu - bệnh viện Bạch Mai, trung tâm Gen - Protein tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu Hiện nay, hầu hết bệnh ung thư thách thức lớn Y học giới, phần lớn bệnh nhân tử vong để lại hậu nặng nề cho gia đình xã hội Đối với bệnh ung thư phổi, nhà khoa học giới tiếp tục nghiên cứu tìm liệu pháp gen điều trị hiệu bệnh ung thư phổi Do đó, phát sớm phòng ngừa yếu tố nguy biện pháp tốt nhằm giảm thiểu tỷ lệ bệnh ung thư phổi Việt Nam toàn Thế giới Li X., Dumont P., Pietra A.D, et al (2005) The codon 47 polymorphism in p53 is functionally significant, Ch 280, 24245 - 24251 V KẾT LUẬN 100% đối tượng nghiên cứu mang kiểu gen đồng hợp tử Pro47Pro gen p53 Lời cảm ơn Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí TÀI LIỆU THAM KHẢO McBride O.W., D.Mery and D Givol (1986) The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13) Pr N t , 83, 130 - 134 Hollstein M., D Sidransky, B Vogelstein et al (1991) P53 mutations in human cancers n , 253: 49 - 53 Costa S., D Pinto, D Pereira et al (2008) Importance of TP53 codon 72 and intron duplication 16bp polymorphisms in prediction of susceptibility on breast cancer C C n r 8, - 32 Whibley C, Pharoah PD and Hollstein M (2009) p53 polymorphisms: cancer implications N t C n r 9: 95 - 107 Felley-Bosco E, Weston A, Cawley HM, Bennett WP, et al (1993) Functional studies of a germ-line polymorphism at codon 47 within the p53 gene H n t 53, 752 - 759 Pietsch EC, Humbey O and Murphy ME (2006) Polymorphisms in the p53 pathway n g n 25: 1602 - 1611 Feng L., Hollstein M and Xu Y., (2006) Ser46 phosphorylation regulates p53-dependent apoptosis and replicative senescence C C 5, 2812 - 2819 Ngô Quý Châu, Lê Hoàn, Nguyễn Thanh Phương (2012) “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng ung thư phổi nguyên phát di sọ não Trung tâm Hô Hấp- Bệnh viện Bạch Mai”, T h Yh ng 68, 30 - 34 10 Yang P., Allen M.S., Marie C Aubry M.C., et al (2005) Clinical Features of 5,628 Primary Lung Cancer Patients: Experience at Mayo Clinic From 1997 to 2003, Ch t 128, 452 - 462 11 American Cancer Society (2007) t g r 200 C n r TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 12 Auer H., Warncke K., Nowak D Et al., (1999) Variations of p53 in cultured fibroblast of patients with lung cancer who have a presumed genetic predisposition, C n n 22, 278 - 282 14 Al-Qasem A., Toulimat M., Tulbah A Et al., (2012) The p53 codon 72 polymorphism is associated with the risk and early onset of breast cancer among Saudi women, n tt 3, 875 - 878 13 Siraj A.K., Al-Rasheed M., Ibrahim M et al., (2008) RAD52 polymorphisms contribute to the development of papillary thyroid cancer susceptibility in Middle Eastern population, n rn n t 31,893899 15 Sameer A S., Shah Z A., Syeed N Et al., (2010) TP53 Pro47Ser and Arg72Pro polymorphisms and colorectal cancer prdisposition in an ethnic Kashmiri population, n t 9, 651 - 660 Summary DETERMINATION OF PRO47SER POLYMOPHISM OF P53 GENE IN LUNG CANCER PATIENTS SEQUENCING METHOD This study was conducted to determine Pro47Ser polymorphism of p53 gene in lung cancer patients by sequencing method.170 lung cancer patients and 97 controls were selected for this study The sequencing method was used to analyze Pro47Ser polymorphism in p53 gene Results: we did not find any P47S polymorphism of p53 gene in both lung cancer patient group and control group Keywords: Lung cancer, Pro47Ser polymorphism, p53 gene ... xác cho phép xác định TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014 kiểu gen vị trí codon 47 Với kết xác định tính đa hình thái đơn codon 47 170 bệnh nhân ung thư phổi 97 người không mắc ung thư đối chứng... Kết giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen chứa codon 47 gen p53 (a mẫu bệnh) , (b mẫu chứng: đồng hợp tử CCG (Prolin)) Kết giải trình tự DNA bệnh nhân cho phép xác định kiểu gen vị trí codon 47 gen. .. trung bình 59,96 ± 9,72 97 người không mắc bệnh ung thư xác định tính đa hình thái codon 47 gen p53 để đối chứng Kết nghiên nghiên cứu nhóm bệnh nhân ung thư phổi phù hợp với ghi nhận số nghiên cứu