Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen ALDH2 trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát

So sánh giới của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam .... Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn nucleotide gen mã hóa cho enzym

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Nội - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả trong khóa luận này được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein,Trường Đại học Y Hà Nội chưa được đăng tải trên bất

cứ một tạp chí hay một công trình khoa học nào khác Các bài trích dẫn đều là những tài liệu đã được công nhận

Hà Nội, ngày 29 tháng 12năm 2016

Học viên

Trần Đức Tranh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến

PGS TSHoàng Thị Mỹ Nhung và TS Trần Huy Thịnh - người thầy đã tận tình

chỉ bảo, hướng dẫn và bổ sung các kiến thức cần thiết cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS Tạ Thành Văn - Giám đốc trung

tâm Gen và Protein, Trưởng bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội và

PGS.TS Trần Vân Khánh - Phó giám đốc trung tâm Gen và Protein trường Đại

học Y Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, các chị và các bạn học viên đã tạo điều kiện và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập kỹ thuật, hoàn thiện quy trình kỹ thuật và phân tích kết quả tại Trung tâm

Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học Tế bào, các thầy cô trong khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện và củng cố thêm rất nhiều kiến thức cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Đồng thời cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quãng thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày29 tháng 12 năm 2016 Học viên cao học khóa

Trần Đức Tranh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về ung thư gan nguyên phát 3

1.1.1 Tỷ lệ mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 4

1.1.3 Lâm sàng và cận lâm sàng của UTGNP 6

1.1.4 Điều trị và tiên lượng UTGNP 7

1.2 Hệ thống enzym ADH và ALDH và chuyển hóa rượu tại gan 7

1.2.1 Hệ thống enzym ADH và ALDH 7

1.2.2 Chuyển hóa rượu tại gan 11

1.2.3 Chuyển hóa rượu và ung thư gan 12

1.3 Sơ lược về gen ALDH2 16

1.3.1 Vị trí và liên quan 16

1.3.2 Chức năng của gen ALDH2 16

1.3.3 Tính đa hình của gen ALDH 17

1.3.4 Gen ALDH2 và bệnh ung thư 19

1.4 Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 20

1.4.1 Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP) 20

1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 28

2.3.2 Cỡ mẫu 28

2.3.3 Cách thức tiến hành 29

2.3.4 Trang thiết bị và hóa chất 31

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Đặc điểm của nhóm nghiên cứu 35

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 35

3.1.2 Đặc điểm về giới 36

3.2 Tỷ lệ kiểu gen và alen ALDH2 trong nhóm nghiên cứu 38

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 38

3.2.2 Kết quả khuếch đại vùng gen ALDH2 chứa SNP tại codon 487 40 3.2.3 Kết quả kiểu gen và alen ALDH2 41

3.3 Mối liên quan gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ khác 47

3.3.1 Gen ALDH2 và độ tuổi phát hiện bệnh UTGNP của các kiểu gen 47

3.3.2 Mối liên quan của gen ALDH2 với giới tính trong nhóm ung thư gan nguyên phát 48

3.3.3 Mối liên quan của gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu 49

3.3.4 Mối liên quan của gen ALDH2 vớí nhiễm virut HBV 50

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình của enzym ADH 8

Hình 1.2 Chuyển hóa rượu ở gan và vai trò hình thành ung thư gan 15

Hình 1.3 Vị trí của gen ALDH2 16

Hình 1.4 Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol tại gan 18

Hình 1.5 Minh họa hiện tượng đa hình đơn gen (SNP) 22

Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật PCR 23

Hình 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 39

Hình 3.2 Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP gen ALDH2 của nhóm bệnh trên agarose 1,5% .40

Hình 3.3 Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP gen ALDH2 của nhóm chứng trên agarose 1,5% 41

Hình 3.4 Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym MboII trên mẫu đối chứng 42

Hình 3.5 Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym MboII trên mẫu của bệnh nhân UTGNP 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các isoenzym ADH ở người 9

Bảng 1.2 Vị trí cắt của một số enzym giới hạn 24

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu 35

Bảng 3.2 Đặc điểm giới của nhóm nghiên cứu 36

Bảng 3.3 So sánh giới của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam 37

Bảng 3.4 Đặc điểm mắc viêm gan B và uống rượu của nhóm UTGNP 37

Bảng 3.5 Một số kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA 39

Bảng 3.6 Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 và alen của 2 nhóm 44

Bảng 3.7 Tỷ lệ kiểu gen, alen ALDH2 của 2 nhóm và nguy cơ mắc UTGNP 45 Bảng 3.8 Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 kết hợp của 2 nhóm và nguy cơ mắc UTGNP 46

Bảng 3.9 Trung vịtuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen ALDH2 47

Bảng 3.10 Gen ALDH2 và giới trong nhóm bệnh 48

Bảng 3.11 Gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu 49

Bảng 3.12 Gen ALDH2 với tình trạng nhiễm virus viêm gan B 50

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADH : Alcohol Dehydrogenase

ADH1A, ADH1B, ADH1C: Alcohol Dehydrogenase 1A,1B, 1C

ALDH : Aldehyde Dehydrogenase

bp : base pair (cặp ba-zơ)

CI : Confidence Interval (Độ tin cậy)

Nu : Nucleotide (hoặc Deoxyribonucleotide)

(Phản ứng khuyếch đại gene)

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

(Hiệntượng đa hình chiều dài của các đoạn DNA cắt bằng enzyme giới hạn)

ROS : Radioactive Oxygen Species (gốc tự doôxy hóa)

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

(Hiện tượng đa hình đơn Nucleotide)

UTBMTBG : Ung thư biểu mô tế bào gan

UTGNP : Ung thư gan nguyên phát

Bảng viết tắt các acid amin:

Glu Glutamic acid Phe Phenylalanine

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghiện rượu là một trong những nguy cơ gây ung thư gan cao Khi rượu vào

cơ thể, ethanol sẽ được chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde, đây là chất gây độc

và làm hủy hoại tế bào gan Acetaldehyde còn là chất gây ung thư do gắn với DNA tạo sản phẩm DNA “adduct” làm cho khối u phát triển [61], [38], [65], [29], [16]

Sự chuyển hoá ethanol tại gan được xúc tác bởi enzym alcohol dehydrogenase (ADH) Tiếp đó, acetaldehyde đi vào ty thể, được oxy hoá thành acetat bởi một trong những enzym aldehyde dehydrogenase (ALDH) ALDH có tác dụng oxy hóa hơn 90% acetaldehyde được tạo ra từ phản ứng chuyển hóa đầu tiên của ethanol [25], [5], [71], [24], [22]

ALDH gồm nhiều isoenzym trong đó có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm

thấy trong bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2, enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2 Gen ALDH2 là loại gen

đa hình được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn nucleotide gen mã hóa cho enzym ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [66]

Ung thư gan nguyên phát (UTGNP) là khối u sinh ra từ tế bào biểu mô gan

và tổ chức liên kết, đại đa số xuất phát từ biểu mô gan ( >90%) Hiện nay, ung thư gan là bệnh đứng hàng thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3 trong các loại ung thưtrên thế giới, ước tính khoảng 500.000 đến 1.000.000 ca mắc mới trong một năm [39] Phẫu thuật khối u, tiêm cồn hoặc tiêm hóa chất là phương pháp điều trị thông dụng hiện nay cho các bệnh nhân nhằm kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tuy nhiên chẩn đoán bệnh thường muộn, nên việc điểu trị ít hiệu quả Do vậy, xác định và kiểm soát yếu tố nguy cơ để có những biện pháp cảnh báo, chẩn đoán sớm và phòng ngừa bệnh là yếu tố then chốt góp phần không nhỏ vào chiến lược ngăn ngừa và phòng chống ung thư gan [5], [10] Ngoài nguy cơhay gặp gây UTGNP là nhiễm virut viêm gan B, C… thì yếu tố di truyền liên quan đến gen,

trong đó có ALDH2 và tình trạng sử dụng rượu kéo dài của bệnh nhân là nguy cơ

quan trọng rất cần được đi sâu tìm hiểu và nghiên cứu

Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát thuộc nhóm cao nhất thế giới, tình trạng lạm dụng rượu rất cao và khó kiểm soát [5], [4] Hiện nay, các nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình thái gen mã hóa cho enzym ALDH2 với UTGNP chưa được nghiên cứu tìm hiểu một cách đồng bộ và bài bản Chính vì vậy,

đề tài “Nghiên cứu tính đa hình đơn của gen ALDH2 trên bệnh nhân ung thư

gan nguyên phát”được thực hiện với mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của gen ALDH2 trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát

2 Khảo sát mối liên quan giữa gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ hay gặp trênbệnh nhân ung gan nguyên phát

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về ung thư gan nguyên phát

1.1.1 Tình hình mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam

Ung thư gan nguyên phát là loại ung thư phát sinh từ các tế bào trong gan và thường là chính từ tế bào gan UTGNP là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới, bệnh thường phát hiện muộn, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao, thời gian sống của người bệnh kể từ thời điểm phát hiện bệnh ngắn Theo công

bố Globocan năm 2012, trên toàn thế giới có tới 782.000 bệnh nhân mới được chẩn đoán và 746.000 người tử vong do loại ung thư này Khi xét riêng theo giới, UTGNP là loại ung thư đứng hàng thứ 5 ở nam giới và đứng hàng thứ 9 ở nữ giới

vè tỷ lệ mắc, trong đó đại đa số là ung thư biểu mô tế bào gan [39]

Tuy nhiên tỷ lệ mắc UTGNP khác nhau tùy theo từng khu vực địa lý trên thế giới Vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao tức là từ 30 trường hợp/100.000 dân/1 năm trở lên gồm khu vực Đông Á đặc biệt là Trung Quốc, Đông Nam Á và châu Phi (trừ Bắc Phi) Vùng có tỷ lệ mắc bệnh trung bình là từ 3-30 trường hợp/100000 dân/1 năm như khu vực Nam Âu, Bắc Phi, Ấn Độ, Nhật Bản.Vùng có tỷ lệ mắc bệnh thấp là <3/ trường hợp/100000 dân/1 năm bao gồm khu vực Bắc Âu, Australia, Anh quốc [39]

UTGNP có tỷ lệ mắc ở các tuổi khác nhau thì rất khác nhau và thường được phát hiện thấy ở lứa tuổi từ 50-60 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tuổi trung bình ở các nước Đông Nam Á và Châu Phi thường thấp hơn các nước khác, vàtuổi phát bệnh sớm có thể ởđộ tuổi 20 [39]

Nếu xét về sự tương quan với giới tính thì ở tất cả các thống kê, nam giới bị ung thư gan nhiều hơn nữ giới và thường gấp từ 2 đến 6lần Tỷ lệ này tăng cao hơn

ở các nước có tỷ lệ mắc bệnh cao Ở Hoa Kỳ, tỷ lệ nam/nữ khoảng3/1,4 trong khi ở các nước châu Á tỷ lệ này là 4/1,1 [62] Nguyên nhân nam giới mắc bệnh nhiều hơn

nữ giới chưa được hiểu biết đầy đủ, nhưng cũng có thể giải thích nam giới tiếp xúc nhiều yếutố nguy cơ hơn như nghiện rượu và viêm gan [39] Tại Việt Nam tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát ở nam và nữ trong nghiên cứu của Trần Văn Huy năm

2003 là 4,56/1 [3]

Tại Việt nam, theo một số nghiên cứu thì UTGNP đứng hàng thứ 3 ở nam giới và đứng hàng thứ 6 ở nữ giới trong các loại ung thư Ở bệnh viện Trung ương Huế, tác giả Trần Văn Huy (2003) đã nghiên cứu thấy UTGNP là loại ung thư phổ biến trong các loại ung thư tiêu hóa và chỉ đứng sau ung thư dạ dàyvớisố lượng bệnh nhân tăng nhanh trong vòng 10 năm tại thời điểm tác giả nghiên cứu[3] Ở các tỉnh miền Nam, UTGNP chiếm hàng đầu trong các loại ung thư ở nam giới Như vậy, Việt Nam là nước nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao, UTGNP là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam cho cả hai giới nam và nữ [39]

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ của UTGNP

- Viêm gan virus B

Đây là yếu tố được công nhận là yếu tố nguy cơ hàng đầu của UTGNP, trên thế giới ước tính có khoảng 360 triệu người bị nhiễm viêm gan B và khoảng 1/4 trong số

đó bị UTGNP Tại Việt Nam tỷ lệ mắc viêm gan B cao, theo tác giả Nguyễn Cường Thịnh công bố năm 2009, tỷ lệ viêm gan B trong nhóm UTGNP chiếm tới 70% [6]

- Viêm gan virus C

Viêm gan C là yếu tố thứ 2 sau viêm gan B Trên thế giới khoảng 170 triệu người HCV, mỗi năm tăng 3-4 triệu người mắc mới Người ta ước tính khoảng2-4% của những người nhiễm HCV mạn tính sẽ phát sinh ung thư gan Tại Việt Nam hiện

tỷ lệ mắc HCV mạn tính không cao chỉ khoảng 1-1.8% Sự đồng nhiễm HBV và HCV có thể làm tăng tỷ lệ mắc ung thư gan [5]

- Rượu

Rượu là yếu tố nguy cơ quan trọng trong UTGNP Tuy rượu không có tác dụng gây ung thư trực tiếp nhưng vai trò độc hại của việc sử dụng rượu kéo dài nhiều năm đã được chứng minh là có liên quan chặt chẽ đến nhiều loại hình ung thư [35] Uống rượu kéo dài nhiều năm sẽ gây nguy cơ xơ gan và là cơ sở chắc chắn gây UTGNP, thực tế phần lớn UTGNP phát triển trên nền gan xơ Ở California, một nghiên cứu trên những người nghiện rượu cho thấy nguy cơ UTGNP tăng lên gấp 4 lần ở người uống rượu nhiều >80g/ngày [17] Ở nghiên cứu khác trên bệnh xơ gan cho thấy nguy cơ UTGNP cao gấp 13 lần ở những người uống rượu nhiều so với

những người không uống rượu [53] Ngoài số lượng rượu uống, thì thói quen uống rượu cũng gây tăng tỷ lệ bệnh gan do rượu Người ta nhận thấy cùng lượng rượu nếu tỷ lệ sử dụng rượu vang cao thì nguy cơ mắc bệnh gan thấp hơn uống rượu bia bình thường

Mặc dù ung thư gan nguyên phát gặp ở nam giới nhiều hơn nữ giới nhưng những trường hợp phụ nữ cùng uống lượng rượu như nam giới có nguy cơ mắc bệnh về gan lại cao hơn nam giới Một số tác giả cho rằng enzym ADH ở dạ dày ở

nữ thấp hơn nam giới, nhưng điều này còn chưa có bằng chứng thuyết phục và còn được các nhà nghiên cứu đang tìm hiểu thêm Hiện nay, các giả thuyết nghiêng về estrogen làm tăng nhạy cảm với nội độc tố từ ruột và gây bệnh gan Bởi vậy ngưỡng nguy hiểm ở nam giới thường được xem là khoàng 40g/ngày còn ở phụ nữ chỉ là 20g/ngày [5], [4] Ngoài ra, nghiên cứu ở Mỹ cho thấy những người nguồn gốc Tây Ban Nha có nguy cơ mắc bệnh gan do rượu cao hơn người Mỹ da đen và da trắng Các bệnh lý phối hợp: viêm gan B, C,tình trạng rối loạn chuyển hóa, béo phì, đái tháo đường… làm tăng cảm thụ với tổn thương gan do rượu do đó làm hạ ngưỡng nguy

cơ của rượu [34], [49]

- Aflatoxin (AF)

Là một mycotoxin được tiết ra từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus,

thường được mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc ẩm ướt Độc tố từ loại nấm này làm thương tổn và thay đổi cấu trúc DNA của nhiều gen khác nhau trong đó có gen p53 làm mất kiểm soát chu kỳ phân chia tế bào dẫn đến sự hình thành và phát

1.1.3 Lâm sàng và cận lâm sàng của UTGNP

- Triệu chứng lâm sàng:

Triệu chứng cơ năng: Cảm giác đau tức hạ sườn phải, gầy sút cân, chán ăn Ngoài ra có thể gặp các triệu chứng như sốt kéo dài, vàng da, xuất huyết tiêu hóa, dấu hiệu di căn xương và các tạng xung quanh [13], [48], [52]

Triệu chứng thực thể: Gan to, tràn dịch màng bụng, có thể gặp tràn máu màng bụng, lách to, tuần hoàn bàng hệ (do tăng áp lực tĩnh mạch cửa) [13], [48], [52]

- Triệu chứng cận lâm sàng

 Xét nghiệm huyết học: Thiếu máu, tăng hoặc giảm bạch cầu

 Xét nghiệm hóa sinh:

Albumin giảm, bilirubin tăng, GOT, GPT, LDH, ALP tăng

Alpha-Fetoprotein huyết thanh:

AFP huyết thanh là một dấu ấn ung thư hữu ích giúp chẩn đoán UTGNP Hàm lượng AFP huyết thanh có liên quan chặt chẽ đến độ biệt hóa của tế bào ung thư và kích thước khối u Đối với bệnh nhân UTGNP có khối u <2 cm có biệt hóa tế bào cao thì có hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc trung bình Như vậy, vẫn còn tỷ lệ ung thư gan (khối u nhỏ) thì hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc không tăng, làm hạn chế khả năng chẩn đoán sớm ung thư gan [13], [48], [52]

 Siêu âm Siêu âm 2D: Hình ảnh một khối u giai đoạn sớm <3 cm, giai đoạn muộn có thể

10 cm, cấu trúc âm khối đặc tăng âm hoặc giảm âm (thể 1ổ), hoặc thấy nhiều khối đặc nằm rải rác phân thùy gan phải, trái (thể nhiều ổ) Trong thể lan tỏa không có hình khốithấy vùng tăng âm và giảm âm xen kẽ, giới hạn không rõ [48], [52], [26] Siêu âm Doppler: giúp nghiên cứu sự phân bố mạch trong u, khoảng 75% UTGNP thấy hình tăng mạch máu trong khối u [48], [26]

Ngoài ra, sử dụng các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh khác như chụp cắt lớp vi tính (CTscanner), chụp cộng hưởng từ (MRI)… được sử dụng để giúp xác định kích thước và vị trí khối u, và tình trạng di căn của tổ chức ung thư

 Mô bệnh học của UTGNP: Các khối u nguyên phát gan phát sinh từ thành biểu mô (90%) hoặc từ thành phần không phải biểu mô [48], [26], [1]

 Tế bào học của UTGNP: Trên tiêu bản các tế bào u tập trung thành từng đám, giải bè, có tế bào nhân trần, nhân thoái hóa, màng nhân méo mó, nhân quái, nhiều nhân [48], [26]

1.1.4 Điều trị và tiên lượng UTGNP

1.1.4.1.Điều trị

Tùy theo giai đoạn của ung thư lựa chọn các phương pháp điều trị [26], [52]

- Giai đoạn rất sớm: Phẫu thuật khối u, cắt thùy gan

- Giai đoạn sớm: Phá hủy khối u bằng tiêm ethanol qua da dưới hướng dẫn siêu âm hoặc sóng cao tần

- Giai đoạn phát triển: Nút mạch bằng hóa chất

- Giai đoạn muộn: Liệu pháp điều trị đích

- Giai đoạn cuối: Chống đau và điều trị triệu chứng

Các phương pháp điều trị [5], [26], [52]

1.1.4.2.Tiên lượng

Bệnh nhân UTGNP tiên lượng rất xấu, thường chẩn đoán giai đoạn muộn khi khối u đã xâm lấn di căn nhiều nơi Thời gian sống trung bình bệnh nhân từ khi chẩn đoán thường là 6 tháng đến 12 tháng Tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ là < 5% ở các bệnh nhân UTGNP [4], [52]

1.2 Hệ thống enzym ADH và ALDH trong mối liên quan đến chuyển hóa rƣợu

tại gan

1.2.1 Hệ thống enzym ADH và ALDH

Enzym ADH (alcohol dehydrogenase)có chức năngtham gia xúc tác cho phản ứng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde với sự thamgia của coenzym NADH Enzym ADH có cấu tạo dạng protein dimer có trọng lượng 40.000 dalton, cấu tạo trung tâm hoạt động gồm nguyên tử Zn gắn với acid amin Cystein và Histidin và vị trí gắn cofactorNAD+ và alcohol (hình 1.1)

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc không gian của enzym Alcohol dehydrogenase

ADH là enzym có nhiều biến thể khác nhau (gọi là isozyme) Dựa vào trình tự của acid amin và hoạt độ của enzym mà ADH được chia thành 5 nhóm (bảng 1.1), ADH nhóm I chuyển hóa phần lớn rượu trong cơ thể Các isozyme này là phân tử dimeric được tạo bởi các tiểu đơn vị α, β, γ(αα, αβ, γγ…) Các gen mã hóa cho các

enzym ADH này nằm trên nhiễm sắc thể số 4, trong đó có ba gen ADH1A, ADH1B, ADH1C mã hóa cho enzym nhóm I, trong đó ADH1B và ADH1C là gen đa hình

thái, và đặc trưng cho từng chủng tộc [41]

Hầu hết các mô trong cơ thể đều có enzym ADH ADH lớp I chủ yếu có ở gan ADH1A xuất hiện trong những ngày đầu của bào thai, và hoạt tính enzym này kém trong thời kỳ thai nghén và thời kỳ trưởng thành, trong khi đó ADH1B và ADH1C có tổng hoạt enzym tính mạnh nhất trong nhóm ADH4 liên quan ít đến oxy hóa ethanol, có nhiều ở gan, nhưng nồng độ thấp ở dạ dày, tụy và ruột non ADH5 có mặt mọi mô trong cơ thể, nhưng oxy hóa ethanol kém ADH6có ở gan, dạ dày, chức năng chuyển hóa ethanol hiện nay vẫn chưa biết rõ ADH7 có nhiều ở dạ dày và đường tiêu hóa trên, tham gia chuyển hóa ethanol [25], [24], [71]

Bảng 1.1 Các isoenzym ADH ở người [41]

Nhóm

Danh pháp gen

Protein

Sai khác acid amin giữa các alen

Mô Mới Cổ điển

I

ADH1B*1 ADH2*1 β1 Arg48, Arg370

Gan, Phổi

ADH1B*2 ADH2*2 β2 His48, Arg370

ADH1B*3 ADH2*3 β3 Arg48, Cys370

ADH1C*1 ADH3*1 γ1 Arg272, Ile350

Gan, Dạ dày

ADH1C*2 ADH3*2 γ2 Gln272,Val350

III ADH5 ADH5 Χ Mọi mô

IV ADH7 ADH7 σ(µ) Dạ dày

V ADH6 ADH6 Gan, Dạ dày

1.2.1.1 Đặc điểm của hệ enzyme Aldehyde Dehydrogenase (ALDH)

Ở người, có ít nhất 4 lớp ALDH isozyme đã được phát hiện là có tác dụng xúc tác phản ứng chuyển acetaldehyde thành acetate, làm loại bỏ chất độc aldehyde ảnh hưởng đến cơ thể ALDH có tác dụng oxy hóa hơn 90% acetaldehyde được tạo ra từ phản ứng chuyển hóa đầu tiên của ethanol [25], [24], [71]

Các isoenzym của ALDH có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm thấy trong

bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2, enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2 Gen ALDH1A1có kích thước khoảng 52kb nằm trên nhiễm sắc thể số 9 còn gen ALDH2 có kích thước khoảng 43 kb nằm

trên nhiễm sắc thể số 12 Cả hai gen đều có cấu trúc tương tự nhau bao gồm 13 exon Thêm vào đó, các protein tương ứng của 2 gen này có trình tự giống nhau tới

70% và cấu trúc không gian cũng tương tự nhau [64] Có lẽ, gen ALDH2 được mã

hóa bởi gen đa hình thái được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn mã hóa cho enzym ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [70], [69], [14], [19]

ALDH2*2 là do sự thay thế glutamate bằng lysine ở vị trí acid amin 504 Hậu

quả dẫn đến sự tạo thành enzyme ALDH2 gần như mất hoạt tính oxy hoá

acetaldehyde thành acetate Các nghiên cứu dịch chiết gan cho thấy alen ALDH2*2 trội so với alen ALDH2*1 (những người mang một alen ALDH2*2và một alen ALDH2*1, dạng dị hợp tử) cũng không phát hiện thấy hoạt tính của enzyme ALDH

[23] Các nghiên cứu tạo dòng các alen này trên tế bào nuôi cấy cũng thu được kết quả tương tự [55]

Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều

Tiên Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi [32], [64], [67]

Những người mang alen ALDH2*2 lượng acetaldehyde trong máu tăng từ mức

gần như không phát hiện được tới mức cao và gây nên các phản ứng bao gồm nôn nặng, buồn nôn, nhịp tim nhanh và các phản ứng như khi dùng các thuốc điều trị nghiện rượu Một số nghiên cứu đã cho thấy tác dụng bảo vệ chống tình trạng phụ

thuộc rượu khi có mặt alen ALDH2*2[15], [64]

Nghiên cứu tiến hành so sánh 2 nhóm nam giới Trung Quốc, một nhóm mang

2 alen hoạt động ALDH2*1 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1 , một nhóm mang 1 alen bất hoạt ALDH2*2 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1

Kết quả cho thấy OR của người nghiện rượu giữa 2 nhóm là 0,33 Nếu có thêm alen

ALDH2*2, người đó mang ít nhất 1 alen tăng hoạt động ADH1B*2, thì OR còn

giảm xuống 0,05

Ở người đồng hợp tử ALDH2*2, tác động của lượng nhỏ rượu cũng rất nặng nề

Điều này càng chứng tỏ enzyme ALDH2 ty thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình đào thải acetaldehyde ra khỏi cơ thể và giữ nồng độ acetaldehyde cực thấp

Tương tự như bất kỳ tác động của gen nào đối với nguy cơ bệnh tật của con

người thì tác dụng bảo vệ của alen ALDH2*2còn chịu sự chi phối của môi trường

Điều này được minh chứng bởi nghiên cứu của Higuchi và cộng sự (1994) Nghiên

cứu này được tiến hành từ năm 1979 đến năm 1992 Trong nhóm những người

nghiện rượu Nhật Bản, tỷ lệ người mang alen ALDH2*2 tăng từ 2,5% lên 13% Qua

đó cho thấy, tác dụng bảo vệ chống nghiện rượu của alen ALDH2*2 giảm dần qua thời

gian Trong trường hợp này, nguyên nhân là do sự gia tăng sử dụng rượu ở Nhật

Enzym ALDH1 cũng tham gia đào thải acetaldehyde, giúp kiểm soát nồng độ

acetaldehyde ở những người mang alen ALDH2*2 Trong một số nghiên cứu, người

ta đã nhận thấy một số tính đa hình của vùng điều hoà gen ALDH1A1ảnh hưởng tới

sự biểu hiện của gen này [42]

Mặc dù vậy, tỷ lệ của các alen này thấp và tác động tới nguy cơ nghiện rượu còn chưa sáng tỏ Một nghiên cứu cho thấy người Tây Nam California mang alen

ALDH1A1*2 có tỷ lệ phụ thuộc rượu thấp và làm giảm lượng rượu uống trong 24

giờ [17]

Ngược lại, trong cộng đồng người Úc, enzyme ALDH1 có hoạt tính không

có mối liên quan với tình trạng nghiện rượu hay phản ứng với rượu [51]

Sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu này có thể là do thực tế là các gen điều hoà hoạt động không giống nhau trong các loại tế bào Và có thể lượng enzym có hoạt tính trong máu không phản ảnh được lượng enzym trong tế bào gan

1.2.2 Chuyển hóa rượu tại gan

Khi rượu vào cơ thể, 2-8% đào thải qua mồ hôi, nước tiểu và hơi thở, 92-98% được chuyển hóa trong cơ thể Trong số đó, một lượng nhỏ rượu sẽ được chuyển hóa tại dạ dày và 92-95% từ đường tiêu hóa vào máu tới gan và được chuyển hóa tại

gan Quá trình chuyển hóa tại gan có 2 con đường là oxy hóa và không oxy hóa

Quá trình oxy hóa ethanol tại gan gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn chuyển từ ethanol thành acetaladehyde:

Có 3 loại enzym tham gia giai đoạn này

 Enzym ADH có tác dụng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, vận chuyển proton H+gắn với coenzym NAD+ thành NADH ADH hoạt động trong bào tương tế bào gan