Tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 trên bệnh nhân ung thư phổi

Đa hình A4889G trên gen CYP1A1 được chỉ ra là yếu tố nguy cơ cao gây ung thư phổi trên người Châu Á. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định tính đa hình A4889G của gen CYP1A1 ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi so với nhóm đối chứng. 220 mẫu bệnh nhân ung thư phổi và 200 người không mắc bệnh ung thư được lựa chọn vào nghiên cứu.

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TÍNH ĐA HÌNH A4889G CỦA GEN CYP1A1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI Lê Hồng Công, Trần Huy Thịnh, Tạ Thành Văn Trường Đại học Y Hà Nội Đa hình A4889G gen CYP1A1 yếu tố nguy cao gây ung thư phổi người Châu Á Nghiên cứu thực nhằm xác định tính đa hình A4889G gen CYP1A1 nhóm bệnh nhân ung thư phổi so với nhóm đối chứng 220 mẫu bệnh nhân ung thư phổi 200 người không mắc bệnh ung thư lựa chọn vào nghiên cứu Kỹ thuật PCR - RFLP (PCR - Restriction fragment length polymorphism) lựa chọn để xác định tính đa hình A4889G Kết cho thấy, tần số alen A G nhóm bệnh nhân ung thư phổi chưa có khác biệt so với tần số alen A G nhóm đối chứng với p > 0,05 Tuy nhiên, kết cho thấy rõ mối liên hệ kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA với yếu tố nguy hút thuốc có ý nghĩa thống kê với tỷ suất chênh OR = 2,208; 95% CI = 1,127 - 4,326 p < 0,02 Bước đầu thấy tương quan đa hình thái A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi với yếu tố nguy hút thuốc người Việt Nam Từ khóa: Ung thư phổi, đa hình A4889G, gen CYP1A1 I ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi loại ung thư thường gặp nghề nghiệp đột biến gen di truyền qua hệ khác nguyên nhân gây tử vong hàng đầu Cytochrome P450 (CYPs) liên họ nhiều nước Thế giới [1] Hút thuốc lớn chứa hemoprotein xúc tác nhiều cho nguyên nhân gây ung thư phản ứng enzym khác để chuyển hóa phổi, 85 - 90% bệnh nhân ung thư phổi chất nội sinh ngoại sinh Trong hệ hút thuốc Tuy nhiên 20% số người thống cytochrome P450, cytochrome P450 hút thuốc bị ung thư phổi, điều cho thấy 1A1 (CYP1A1) enzym hoạt hóa các yếu tố khác bao gồm biến thể di chất chìa khóa để kích hoạt q trình truyền đóng vai trò quan trọng trao đổi chất hydrocarbons có nhân chế gây bệnh ung thư phổi [2] Sự phát sinh, thơm, amin dị vòng dẫn đến hình thành phát triển bệnh ung thư phổi diễn qua nhiều phân tử DNA bất thường từ khởi đầu giai đoạn tác động yếu tố nguy cho trình ung thư [3] Kết cơ, mẫn cảm gen q trình tích lũy nghiên công bố gần cho thấy đột biến xảy gen gây ung thư Các có mối liên quan chặt chẽ ung thư phổi yếu tố nguy bao gồm hút thuốc lá, nhiễm với đa hình gen CYP1A1; đó, đa hình virus human papillomavirus (HPV), môi trường, A4889G gen CYP1A1 yếu tố nguy cao gây bệnh ung thư phổi đối tượng người Châu Á [4 - 7] Địa liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Để góp phần hiểu rõ mối liên quan Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn đa hình A4889G gen CYP1A1 với Ngày nhận: 15/12/2016 nguy ung thư phổi, nghiên cứu thực Ngày chấp thuận: 26/2/2017 nhằm: 48 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Xác định tính đa hình A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi người bình thường Đánh giá mối tương quan tính đa hình A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi người bình thường II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP + Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10,2μl) gồm: 4,7 μl Taq polymerase; 0,3μl mồi xuôi; 0,3μl mồi ngược; 1,2μl DNA 3,7μl H2O + Chu trình nhiệt phản ứng PCR: o 94 C/5 phút, 35 chu kỳ [94oC/40 giây, 54oC/30 giây, 72oC/45 giây], 72oC/7 phút Bảo quản mẫu 15oC Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%, với điện 95V, Đối tượng 25 phút Nhóm bệnh lý: gồm 220 bệnh nhân ung thư phổi điều trị Bệnh viện Bạch Mai Xác định đa hình A4889G gen CYP1A1 kỹ thuật cắt enzym giới hạn: có 165 nam 55 nữ với tuổi trung + Thành phần phản ứng: 5μl H20; 1,5μl bình 60 ± 9,1 Bệnh nhân ung thư phổi Buffer 10x; 0,5μl enzym MspI, 8μl sản phẩm thăm khám lâm sàng, làm xét nghiệm cận PCR Phản ứng cắt ủ nhiệt độ 37oc lâm sàng làm xét nghiệm giải phẫu bệnh để qua đêm, sau điện di gel agarose chẩn đoán xác định ung thư phổi 2,5% với điện 80V, 90 phút chụp Nhóm chứng: 200 người chương ảnh hệ thống máy EC3 Imaging system trình quản lý tăng huyết áp đái tháo đường, Khi enzym MspI cắt đoạn gen tạo gồm 129 nam 71 nữ, tuổi trung bình 66 ± đoạn DNA có kích thước 204 bp (kiểu gen 9,4 Được kiểm tra định kỳ X-quang để GG); 149 bp 55 bp (kiểu gen AA); 204bp, loại trừ ung thư phổi 149 bp 55 bp (kiểu gen AG) Bệnh nhân ung thư phổi nhóm chứng lấy 2ml máu chống đơng EDTA Phương pháp - Phân tích số liệu Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16.0 để phân tích số liệu Dùng kiểm định χ2 để so sánh tỷ lệ kiểu gen hai nhóm ung thư Tách chiết DNA DNA tổng số tách chiết từ mẫu nhóm chứng Để ước tính mối liên quan kiểu gen khả mắc ung thư phổi máu theo phương pháp sử dụng enzym pro- dùng tỷ xuất OR với khoảng tin cậy 95% Các tein K phenol: chloroform: isoamyl alcohol kiểm định có ý nghĩa p < 0,05 - Kỹ thuật PCR-RFLP (PCR- Restriction Fragment Length Polymorphism): Đạo đức nghiên cứu Đề tài thông qua hội đồng đạo PCR sử dụng để khuếch đại vùng đức Trường Đại học Y Hà Nội theo chấp gen đa hình A4889G gen CYP1A1 với thuận số 118/HĐĐĐ-ĐHYHN ngày 31/1/2013 cặp mồi: Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào Mồi xuôi: 5’ - TAG GAG TCT TGT CTC nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi ATG CCT - nghiên cứu không đồng ý tiếp tục tham gia Mồi ngược: 5’- CAG TGA AGA GGT GTA GCC GCT - 3’ vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân ’ TCNCYH 106 (1) - 2017 đảm bảo bí mật 49 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC III KẾT QUẢ Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Bảng Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu Các đặc điểm Ung thư phổi n1 (%) Nhóm chứng n2 (%) p 165 (75%) 129 (65%) > 0,05 55 (25%) 71 (35%) Tuổi Trung bình (M) 60 66 Độ lệch (SD) 9,1 9,4 Giới Nam Nữ Hút thuốc Khơng 132 (60%) Có < 10 bao/năm 88 (40%) 25 (37%) > 10 bao/năm 55 (63%) 143 (71,5%) 57 (28,5%) > 0,05 < 0,05 Giải phẫu bệnh K biểu mô tuyến 114 (51%) K không tế bào nhỏ 14 (6,2%) K tế bào nhỏ 13 (6%) Chưa xác định 84 (36,8%) Bảng cho thấy tỷ lệ nam cao nữ nhóm nghiên cứu độ tuổi trung bình 60 nhóm ung thư phổi 66 nhóm đối chứng Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi, tỷ lệ bệnh nhân không hút thuốc cao nhóm bệnh nhân có hút thuốc hút > 10 năm chiếm tỷ lệ cao hút thuốc 10 năm Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi xác định giải phẫu bệnh; ung thư biểu mô tuyến chiếm tỉ lệ cao (51%) Xác định tính đa hình A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi người bình thường Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen chứa đa hình A4889G gen CYP1A1, sản phẩm PCR tiếp tục cắt enzym MspI để xác định kiểu gen khác 50 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bệnh nhân ung thư phổi Bệnh nhân K phổi MK PCR (+) AA AG GG AG Ngườibình bình thường thường Người AG AA AG AG 204 bp 204bp 149bp 149 bp 55bp 255 bp Hình Kết xác định đa hình A4889G gen CYP1A1 kỹ thuật PCR – RFLP MK: Marker 100bp, PCR: sản phẩm PCR không cắt enzym, (+) mẫu đối chứng dương cắt enzym Sản phẩm cắt đoạn vùng A4889G gen CYP1A1 enzym MspI mẫu bệnh nhân ung thư phổi nhóm chứng có kích thước khác phù hợp với tính tốn lý thuyết Mẫu mang kiểu gen GG gồm băng DNA có kích thước 204 bp Mẫu mang kiểu gen AG gồm băng DNA có kích thước 204 bp, 149 bp, 55 bp Mẫu mang kiểu gen AA gồm băng DNA có kích thước 149 bp 55 bp (hình 1) Nghiên cứu tiến hành đánh giá phân bố kiểu gen AA, AG, GG nhóm bệnh nhân ung thư phổi so sánh nhóm đối chứng (bảng 2) Bảng So sánh phân bố kiểu gen nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) AA 85 (38,6%) 90 (45,0%) AG 103 (46,8%) 85 (42,5%) GG 32 (14,6%) 25 (12,5%) Tổng 220 200 p > 0,05 420 Kết bảng cho thấy phân bố kiểu gen AA, AG, GG nhóm bệnh nhân ung thư phổi 85 (38,6%), 103 (46,8%), 32 (14,6%), khơng có khác biệt so với nhóm chứng, p > 0,05 Để tìm khác biệt nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm chứng, tiếp tục so sánh kiểu gen với TCNCYH 106 (1) - 2017 51 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng So sánh phân bố kiểu gen AG với kiểu gen AA nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) Kết AG 103 (54,8%) 85 (45,8%) OR = 1,283 AA 85 (45,2%) 90 (54,2%) (95% CI = 0,849 - 1,939) Tổng 188 175 Bảng cho thấy kiểu gen AG AA nhóm bệnh nhân ung thư phổi khơng có khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,283 với độ tin cậy (95% CI = 0,849 - 1,939), p > 0,05 Bảng So sánh phân bố kiểu gen GG với kiểu gen AA nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) Kết GG 32 (27,4%) 25 (21,7%) OR = 1,355 AA 85 (72,6%) 90 (78,3%) (95% CI = 0,743 - 2,473) Tổng 117 115 Bảng cho thấy kiểu gen GG so với kiểu gen AA nhóm bệnh nhân ung thư phổi khơng có khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,355 với độ tin cậy (95% CI = 0,743 2,743), p > 0,05 Chúng tiến hành đánh giá phân bố kiểu gen AG - GG kết hợp (kiểu gen đột biến) so với kiểu gen nguyên thủy AA (wild type) so sánh kiểu gen với nguy hút thuốc Bảng So sánh phân bố kiểu gen AG, GG với kiểu gen AA nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi n1 (%) Nhóm đối chứng n2 (%) Kết AG - GG 135 (61,4%) 110 (55,0%) OR = 1,299 AA 85 (38,6%) 90 (45,0%) (95% CI = 0,881 - 1,917) Tổng 220 200 Bảng cho thấy kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA nhóm bệnh nhân ung thư phổi khơng có khác biệt so với nhóm chứng với tỷ suất chênh OR = 1,299 với độ tin cậy (95% CI = 0,881 - 1,917), p > 0,05 52 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng So sánh kiểu gen AG, GG kiểu gen AA với yêu tố nguy hút thuốc nhóm ung thư phổi đối chứng Kiểu gen Nhóm ung thư phổi có hút n1 (%) Nhóm đối chứng có hút n2 (%) AG - GG 53 (60,2%) 24 (40,7%) OR = 2,208 (95% CI = 1,127 - 4,326) AA 35 (39,8%) 35 (59,3%) Tổng 88 59 Kết Mặc dù hai kiểu gen khơng có khác biệt hai nhóm bệnh nhân ung thư phổi nhóm đối chứng Tuy nhiên, kết bảng cho thấy rõ mối liên hệ kiểu gen AG, GG so với kiểu gen AA với yếu tố nguy hút thuốc có ý nghĩa thống kê với tỷ suất chênh OR = 2,208; (95% CI = 1,127 - 4,326) p < 0,02 Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu giới công bố mối liên quan hút thuốc chế gây ung thư phổi IV BÀN LUẬN Trong cộng đồng người châu Á, đa hình thái gen CYP1A1 xác định Châu Á có tương quan với nguy mắc ung thư phổi cao so với cộng đồng người da làm tăng nguy mắc ung thư phổi so với trắng châu Mỹ [6] Năm 2011, nghiên cứu cộng đồng người châu Âu châu Mỹ [6; 7] tác giả người Trung Quốc Một số nghiên cứu người dân Nhật cho thấy có mối liên quan chặt chẽ giữ nguy Bản mối liên quan kiểu gen ung thư phổi với kiểu gen CYP1A1 CYP1A1 nguy ung thư phổi, đặc biệt T6235C CYP1A1 A4889G [9] ung thư phổi tế bào nhỏ [4; 5] Ở Việt Nam, Tuy nhiên, kết nghiên cứu nghiên cứu mối liên quan đa hình khơng cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống gen CYP1A1 nguy mắc ung thư phổi kê phân bố alen đa hình hạn chế Vì vậy, nghiên cứu A4889G gen CYP1A1 nhóm bệnh thực để hiểu rõ mối liên quan nhân ung thư phổi nhóm chứng với p > kiểu gen đa hình A4889G 0,05 điều khác biệt với nghiên cứu gen CYP1A1 với ung thư phổi tác giả châu Á đa hình A4889C Năm 1990, tác giả người Nhật lần gen CYP1A1 [2; 10; 11] Có thể chúng tơi cơng bố mối liên quan kiểu gen CYP1A1 cần nghiên cứu với cỡ mẫu theo phân với ung thư phổi quần thể người loại giải phẫu bệnh lớn thời gian dài châu Á, tác giả đưa kết luận bệnh nhân ung thư phổi có đa hình CYP1A1 Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ kiểu cao gấp ba lần nhóm khỏe mạnh [8] Năm gen AG GG đa hình A4889G gen 1993, nghiên cứu cho thấy kiểu gen CYP1A nhóm bệnh nhân ung thư phổi có A4889G gen CYP1A1 cộng đồng người hút thuốc có khác biệt có ý nghĩa thống kê TCNCYH 106 (1) - 2017 53 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC với kiểu gen AA đa hình CYP1A1 study of CYP1A1 polymorphisms identifies risk nhóm chứng với p < 0,05 Kết tương haptotypes in nonsmall cell lung cancer Tho- tự với nhiều nghiên cứu tác racic oncology, 7, 152-159 giả Châu Âu Châu Á [6; 7; 2; 11] Đặc biệt Vineis P, Alavanja M, Buffler P et al (2004) Tobacco an cancer: recent epidemiol- theo kết nghiên cứu tác giả người Châu Âu quần thể người Châu Âu da trắng [12] ogical evidence J.Natl Cancer Inst, 96, 99 106 Nakachi K, Imai K, Hayashi S, Kawajiri V KẾT LUẬN Nghiên cứu xác định đa hình A4889G gen CYP1A1 nhóm ung thư phổi nhóm chứng Sự phân bố kiểu gen AA với kiểu gen AG GG đa hình A4889G gen CYP1A1 hai nhóm ung thư phổi nhóm chứng chưa có khác biệt có ý nghĩa Tuy nhiên, có khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm ung thư phổi có hút thuốc nhóm chứng Lời cảm ơn Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài nhánh cấp nhà nước “Đánh giá phân bố kiểu gen số gen liên quan đến ung thư phổi ung thư gan” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam” Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu - Bệnh viện Bạch Mai, Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Walser T, Cui X, Yanagawa J, Lee JM, Heinrich LE et al (2008) Smoking and lung cancer, Proc Am Thorac, 5, 811 - 815 Wright C M, Larsen J E, Colosimo M L, Bar J J et al (2010) Genetic association 54 K (1993) Polymorphisms of the CYP1A1 and glutathione S-transferase genes associated with susceptibility to lung cancer in relation to cicagette dose in a Japanes population Cancer Res, 53, 2994 - 2999 Hayashi S, Watanabe J, Kawajiri K (1992) Hight susceptibility to lung cancer analysed in term of combined genotypes of CYP1A1 and Mu - class glutathione S-transferase genes Jpn J cancer Res, 83, 866 - 870 Cosma G, Crofts F, Currie D et al (1993) The relationship between genotype and function of the human CYP1A1 gene J Toxicol Environ Health, 40, 309 - 316 Garte S (1998) The role of ethnicity in cancer susceptibility gene polymorphisms: the axample of CYP1A1 Carcinogenesis, 19, 1329 - 1332 Kawajiri K, Nakachi K, Imai K et al (1990) Identification of genetically high risk individuals to lung cancer by DNA polymorphisms of cytochrome P4501A1 gene FEBS let, 263, 131 - 133 Chen Z (2011) The effect of CYP1A1 polymorphisms on the risk of lung cancer: a global meta-analysis based on 71 case control studies Mutagenesis, 26, 437 - 446 10 Sheikh M Shaffi., Mohd Amin Shah., Imtiyaz Ahmad Bhat et al (2009) CYP1A1 polymorphisms and risk of lung cancer in Ethmic Kashmiri Popolation Research communication, 5, 651 - 656 TCNCYH 106 (1) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 11 Nan Song, Wen Tan, Deyin Xing, 12 Paula Mota, David Silva Moura, Dongxin Lin (2001) CYP1A1 polymorphisms and risk of lung cancer in relation to tobacco smoking: a case-control study in China Maria Graca Vale, Henriqueta Coimbra, Lina Carvalho et al (2010) CYP1A1 m1, m2 polymorphisms: genetic susceptibility to lung Carcinogenesis, 22, 11 - 16 cancer Artigo Original, 9, 89 - 98 Summary POLYMORPHISM A4889G OF CYP1A1 GENE IN LUNG CANCER PATIENTS The polymorphism A4889G of CYP1A1 gene has been shown to cause high risk factor for lung cancer in Asian subjects This study was carried out on 220 lung cancer patients compared with 200 control samples by PCR - RFLP method (PCR-Restriction fragment length polymorphism) to identify the polymorphism A4889G of CYP1A1 gene Results showed that the frequency of A and G allele in lung cancer patients were not different from that of the control group with p > 0.05; the difference between the frequencies of G genotype (AG, GG) in the lung cancer group with tobacco smoking and the frequencies of AA genotype in the control group with p < 0.05 level was statistically significant In conclusion, we initially observed the correlation between polymorphism A4889G of CYP1A1 gene with lung cancer and tobacco smoking risk in Vietnam Keywords: lung cancer, polymorphism A4889G, CYP1A1 gene TCNCYH 106 (1) - 2017 55 ... Y HỌC Xác định tính đa hình A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi người bình thư ng Đánh giá mối tương quan tính đa hình A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi người bình thư ng II ĐỐI TƯỢNG... 10 năm Ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi xác định giải phẫu bệnh; ung thư biểu mô tuyến chiếm tỉ lệ cao (51%) Xác định tính đa hình A4889G gen CYP1A1 bệnh nhân ung thư phổi người bình thư ng Sử dụng... LUẬN Nghiên cứu xác định đa hình A4889G gen CYP1A1 nhóm ung thư phổi nhóm chứng Sự phân bố kiểu gen AA với kiểu gen AG GG đa hình A4889G gen CYP1A1 hai nhóm ung thư phổi nhóm chứng chưa có khác