PHÂN TÍCH đa HÌNH c188t của GEN CYP2D6 BẰNG kỹ THUẬT RFLP PCR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI GIANG THU NGA PHÂN TÍCH ĐA HÌNH C188T CỦA GEN CYP2D6 BẰNG KỸ THUẬT RFLP-PCR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA KHÓA 2011-2015 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN HUY THỊNH Hà Nội -2015 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp bước ngoặt quan trọng đánh dấu giai đoạn kết thúc sinh viên trở thành cử nhân y khoa, nhân viên y tế Trong q trình thực khóa luận em nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cơ, bạn bè gia đình Em xin thành cảm ơn TS Trần Huy Thịnh, thầy bảo cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý giá Em xin cảm ơn CN Lê Hồng Bích Nga, chị tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thực khóa luận Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới GS-TS Tạ Thành Văn - Giám đốc Trung tâm Gen-Protein, TS Trần Vân Khánh Phó- Giám đốc Trung tâm Gen-Protein, Trưởng Bộ môn Bệnh học Phân tử, thầy cô dành nhiều thời gian để bảo giúp đỡ em từ bước đầu nghiên cứu khoa học làm luận văn tốt nghiệp kinh nghiệm sống Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trường, phịng Đào Tạo Đại Học, thầy mơn Hóa Sinh, thầy anh chị trung tâm nghiên cứu Gen-Protein Trường Đại Học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn, giúp đỡ em thực khóa luận Và cuối cùng, xin cảm ơn cha mẹ người thân gia đình, người ln bên cạnh, ủng hộ dành điều tốt đẹp để hoàn thành khóa luận Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Giang Thu Nga CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc … ***… LỜI CAM ĐOAN Kính gửi: - Phịng đào tạo đại học Trường Đại học Y Hà Nội - Bộ môn Truyền Nhiễm Trường Đại học Y Hà Nội - Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp Tên em là: Giang Thu Nga – sinh viên tổ 41 lớp Y4L Trường Đại học Y Hà Nội, khóa 2011 – 2015 Em xin cam đoan số liệu khóa luận có thật, kết hồn tồn xác, khách quan, trung thực khơng chép từ tài liệu khác Em xin hoàn chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Giang Thu Nga MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư phổi 1.1.1 Dịch tễ học .3 1.1.2 Các yếu tố nguy bệnh ung thư phổi 1.1.3 Phân loại, chẩn đoán, tiên lượng điều trị 1.2 Sơ lược gen CYP2D6 .9 1.2.1 Vị trí cấu trúc .9 1.2.2 Chức enzym CYP2D6 10 1.2.3 Tính đa hình thái 12 1.3 Hiện tượng RFLP SNP 16 1.3.1 Hiện tượng RFLP 16 1.3.2 Tính đa hình đơn Nucleotide (SNP) .17 1.4 Phương pháp PCR-RFLP 18 1.4.1 Nguyên lý phương pháp PCR-RFLP 18 1.4.2 Kỹ thuật PCR 18 1.4.3 Enzym cắt giới hạn (RE) 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.1 Thời gian địa điểm 22 2.1.2 Đối tượng khảo sát .22 2.1.3 Đạo đức nghiên cứu 22 2.2 Trang thiết bị, dụng cụ hóa chất nghiên cứu 22 2.2.1 Dụng cụ trang bị 22 2.2.2 Hóa chất dùng nghiên cứu 23 2.3 Quy trình kỹ thuật .24 2.3.1 Quy trình lấy mẫu 24 2.3.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi 25 2.3.3 Khuếch đại đoạn gen CYP2D6 .27 2.3.4 Kỹ thuật PCR-RFLP .29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Kết tách chiết DNA 33 3.2 Kết phản ứng PCR .35 3.3 Kết PCR-RFLP 36 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 39 4.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 39 4.2 Kết tách chiết DNA 39 4.3 Kết khuếch đại gen CYP2D6 .40 4.4 Kết PCR-RFLP 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số SNP gen CYP2D6 14 Bảng 1.2 Tần số kiểu gen CYP2D6*10 số dân tộc 16 Bảng 1.3 Vị trí cắt số enzym giới hạn .20 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA đối chứng .33 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA bệnh nhân ung thư phổi 34 Bảng 3.3 Tỉ lệ kiểu gen 37 Bảng 3.4 Tỉ lệ alen 38 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Tình hình mắc ung thư phổi giới năm 2012 (Nguồn GLOBOCAN 2012) Hình 1.2 Vị trí gen CYP2D6 NST Hình 1.3 Cấu trúc gen CYP2D6 10 Hình 1.4 Cơ chế sinh ung thư Cytochrome P450 11 Hình 1.5 Minh họa tính đa hình đơn Nu (SNP) 17 Hình 1.6 Minh họa phương pháp PCR .19 Hình 2.1 Minh họa phản ứng cắt enzym .29 Hình 2.2 Minh họa kết sau xử lý với enzym HphI sản phẩm khuếch đại gen CYP2D6 .31 Hình 3.1 Minh họa đo OD mẫu DNA tách chiết máy Nanodrop 1000.34 Hình 3.2 Minh họa hình ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0.8% 35 Hình 3.3: Minh họa điện di sản phẩm PCR mẫu đối chứng 36 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân ung thư phổi 36 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR CYP2D6 mẫu đối chứng sau xử lý enzym HphI 36 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR CYP2D6 mẫu bệnh nhân ung thư phổi sau xử lý enzym HphI .37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT SNP PCR RE RFLP OD DNA RNA mRNA Nu CYP CYPs CYP2D6 NST Kb Bp dNTP ddNTP TE CC KK CI OR Single Nucleotide Polymorphism Hiện tượng đa hình thái đơn Nucleotid Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase Restriction enzyme Enzym cắt giới hạn Restriction Fragment Length Polymorphism Hiện tượng đa hình chiều dài đoạn DNA enzym giới hạn Optical Density (Độ hấp thụ quang) Deoxiribo Nucleic Acid Ribonucleic Acid Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin) Nucleotide (hoặc Deoxyribonucleotide) A: Deoxyadenosine triphosphate T: Thymidine triphosphate G: Deoxyguanosine triphosphate C: Deoxycytidine triphosphate Cytochrome Cytochrome p450 Cytochrome 2D6 Nhiễm sắc thể Kilo base base pair Deoxyribonucleotid - – Triphosphate Dideoxyribonucleotid - – Triphosphate Tris EDTA Mẫu chứng Mẫu bệnh Confidence Interval (Độ tin cậy) Odds Ratio (Tỷ suất chênh) Bảng viết tắt acid amin: Ala Arg Alanine Arginine Gly His Glycine Hisidine Asn Asp Cys Gln Glu Pro Thr Tyr Asparagine Aspartic acid Cysteine Glutamine Glutamic acid Proline Threonine Tyrosine Ile Leu Lys Met Phe Ser Trp Val Isoleucine Leucine Lysine Methionine Phenylalanine Serine Trytophan Valine ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ năm 1908, Laennec mô tả ung thư phổi từ điển Y học nay, ung thư phổi mối quan tâm hàng đầu giới Theo thống kê tổ chức nghiên cứu ung thư giới, năm 2012 có 1,8 triệu trường hợp ung thư phổi chẩn đoán đứng hàng đầu loại ung thư Đây tình hình chung Việt Nam Các thống kê hiệp hội Ung thư quốc gia cho thấy số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục năm gần Hiện nay, việc chẩn đoán phát sớm điều trị vấn đề quan trọng bệnh học ung thư Cùng với phương pháp chẩn đoán theo dõi ung thư truyền thống chụp Xquang, chụp CTscan nhà khoa học nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm cách chẩn đốn nhanh xác ung thư [1] Ngày nay, với tiến khoa học kỹ thuật, đặc biệt tiến nhanh Y - sinh học phân áp dụng rộng rãi chẩn đoán sớm ung thư, có ung thư phổi Việc phát bất thường mức độ DNA RNA gen gây ung thư phân tích đa hình thái số gen chủ chốt xác định nguy ung thư thơng qua phân bố kiểu gen cá thể CYP2D6 gen quy định mã hóa cho enzym CYP2D6 – có vai trị quan trọng chuyển hóa số thuốc lâm sàng Việc tăng hay giảm hoạt động enzym CYP2D6 nghiên cứu chứng minh có liên quan đến tính mẫn cảm số bệnh ung thư, có ung thư phổi Theo số nghiên cứu nhà khoa học giới, giảm hoạt động enzym CYP2D6 có liên quan đến bệnh Parkinson (Smith et al,1992), bệnh bạch cầu, ung thư phổi (Ari Hirvonen, et al., 1993) ung thư miệng (Worrall 34 Nồng độ Mã số DNA KK 01 (ng/μl) 341.8 KK 02 KK 03 KK 04 KK 05 KK 06 KK 07 KK 08 KK 09 KK 10 50.3 94.7 314.9 189.9 59.9 53.6 97.1 178.0 118.1 Nồng độ A260/280 Mã số DNA A260/280 1.91 KK 11 (ng/μl) 58.2 1.90 1.84 1.90 2.0 1.87 1.99 2.0 1.83 1.89 2.02 KK 12 KK 13 KK 14 KK 15 KK 16 KK 17 KK 18 KK 19 KK 20 163.6 50.1 198.2 378.6 157.8 128.6 204.5 226.9 123.7 1.90 1.96 1.98 2.0 1.83 1.93 2.01 1.84 1.90 Hình 3.1 Minh họa đo OD mẫu DNA tách chiết máy Nanodrop 1000 Các mẫu DNA tách chiết có số A260/280 dao động khoảng 1,8-2,0 với nồng độ lớn 50ng/μl Các mẫu DNA có đường biểu diễn độ hấp thụ quang không gãy khúc, đỉnh hấp thụ tương ứng với bước sóng 260 nm Nhận xét: 35 Các mẫu DNA tách chiết đảm bảo tinh đạt nồng độ đạt yêu cầu cho phản ứng PCR (Các mẫu DNA pha loãng nồng độ 50,0 ng/μl để thực phản ứng PCR) Kết kiểm tra DNA tổng số phương pháp điện di: Hình 3.2 Minh họa hình ảnh điện di DNA tổng số gel agarose 0.8% Nhận xét: Các mẫu DNA thể băng nhất, sáng rõ gel, không bị đứt gãy, nguyên vẹn, đủ điểu kiện để thực thí nghiệm 3.2 Kết phản ứng PCR Sau tách chiết, sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen CYP2D6 Chúng tiến hành điện di gel agarose 1,5%, sản phẩm PCR sau điện di có kích thước 272bp 272bp M CC1 CC2 CC3 CC4 CC5 CC6 CC7 CC8 CC9 CC10 CC11 Hình 3.3: Minh họa điện di sản phẩm PCR mẫu đối chứng 36 KK1 KK2 KK3 KK4 KK5 KK6 KK7 KK8 KK9 KK10 KK11 M 272bp Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân ung thư phổi Nhận xét: Trên gel điện di, mẫu DNA xuất băng nhất, màu sáng rõ, tương đối đồng kích thước 272bp Sản phẩm thu đặc hiệu, rõ nét, đạt yêu cầu cho kỹ thuật PCR-RFLP 3.3 Kết PCR-RFLP Áp dụng kỹ thuật PCR-RFLP, sản phẩm PCR xử lý enzym cắt HphI (ủ 37°C/16-20h) Sản phẩm điện di gel agarose 3% CC1 CC2 CC3 CC4 CC5 CC6 CC7 CC8 CC9 CC10 (-) M Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR CYP2D6 mẫu đối chứng sau xử lý enzym HphI KK1 KK2 KK3 KK4 KK5 KK6 KK7 KK8 KK9 KK10 (-) M 37 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR CYP2D6 mẫu bệnh nhân ung thư phổi sau xử lý enzym HphI Nhận xét: Với quy trình điện nêu phần 2.3.4 phân tách băng với kích thước 213bp, 112bp+101bp (do hai đoạn DNA có kích thước chênh lệch 11bp nên trình điện di chưa tách rõ ràng, nên tạo băng sáng) 59bp + Với kiểu gen CYP2D*1/*1(C188/C): Điện di cho kết băng sáng ứng với kích thước 213bp 59bp + Với kiểu gen CYP2D6*10/*10 (T188/T): Điện di cho kết băng sáng ứng với kích thước 112bp+101bp 59bp + Với kiểu gen CYP2D6*1/*10 (C188/T): Điện di cho kết băng sáng ứng với kích thước 213bp, 112bp+101bp 59bp Phân tích kết xác định tính đa hình C188T gen CYP2D6 cho bảng 3.2 bảng 3.3 Bảng 3.3 Tỉ lệ kiểu gen Nhóm chứng Kiểu gen Nhóm bệnh (N=20) (N=20) CYP2D6*1/*1 (C188/C) CYP2D6*10/*10 (T188/T) 11 11 CYP2D6*1/*10 (C188/T) Tổng 20 20 Nhận xét: Trong nhóm nghiên cứu chủ yếu tồn kiểu gen CYP2D6*10/*10 (T188/T), kiểu gen CYP2D6*1/*10 (C188/T) chiếm tỉ lệ nhỏ kiểu gen CYP2D6*1/*1 (C188/C) chiếm tỉ lệ nhỏ Tỉ lệ kiểu gen nhóm tương tự Bảng 3.4 Tỉ lệ alen 38 Alen CYP2D6*1 (188C) CYP2D6*10 (188T) Tổng Nhóm chứng 13 27 40 Nhóm bệnh 12 28 40 Nhận xét: Ở nhóm tỉ lệ alen đột biến CYP2D6*10 (188T) lớn tỉ lệ alen CYP2D6*1 (188C) Tỉ lệ alen hai nhóm tương tự Tuy nhiên, cỡ mẫu nhỏ nên kết khơng có ý nghĩa thống kê 39 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn nhóm nghiên cứu 20 bệnh nhân ung thư phổi nhóm chứng gồm 20 người khỏe mạnh Tất giữ bí mật thơng tin cá nhân, giải thích rõ ràng mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành có đồng ý đối tượng tham gia nghiên cứu Để đánh giá xác tương quan tính đa hình gen CYP2D6 ung thư phổi, nhóm chứng cần tương đồng với nhóm bệnh yếu tố tuổi, giới, tiền sử hút thuốc, môi trường làm việc Các đánh giá cần điều chỉnh theo tuổi, giới phân tầng theo yếu tố nguy để tránh ảnh hưởng, gây nhiễu đến kết Với khn khổ khóa luận tốt nghiệp, trọng nhiều đến việc hồn thiện quy trình kỹ thuật nên đánh giá sau mang tính chất sơ bộ, gợi ý cho nghiên cứu quy mô lớn chi tiết 4.2 Kết tách chiết DNA DNA mang thông tin di truyền hầu hết sinh vật Do nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lượng DNA đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm Vì vậy, tách chiết DNA khâu đầu tiên, quan trọng quy trình thao tác DNA DNA tách chiết có nồng độ, độ tinh cao, không bị đứt gãy, không bị tạp nhiễm giúp phản ứng PCR đạt kết tốt Trong phương pháp tách chiết DNA phương pháp Phenol-Chloroform lựa chọn cho kết tốt 40 Tất mẫu DNA nhóm bệnh nhân nhóm chứng sau tách chiết đo nồng độ kiểm tra độ tinh cách đo mật độ quang máy Nanodrop 1000 Nguyên tắc phương pháp dựa vào sư hấp thụ ánh sáng chất bước sóng xác định Acid Nucleic hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm có có mặt base purine pyrimidine Giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (OD 260nm) mẫu cho phép xác định nồng độ DNA mẫu Để kiểm tra độ tinh dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD 280nm Ở bước sóng này, protein có mức hấp thụ cao Ngoài protein hấp thụ ánh sáng bước sóng 260nm DNA làm sai lệch giá trị thật nồng độ DNA Một mẫu DNA xem tỷ số A 260/A280 nằm khoảng 1,8-2,0 Các thông số nồng độ tinh mẫu DNA cho bảng 3.1 Từ bảng số liệu, ta thấy: - Tất mẫu đạt nồng độ 50ng/μl vậy, đảm bảo đủ nồng độ để thực phản ứng PCR thành công - Tỉ số A260/A280 nằm khoảng 1,8-2.0 cho biết DNA tách tương đối tinh sạch, hồn tồn cho kết PCR tốt Để khẳng định kết tách chiết lần nữa, thực điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% hình ảnh điện di cho thấy DNA không bị đứt gãy, đảm bảo độ nguyên vẹn đạt đủ nồng độ cho phản ứng PCR thành công, tất mẫu DNA điện di lên băng sáng sau nhuộm Ethidium Bromide chụp hình (hình 3.2) 4.3 Kết khuếch đại gen CYP2D6 Khuếch đại đoạn gen CYP2D6 công đoạn nghiên cứu Đây giai đoạn quan trọng việc xác định tính đa hình C188T gen CYP2D6 41 Để kiểm tra hiệu độ đặc hiệu kết khuếch đại gen CYP2D6 phản ứng PCR, sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,5%, nhuộm Ethidium Bromide chụp ảnh lại máy soi gel chụp ảnh tự động Phản ứng PCR đạt hiệu hình ảnh điện di có băng DNA có kích thước 272bp phù hợp với kích thước đoạn gen cần khuếch đại, đặc hiệu, rõ nét, băng phụ Hình 3.3 3.4 cho thấy có băng sáng, rõ nét đường điện di với kích thước tương ứng với 272bp đoạn gen cần khuếch đại Như vậy, sản phẩm PCR đạt yêu cầu độ tinh sạch, nguyên vẹn đặc hiệu Kết PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố, phải kể đến là: - Chất lượng nồng độ DNA mẫu - Nồng độ thiết kế mồi - Nồng độ ion Mg2+ - Taq DNA polymerase - Hệ thống đệm - Chu trình nhiệt Bất yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng kết phản ứng PCR sau Hiện nay, enzym Taq DNA Poymerase hưởng sản xuất kèm theo hệ thống đệm với pH thích hợp, chứa ion Mg2+ dNTP với nồng độ phù hợp Các yếu tố trước tiên ảnh hưởng tới kết phản ứng PCR nồng độ độ tinh DNA mẫu, chu trình nhiệt thiết kế mồi Chất lượng DNA tách chiết đảm bảo nồng độ độ tinh cho phản ứng PCR; cặp mồi sử dụng thành công lần thử nghiệm nghiên cứu trước Do vậy, để có sản phẩm PCR mong muốn, trước tiên phải chuẩn hóa chu trình nhiệt cho PCR Trong khâu này, nhiệt độ thời gian gắn mồi đặc biệt quan trọng 42 ảnh hưởng lớn đến hiệu suất độ đặc hiệu sản phẩm PCR Để có sản phẩm PCR tốt, phải thử nghiệm nhiều lần điều kiện gắn mồi khác Sau thử nghệm, nhận thấy nhiệt độ gắn mồi 54°C 30s đạt kết tốt Tất mẫu khuếch đại máy PCR với chu trình nhiệt: biến tính 94°C phút; biến tính 94°C 30 giây; gắn mồi 54°C 30 giây; kéo dài 72°C 45 giây; kéo dài 72°C phút, thực 37 chu kỳ Bảo quản mẫu 15°C Chu trình nhiệt chứng minh hiệu tất mẫu khuếch đại 4.4 Kết PCR-RFLP Sau tách chiết DNA có chất lượng tốt, đảm bảo nồng độ độ tinh sạch, thực phản ứng khuếch đại đoạn gen CYP2D6 với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR thu có kích thước 272bp, sau điện di gel agarose 1.5% để kiểm tra độ nguyên vẹn, độ tinh độ đặc hiệu xử lý enzym cắt đặc hiệu có tên HphI để xác định tính đa hình gen CYP2D6 thơng qua có cắt hay khơng cắt tương ứng với kiểu gen khác gen CYP2D6 Với phương pháp PCR-RFLP việc xác định SNPs đoạn DNA trở nên dễ dàng nhiều Trong phương pháp này, tùy theo sai khác Nu mà chọn enzym cắt giới hạn thích hợp Trong nghiên cứu tính đa hình C188T gen CYP2D6, chúng tơi lựa chọn enzym HphI có trình tự nhận biết 5' G G T G A (N)8 ↓ 3'để phát SNP Kết nhận định alen CYP2D6*10 (188T) bị cắt thành mảnh với khích thước 59bp, 101bp 102bp; cịn alenCYP2D6*1 (188C) bị cắt thành mảnh có kích thước 59bp 213bp Để kiểm tra, điện di sản phẩm cắt enzym gel agarose 3% sử dụng Marker 100bp Kết điện di cho thấy enzym cắt hoàn toàn 43 mẫu DNA, băng rõ ràng, kích thước phù hợp, cho phép nhận định kết dễ dàng xác (hình 3.5 hình 3.6) Như vậy, quy trình xác định tính đa hình đơn gen CYP2D6 kỹ thuật PCR-RFLP hồn thiện tóm tắt sau: - Lấy máu tĩnh mạch, bảo quản 4-8°C tách chiết DNA - Tách chiết DNA phương pháp Phenol/chloroform từ mẫu máu toàn phần vịng 72h sau lấy mẫu Nếu khơng tách phải để tủ lạnh âm sâu - Kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tách chiết cách đo OD điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 30 phút điện 100V - Khuếch đại đoạn gen CYP2D6 cặp mồi đặc hiệu - Điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% điện 90V 30 phút để kiểm tra sản phẩm PCR - Xử lý mẫu PCR enzym HphI, để tủ ấm 37°C từ 16-18 tiếng - Điện di sản phẩm cắt gel agarose 3% 90 phút hiệu điện 90V để đọc kết cắt enzym Qua phân tích kết xác định SNP gen CYP2D6 trên, nhóm nghiên cứu phát tính đa hình C188T gen CYP2D6, đánh giá sơ tỉ lệ kiểu gen CYP2D6 nhóm chứng nhóm bệnh Tỉ lệ phù hợp với nghiên cứu Ji L 1, Pan S (2002) người Trung Quốc (tỉ lệ alen CYP2D6*10 51%) [26] Tuy nhiên lại có khác biệt lớn so với kết nghiên cứu M Ingelman-Sundberg người da trắng có tỉ lệ alen CYP2D6*10 1-2%, người châu Phi da đen 6% người Ethiopia Saudi Arabians 3-9% [27] Điều gợi ý tỉ lệ kiểu gen CYP2D6 thay đổi theo chủng tộc, địa lý 44 Tỉ lệ kiểu gen CYP2D6 tần số alen nhóm bệnh nhóm chứng khơng có khác biệt đáng kể Tuy nhiên, nghiên cứu này, cỡ mẫu nhỏ (N=20), Việt Nam chưa có nghiên cứu tương đương nào, vậy, kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu chưa có nhiều ý nghĩa thống kê Song, điều khắc phục tăng cỡ mẫu lên tiến hành nghiên cứu chuyên sâu 45 KẾT LUẬN Các kết thu từ nghiên cứu cho thấy rằng: Đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR-RFLP xác định tính đa hình C188T gen CYP2D6 áp dụng cho nghiên cứu sâu với cỡ mẫu lớn Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP phân tích tính đa hình thái C188T gen CYP2D6 bệnh nhân ung thư phổi, xác định hình thái gen CYP2D6, cho kết tỉ lệ loại kiểu gen nhóm chứng nhóm bệnh là: CYP2D6*1/*1: 4/20 3/20 CYP2D6*1/*10: 11/20 11/20 CYP2D6*10/*10: 5/20 6/20 Những kết ban đầu từ nghiên cứu cho thấy: Tỉ lệ kiểu gen C118/T gặp nhiều nhóm nghiên cứu (ở nhóm chứng 11/20, nhóm bệnh 11/20) Chưa có khác biệt có ý nghĩa thống kê tần suất alen đột biến T kiểu gen đột biến T188/T hai nhóm TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Viết Hà, Đặng Văn Khoa Bước đầu theo dõi thay đổi nồng độ CEA bệnh nhân hóa trị ung thư phổi Horn, L; Pao W; Johnson DH (2012) "Chapter 89" Harrison's Principles of Internal Medicine (18th ed.) International Agency for Research on Cancer (IARC): www.iarc.fr Beitler JJ Stereotactic body radiation therapy for nonmetastatic lung cancer: an analysis of 75 patients treated over years Journal Clinical Oncology 27, (2009), 3290-3296 Yong-chuan Wang, Li-juan Ei, Un-tian Liu Comparison of cancer incidence between China and the USA Ngô Quý Châu, Chu Thị Hạnh, Nguyễn Thanh Hồi cộng sự; “Ung thư phổi” Nhà xuất Y học (2009) Trung tâm nghiên cứu phát sớm ung thư (Center for research and early detection of cancer): www.ungthuvn.org Kumar, V; Abbas AK; Aster JC (2013) "12" Robbins Basic Pathology (9th ed) Elsevier Saunders p 505 Bệnh viện K, tạp chí Y học thực hành, 29/9/2009 10 International Center of Biotechnology Information (NCBI): www.ncbi.nlm.nih.gov 11 Li-Ping Zhou, Hong Luan, Xi-Hua Dong Genetic Variants of CYP2D6 Gene and Cancer Risk: A HuGE Systematic Review and Meta-analysis 12 Pedro Dorado1, Macarena C Cáceres Development of a PCR-based strategy for CYP2D6 genotyping including gene multiplication of worldwide potential use BioTechniques 39:571-574 (October 2005) 13 Teh LK, Bertilsson L (2012) Pharmacogenomics of CYP2D6: molecular genetics, interethnic differences and clinical importance Drug Metab Pharmacokinet 27 (1): 55–67 14 Shiju Mathew An overview on the allelic variant of CYP2D6 genotype African Journal of Biotechnology, Vol (54), pp 9096-9102 (29 December, 2010) 15 M Ingelman-Sundberg Genetic polymorphisms of cytochrome P 450 2D6 (CYP2D6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity The Pharmacogenomics Journal (2005) , 6–13 16 Matteo Falzoi, Luigi Pira, Paolo Lazzari, and Luca Pani: Analysis of CYP2D6 Allele Frequencies and Identification of Novel SNPs and Sequence Variation 17 Kang Hui, Zhao Jun-hua, Zhang Jiao-jiao Single Nucleotide Polymorphisms of CYP2D6 Gene G4268C, C188T and ERCC1 Gene C8092A and Their Genetic Susceptibility to Lung Cancer China Papers (9/10/2010) 18 www.pharmacologyweekly.com/table-cyp2d6-genetic-polymorphismspharmacogenetics 19 ProteinJu-yi Li, Xiu-fang Wang, Zhao-qing Zhang Correlation between CYP2D6*10 Gene Mutation, and Structure and Function of its Encoding 20 Gene Polymorphism of CYP2D6*10 in Chinese China Papers, Post on September 2, 2010 http://mt.china-papers.com/2/?p=111139 21 Trần Thị Thanh Hương, Trịnh Văn Bảo (2010), Di truyền y học, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, 65-72 22 Rasmussen H.B (2012) Restriction Fragnent Length Polymorphin Analysis of PCA-RFLP and Gel Electrophoresis-Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting Gel electrophoresis-Principles and Basics, 315-325 23 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học 24 Lodish H et al (2004) Molecular Cell Biology ed 5th 361-363, 371-375 25 www.thermoscientific.com/onebio 26 Ji L, Pan S, Wu J Genetic polymorphisms of CYP2D6 in Chinese mainland, 2002 Dec;115(12):1780-4 27 M Ingelman-Sundberg Genetic polymorphisms of cytochrome P 450 2D6 (CYP2D6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity The Pharmacogenomics Journal (2005) , 6–13 ... tài ? ?Kỹ thuật PCR -RFLP phát tính đa hình C188T gen CYP2D6 bệnh nhân ung thư phổi? ?? nhằm thực hai mục tiêu cụ thể sau: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật PCR -RFLP xác định tính đa hình C188T gen CYP2D6. .. ung thư vú (12,8%) Ung thư phổi đứng hàng đầu nguyên nhân chết ung thư (20%), sau ung thư đại tràng (11,9%) ung thư dày (8,1%) [3] Tại Hoa Kỳ, ung thư phổi loại ung thư gây tử vong hàng đầu bệnh. .. tính đa hình C188T số mẫu ung thư phổi so sánh với mẫu đối chứng 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư phổi Ung thư phổi xuất từ mô phổi, thư? ??ng từ tế bào đường dẫn khí Ung thư phổi