Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan

Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch bệnh nhân ung thƣ gan Lê Lan Phƣơng Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS Trịnh Hồng Thái Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tìm hiểu biểu protein mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan thông qua điểm protein gel điện di hai chiều Nhận dạng đƣợc số protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan) đặc hiệu với kháng thể huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan Đƣa kết bà luận: tách triết Protein từ mô gan; phân tích hình ảnh gel điện di hai chiều; nhận dạng Protein phƣơng pháp Maldi-Tof MS; thẩm tách miễn dịchWestern Blot hai chiều; đặc điểm, vai trò protein biểu khác biệt Keywords: Sinh học thực nghiệm; Bệnh ung thƣ; Ung thƣ gan; Bệnh nhân; Miễn dịch Content Ung thƣ gan loại ung thƣ phổ biến giới Việt Nam, bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, nữa, tỷ lệ mắc bệnh có xu hƣớng tăng lên Hiện nay, phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh xác định thị sinh học nhƣ anpha fetoprotein “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan Tuy nhiên, xét nghiệm phát đƣợc bệnh vào giai đoạn muộn làm giảm khả sống sót bệnh nhân ung thƣ gan Nhu cầu đặt phải tìm kiếm thị sinh học giúp chẩn đoán, phát ung thƣ gan giai đoạn sớm Trong năm gần đây, nhà khoa học tập trung nghiên cứu tìm kiếm thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics Hơn nữa, nhiều nghiên cứu chứng minh protein nội bào có liên quan đến trình hình thành khối u, kích thích đáp ứng miễn dịch sinh tự kháng thể nhiều kháng nguyên ung thƣ đƣợc xác định thể bệnh nhân ung thƣ Vì thế, tự kháng thể đƣợc dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thƣ dùng phân tích proteomics để nhận dạng kháng nguyên liên quan đến khối u có khả liên quan đến chuyển dạng ác tính tế bào Đây hƣớng nghiên cứu nhằm tìm kiếm thị sinh học ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch Trong khuôn khổ luận văn này, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch bệnh nhân ung thư gan” nhằm mục đích: (a) Tìm hiểu biểu protein mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan thông qua điểm protein gel điện di hai chiều (b) Nhận dạng đƣợc số protein khác biệt đặc trƣng mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng (c) Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan) đặc hiệu với kháng thể huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan Đề tài đƣợc thực Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN Ung thƣ gan gồm hai dạng ung thƣ gan nguyên phát ung thƣ gan thứ phát (di căn) Ung thƣ gan nguyên phát ung thƣ xuất phát từ loại tế bào gan, chiếm 80% ung thƣ gan nguyên phát, vậy, phạm vi luận văn này, đề cập tới ung thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến ung thƣ tế bào biểu mô gan (Hepatocellular Carcinoma-HCC) thƣờng gọi ung thƣ gan 1.1.1 Phân loại ung thƣ gan nguyên phát Dựa vào phân loại mô bệnh học loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan nguyên phát đƣợc phân thành loại nhƣ sau: - Ung thƣ tế bào biểu mô gan dạng ung thƣ biểu mô hay gặp ung thƣ gan - Ung thƣ tế bào ống mật, dạng ung thƣ bắt đầu đƣờng mật nhỏ gan - U nguyên bào gan loại u gan ác tính trẻ em, gặp ngƣời lớn - Ung thƣ tế bào mạch loại ung thƣ gặp, bắt nguồn từ mạch máu gan gan tiếp xúc với hóa chất công nghiệp 1.1.2 Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan Mặc dù nhiều tranh cãi chế xác dẫn đến ung thƣ gan, song nghiên cứu tác nhân gây ung thƣ đa nhân tố trình tiến triển thành ung thƣ phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc Các yếu tố nguy tiến triển thành HCC bao gồm: tác nhân gây bệnh nhƣ nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus - HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; loại hóa chất nhƣ: rƣợu, aflatoxin B1, vinyl chlorid, asen rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt mô, bệnh thiếu hụt α1 - antitrypsin Tuy rằng, yếu tố nguy tác động đến tế bào gan theo đƣờng khác nhƣng cuối làm biến đổi di truyền dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ Ngoài ra, yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính chủng tộc góp phần làm tăng nguy bị ung thƣ gan 1.1.3 Các giai đoạn ung thƣ gan Căn theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993), ung thƣ gan đƣợc phân loại thông qua chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡ khối u nguyên phát tình trạng bị xâm lấn mạch máu Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thƣớc u, hạch lympho, di (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thƣ gan đƣợc phân loại thành giai đoạn, gồm: giai đoạn I (T1, N0, M0), II (T2, N0, M0), IIIA (T3, N0, M0)/B (T4, N0, M0)/C (T bất kỳ, N1, M0) giai đoạn IV (T bất kỳ, N bất kỳ, M1) 1.1.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan Hiện nay, phát HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để định lƣợng alpha fetoprotein (AFP) huyết Tuy vậy, AFP máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan nồng độ AFP tăng số trƣờng hợp khác Xét nghiệm AFP không nhạy có khoảng 15% - 30% bệnh nhân ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP không tăng, khối u gan nhỏ 3cm Hàm lƣợng AFP cao nghĩ đến ung thƣ gan nhƣng yếu tố định chắn Vì thế, để chẩn đoán ung thƣ gan cần kết hợp xét nghiệm định lƣợng AFP chẩn đoán hình ảnh siêu âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng hƣởng từ để thấy đƣợc hình dạng, kích thƣớc kết cấu khối u, nhƣng để chẩn đoán xác u lành tính hay ác tính thiết phải sinh thiết gan Tuy nhiên, sinh thiết gan dễ gây biến chứng Do đó, cần tìm kiếm thị sinh học có độ nhạy độ đặc hiệu cao để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan 1.2 NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ Chỉ thị sinh học phân tử đƣợc tìm thấy máu, loại dịch thể mô đặc trƣng cho trình sinh lý giai đoạn bệnh lý Chỉ thị sinh học đƣợc dùng để xem xét đáp ứng thể phác đồ điều trị bệnh trạng thái định Các thị ung thƣ đại phân tử xuất bệnh ung thƣ, có nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến phát sinh tăng trƣởng khối u ác tính Chỉ thị ung thƣ chất tế bào mô ung thƣ tổng hợp tiết từ khối u bị phá vỡ đƣợc tạo từ phản ứng thể khối u, gồm hai dạng: thị tế bào thị thể dịch Đối với ung thƣ gan, thị ung thƣ đƣợc ứng dụng theo hai hƣớng sau: (a) Sàng lọc nhóm nguy cao để xác định đƣợc ung thƣ kích thƣớc khối u nhỏ (< 3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu (b) Xác nhận chẩn đoán ung thƣ bệnh nhân có khối u lớn đƣợc phát nhờ chụp X quang 1.3 MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ Khi nghiên cứu ung thƣ thực nghiệm, có nhiều chứng thể có kiểm soát hệ thống miễn dịch vật chủ kháng nguyên ung thƣ, đồng thời, nghiên cứu chứng minh đƣợc có mặt kháng thể đặc hiệu ung thƣ Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thƣ, khối u xuất protein biểu bất thƣờng, bị đột biến biến đổi sau dịch mã, kháng nguyên liên quan đến ung thƣ Hiện nay, nhà khoa học tập trung theo hƣớng nghiên cứu tìm kiếm protein kháng nguyên liên quan đến khối u, protein kích thích sinh kháng thể huyết thanh, dạng thị ung thƣ tiềm Theo hƣớng nghiên cứu trên, đề tài này, kết hợp phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan thực phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm protein có biểu khác biệt, đặc biệt protein kháng nguyên phản ứng miễn dịch với kháng thể huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan, protein có tiềm trở thành thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Mẫu nghiên cứu mô gan vị trí có khối u bệnh nhân HCC huyết tƣơng bệnh nhân Mẫu đối chứng mô gan cách 5cm gan vị trí khối u Trong nghiên cứu này, sử dụng trạng thiết bị, hóa chất, dụng cụ Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc Phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc mô tả hình dƣới đây: Hình Quy trình chiết protein từ mô gan Hình Quy trình phân tích proteomics mô gan Hình Quy trình thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN Sử dụng dung dịch PBS pH7,4 đệm phá tế bào (Lysis) thu đƣợc phân đoạn dịch chiết protein mô gan Hình ảnh điện di cho thấy phân đoạn có độ khác nhau, song chứa nhiều protein thể qua số lƣợng băng protein giếng nhiều, trải dọc theo giếng điện di Các phân đoạn dịch chiết chƣa đƣợc tủa để loại thành phần phi protein, phân đoạn dịch chiết đƣợc trộn lại với thành dịch chiết protein mô gan tiến hành điện di hai chiều A Dịch chiết mô gan bình thƣờng B Dịch chiết mô gan ung thƣ Hình Điện di kiểm tra phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng mô gan ung thƣ gel polyacrylamide 10% có SDS (Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1; Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3) 3.2 PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU 3.2.1 Phân tách hệ protein mô gan gel diện di hai chiều Trƣớc tiên, protein mô gan đƣợc phân tách theo pI strip dài 17cm, pH 3-10 điện di chiều để phân tách theo khối lƣợng phân tử gel polyacrylamide 10% có SDS Hình ảnh gel 2DE mô gan bình thƣờng mô gan ung thƣ cho thấy, protein đƣợc phân tách tƣơng ứng với spot gel Tuy hệ protein mô gan phức tạp, song hàm lƣợng protien gan đồng đều, đó, protein đƣợc phân tách tốt gel 2-DE Số lƣợng spot lớn, kích thƣớc đồng đều, song phần lớn spot tập trung vùng cuả gel Do đó, tiếp tục tiến hành diện di, phân tách protein khoảng pH hẹp A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ Hình Phân tách protein mô gan bệnh nhân 8460 gel điện di hai chiều Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng IPG strip dài 17cm, pH - 10 (A1 B1); IPG strip dài 7cm, pH - (A2 B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 10% Bƣớc đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh gel điện di hai chiều - Phoretix, xác định đƣợc tổng số spot đƣợc phân tách gel 2-DE (bảng 5) Bảng Tổng số spot gel điện di hai chiều Mã bệnh Bản gel 17cm Bản gel 7cm nhân Mô bình thường Mô ung thư Mô bình thường Mô ung thư 8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot 8460 329 spot 288 spot 139 spot 123 spot 8935 258 spot 291 spot 53 spot 61 spot 8977 229 spot 254 spot 72 spot 91 spot 9242 275 spot 334 spot 108 spot 155 spot 10480 220 spot 268 spot 145 spot 141 spot 3.2.2 Phân tích biểu protein gel điện di hai chiều Tiếp tục sử dụng phần mềm phoretix để phân tích biểu spot protein gel điện di Phần mềm giúp xác định spot tƣơng ứng cặp gel bệnh nhân, đƣa giá trị cƣờng độ khối trung bình spot (các spot tƣơng ứng có giá trị chênh lệch từ đến 1,5 lần đƣợc tính khác biệt) Ngoài ra, phần mềm đƣa hình ảnh ba chiều (3-D) spot, đó: độ lớn spot đƣợc thể bề rộng đáy spot hình 3-D; độ đậm spot đƣợc thể chiều cao spot tính từ đáy lên đỉnh; độ sắc nét spot nhuộm màu coomasie đƣợc thể độ nhọn spot hình ảnh 3-D Đây tiêu chí để đánh giá biểu khác biệt spot cặp gel gồm: spot tăng giảm gel mô ung thƣ so với gel mô BT; Spot xuất rõ rệt hai gel Khi phân tích độc lập cặp gel, xác định đƣợc spot protein biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng cặp gel 2-DE phân tách protein khoảng pH - 10, dài 17cm (bảng 6) phân tách protein khoảng pH - 7, dài 7cm (bảng 7) Bảng Thống kê spot biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng bệnh nhân gel 2-DE 17cm, pH - 10 8261 8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 31 16 51 23 21 39 ↓ 19 33 20 22 27 21 - 11 4 + Tổng 59 64 80 52 51 69 Bảng Thống kê spot biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng bệnh nhân gel 2-DE 7cm, pH - 8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 17 18 11 16 ↓ 10 - 1 + 2 Tổng 21 23 32 20 27 Ghi chú: Spot protein biểu tăng (↑); spot protein biểu giảm (↓) gel mẫu ung thƣ so với gel mô bình thƣờng; spot thấy xuất rõ rệt gel mẫu ung thƣ (+); xuất mờ nhạt không thấy gel mẫu mô ung thƣ (-) Thống kê spot protein biểu khác biệt gel mô gan ung thƣ so với gel mô gan bình thƣờng bệnh nhân HCC, nhận thấy có 52 spot khác biệt rõ ràng, xuất gel mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng, bao gồm: spot thấy xuất rõ rệt gel mô ung thƣ; spot thấy xuất rõ rệt gel mô đối chứng; 23 spot biểu tăng gel mô ung thƣ; 18 spot biểu giảm gel mô ung thƣ Khi so sánh hình ảnh gel điện di thu đƣợc nghiên cứu với hình ảnh gel mô gan ngƣời sở liệu SWISS-2D-PAGE, nhận dạng đƣợc 13 protein tƣơng ứng với 13 spot biểu khác biệt gel mô gan ung thƣ so với gel mô gan bình thƣờng (bảng 8) Bảng Danh sách protein biểu khác biệt gel mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa sở liệu EMBL STT Protein Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease inhibitor) (A1AT) Yếu tố Cƣờng độ khối nhận dạng trung bình Biểu protein ĐC HCC P01009 0,0015 0,608 + Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓ Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − − Beta-actin, cytoplasmic (ACTB) P60709 0,003 4,599 + Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 + Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 + P04406 0,248 − − P07339 0,0007 0,124 + P30084 0,0005 0,129 + P04179 2,730 0,315 ↓ 10 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH/G3P) Cathepsin D (CATD) Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial (ECHM) Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial (SODM) 11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓ 12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓ P00367 0,686 − − 13 Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial (GDH/ DHE3) Ghi chú: ↑, protein biểu tăng; ↓, protein biểu giảm; -, protein không biểu mẫu bệnh; +, protein không biểu mẫu mô bình thƣờng; ĐC, gel mô gan bình thƣờng; HCC, gel mô gan ung thƣ 3.3 NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS Sau phân tích hình ảnh gel 2-DE, spot protein biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc cắt thủy phân, thu đƣợc hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ Mỗi protein cho kết tập hợp liệu khối lƣợng peptide khác sau bị phân cắt enzyme trypsin Protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp PMF (Peptide mass fingerprint), khối lƣợng peptide đƣợc tạo sau thủy phân đƣợc so sánh với sở liệu NCBInr, sử dụng phần mềm Mascot thông qua webside www.matrixscience.com Danh sách protein xác định theo phƣơng pháp đƣợc trình bày bảng Bảng Danh sách protein đƣợc xác định MALDI-TOF MS từ gel mô gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng bệnh nhân HCC Yếu tố nhận dạng protein KLPT (Dalton) pI Q8TDW4 37.024 8,42 12 73 ↑ P30101 28.483 5,49 20 71 ↑ P05091 54.394 5,7 19 88 ↓ 15 71 ↓ Q9UKL0 47.762 8,23 12 74 ↑ P15104 42.745 6,43 14 69 ↑ O14776 9.408 9,69 54 85 ↑ P04792 22.826 5,98 24 66 ↓ O50C Transcription Factor Ca150 Heat shock protein beta-1 (HSPB1/HSP27) Heat shock protein 27 34 89 ↓ P71B Apolipoprotein L2 Q9BQE5 45.887 8,79 14 74 ↑ P57D MHC class I antigen BAT2 protein (Protein PRRC2A) Bromodomain and PHD finger containing (Protein Peregrin) Immunoglobulin G heavy chain variable region Mitochondrial 3-oxoacylCoA thiolase (3-ketoacylCoA thiolase) Q95460 9600 11,26 30 73 ↓ P48634 17.081 9,94 25 88 ↑ P55201 59.536 8,66 13 71 ↑ AEX28843 13.503 8,62 59 69 ↑ P42765 42.469 8,51 23 69 ↑ Spot C43C C56B C52C N80A C256B P130B P193B P221B O167B O244B O67B O301B Tên protein Suppressor of tumorigenicity proteinlike (ST7L) Protein disulfide-isomerase A3 (Erp57/ PDIA3) Human Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenase REST corepressor (Protein CoREST) Glutamine synthetase (GS) % Biểu phù Score hợp O113A AAC50263 28.889 9,6 20 67 − O95782 106.378 7,75 89 ↑ AAG27483 10.414 5,43 56 84 ↑ Q8WVV9 49.517 9,01 14 66 − A6NIW5 15.243 5,82 33 68 ↑ O285B Zinc finger protein AP-2 complex subunit alpha-1 Metastasis related protein Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like Peroxiredoxin O8D Heat shock protein 60 P10809 61.346 5,7 15 81 ↑ O241B T cell receptor alpha chain AAK37512 13.640 7,88 40 66 ↑ P24001 15.127 4,8 23 70 ↑ P06733 47.481 7,01 18 69 ↑ P30086 21.027 7,42 41 78 ↓ O14948 22.696 9,67 17 71 ↑ O137B O286B O46D N24B Interleukin-32 Chain A, Crystal Structure N97B Of Human Enolase (Alpha-enolase) Neuropolypeptide h3 N296A (Phosphatidylethanolaminebinding protein 1) TFEC protein N35B (Transcription factor EC) Microfibrillar-associated N139C protein (MFAP3) P46D LOC643854 protein O75121 34.362 4,9 15 68 ↓ AAI01323 61.880 5,45 74 ↑ P228A TPA protein Q6LBF5 13.392 7,85 24 72 ↓ P229A Unnamed protein product BAC04847 32.496 8,51 14 70 ↓ P10C Protein FAM180A Q6UWF9 19.834 8,59 16 68 ↓ P15C hCG1989686 Uncharacterized protein C12orf45 COMM domain containing EAX08132 11.676 9,55 32 68 ↓ Q8N5I9 20.168 5,1 20 69 ↓ Q5T8Z0 18.286 6,14 20 83 ↓ Q86XP7 4.086 10,54 80 71 ↑ G6DPS4 35.150 8,11 15 68 ↑ O218B GDDM protein Interphase cyctoplasmic foci protein 45 variant IFT172 protein A5PKZ0 60.583 5,66 11 68 ↑ O243B KIAA1179 protein Q9UG01 142.340 5,51 67 ↑ N244A hCG2041492 EAW97522 15.331 5,31 36 66 ↓ P14A P48A C55D C151A Ghi chú: ↑, protein biểu tăng; ↓, protein biểu giảm; -, protein không biểu mẫu bệnh; +, protein không biểu mẫu mô bình thƣờng Sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF MS, nhận dạng đƣợc 39 spot protein, có 27 spot tƣơng ứng với 25 protein đƣợc định danh 12 protein giả thuyết Tóm lại, kết hợp kỹ thuật MALDI-TOF MS tra cứu liệu, nhận dạng đƣợc 38 protein tổng số 52 spot protein biểu khác biêt gel mô gan bệnh nhân HCC 3.4 THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU Song song với việc phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan, tiến hành thực phản ứng western blot 2D Trong nghiên cứu này, sử dụng Kit ECL Advance Western Blotting Detection kit có độ nhạy cao tín hiệu phát quang phản ứng oxy hóa Luminol mạnh Do đó, để giảm liên kết không đặc hiệu tín hiệu nhiễu màng cần tối ƣu nồng độ kháng thể bậc ủ màng với dung dịch huyết tƣơng bệnh nhân HCC A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ Hình Kết phản ứng Western Blot mẫu mô gan bệnh nhân 8977 Dựa vào vị trí tƣơng ứng spot phát sáng màng PVDF với spot gel 2-DE dài 7cm kết định danh protein, xác định đƣợc protein mô gan bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể huyết tƣơng bệnh nhân là: protein ST7L biểu tăng protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu giảm mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng 3.5 ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN CÓ PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH Những điểm protein khác biệt, kể protein biểu tăng/giảm mô gan bệnh nhân ung thƣ gan đặc trƣng bệnh protein thị ung thƣ Kết hợp xác định protein MALDI-TOF MS tra cứu sở liệu, nhận dạng đƣợc 38 protein biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng Để tìm hiểu mối liên quan protein với ung thƣ, tìm kiếm sở liệu protein, từ xác định đƣợc chức protein mô tả sơ lƣợc, phân nhóm protein nhƣ bảng 10 hình 14 Bảng Tóm tắt chức protein biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan đối chứng đƣơc nhận dạng Ptotein Chức Protein liên quan đến chu trình tế bào, tăng sinh tế bào apoptosis: protein Protein ST7L Ức chế phát triển khối u Metastasis related protein Protein liên quan đến trình di Protein Neuropolypeptide h3 Ức chế hoạt động protein Raf Protein p53 Protein ức chế khối u, điều hòa tăng sinh tế bào, kiểm soát chu trình tế bào apoptosis Proliferating cell nuclear antigen Tăng sinh tế bào, điều khiển chép DNA, sửa chữa DNA (PCNA) Protein liên quan đến trình miễn dịch bảo vệ thể: 11 protein Protein sốc nhiệt beta-1 Đáp ứng lại stress, nhiễm virus, kích thích sản xuất (HSPB1/HSP27) interleukin-1 HSP60 Tƣơng tác vật chủ - virus, hoạt hóa tế bào T, kích thích tế bào B sản xuất cytokine, than gia cuộn gấp protein Kháng nguyên MHC lớp I Trình diện kháng nguyên nội sinh Interleukin-32 Tham gia đáp ứng miễn dịch, kích thích sinh IL-8, yếu tố hoại tử mô (TNFA) Immunoglobulin G heavy chain Cấu tạo phân tử Ig variable region T cell receptor alpha chain Tham gia nhận dạng kháng nguyên Peroxiredoxin Chống lại stress oxy hóa Alpha-1-antitrypsin Ức chế protease nhóm serine, tham gia trình đông máu Haptoglobin Liên kết với Hemoglobin Superoxide dismutase [Cu-Zn] Phá hủy gốc tự bảo vệ thể Superoxide dismutase [Mn] Phá hủy gốc tự bảo vệ thể Protein tham gia cấu trúc tế bào: protein Beta-actin (ACTB) Cấu trúc tế bào Microfibrillar-associated protein Liên quan đến microfibri, tham gia cấu tạo tế bào (MFAP3) Protein tham gia trình trao đổi chất: 10 protein Aldehyde Dehydrogenase Chuyển hóa rƣợu, phân giải ethanol Enoyl-CoA hydratase Trao đổi lipid Glutamine synthetase (GS) Chuyển hóa glutamate, dẫn truyền thần kinh (có liên quan đến trình tăng sinh tế bào) Glutamate dehydrogenase Truyền xung thần kinh Apolipoprotein L2 Chuyển hóa vận chuyển lipid 3-ketoacyl-CoA thiolase Chuyển hóa lipid acid béo UMP-CMP kinase (KYC) Chuyển gốc phosphate từ ATP sang UMP CMP, tổng hợp Pyrimidin Glyceraldehyde-3-phosphate Tham gia trình đƣờng phân, vận chuyển chất qua dehydrogenase (G3P) màng tế bào AP-2 complex subunit alpha-1 Vận chuyển protein Cathepsin D (CATD) Proteinase nội bào Protein tham gia vào trình phiên mã, dịch mã, cải biến: 10 protein Protein PDIA3 Tái xếp liên kết S-S Protien PDIA1 Phá vỡ tái tạo liên kết S-S Yếu tố phiên mã Ca150 Điều hòa phiên mã Yếu tố phiên mã EC Điều hòa phiên mã BAT2 protein (Protein PRRC2A) Tham gia ghép nối tiền mARN Protein Peregrin Điều hòa phiên mã gene RUNX1, RUNX2, tham gia acetyl hóa Histone H3 Zinc finger protein Gắn với DNA vị trí liên kết với yếu tố phiên mã Heterogeneous nuclear Chế biến mARN (cắt nối luân phiên) ribonucleoprotein L-like REST corepressor Tham gia phiên mã điều hòa phiên mã, tƣơng tác virus - (Protein CoREST) vật chủ Alpha-enolase Glycosyl hóa, hoạt hóa plasminogen, điều hòa phiên mã Căn vào chức protein, protein có biểu khác biệt mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc nhóm thành nhóm khác dựa vào trình sinh học mà protein tham gia Tỷ lệ protein thuộc nhóm không đồng (hình 14), đó, protein tham gia vào trình trình miễn dịch bảo vệ thể chiếm tỷ lệ cao (~ 29%) protein tham gia cấu trúc tế bào chiếm tỷ lệ thấp (~5%) Hình Tỷ lệ nhóm protein tham gia vào trình sinh học khác Trong nghiên cứu này, nhận dạng đƣợc protein mô gan bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể huyết tƣơng bệnh nhân là: protein ST7L biểu tăng protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu giảm mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng Các protein đƣợc tiếp tục tìm hiểu sâu chức mối liên hệ chúng với tình trạng ung thƣ 3.5.1 Protein ST7L Protein ST7L protein thuộc nhóm liên quan đến chu trình tế bào Gene ST7L tƣơng đồng với gene ức chế khối u vùng q31 NST số Protein tham gia trình điều hòa âm tính sinh trƣởng tế bào, trƣờng hợp này, có vai trò ức chế phát triển khối u Kết nghiên cứu cho thấy protein biểu tăng mô ung thƣ, điều do: protein tăng nhƣng bị biến đổi cấu trúc nên k thực đƣợc chức bị thể nhận “lạ” sinh đáp ứng miễn dịch; giai đoạn này, ng bệnh giai đoạn phục hồi, nên có phản ứng để kìm hãm phát triển khối u Đây protein lần đƣợc phát nghiên cứu chƣa tìm thấy nghiên cứu HCC đề cập tới protein 3.5.2 Protein MHC lớp I Các phân tử MHC lớp I tham gia trình diện kháng nguyên nội sinh: tế bào mang virus hay tế bào ung thƣ, kháng nguyên VR, kháng nguyên ung thƣ kháng nguyên nội sinh đƣợc vi thể proteasome phân căt, chế biến tạo thành peptide kháng nguyên Các peptide kháng nguyên đƣợc TAP vận chuyển đến lƣới nội chất liên kết với phân tử MHC I; phức hệ MHCI-peptide kháng nguyên đƣợc đóng gói đƣa bề mặt tế bào, trình diện cho thụ thể TCD8 tế bào T, kích thích tế bào T tiết lymphokin giết chết tế bào Các phân tử MHCI biểu giảm, kháng nguyên nội sinh ko dc trình diện, gây ảnh hƣởng đến trình đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 3.5.3 Protein sốc nhiệt HSP27 HSP27 biểu khác giai đoạn biệt hóa sinh trƣởng tế bào, phân tử đa chức HSP27 hoạt động nhƣ phân tử chaperone đảm bảo cho protein hoàn thiện cấu trúc phù hợp với chức nó: protein liên kết với ubiquitin, đồng thời vận chuyển protein già đến “thùng rác” tế bào Tƣơng tác với actin tránh phá hủy actin giúp ổn định cấu trúc tế bào Tham gia trình diện kháng nguyên, kích hoạt proteasome phân cắt kháng nguyên nội sinh, đồng thời kích thích sản sinh IL-1: hoạt hóa đại thực bào, tế bào T, khỏi động phản ứng viêm Biểu bất thƣờng HSP27 đƣợc phát ung thƣ ruột kết ung thƣ tuyến tiền liệt Protein biểu giảm gây ảnh hƣởng tới nhiều hoạt động chức gan giúp tế bào ung thƣ thoát khỏi apoptosis Kết tƣơng đồng với kết nghiên cứu Li & đn (2005); Wong & đn (2006); Yao & đn (2007) 3.5.4 Protein aldehyde dehydrogenase ALDH thuộc họ enzym tham gia phản ứng oxy hóa khử, tham gia trình chuyển hóa ethanol gan truyền điện tử (H+) ALDH bị suy giảm chức làm tăng chất hoạt động hóa học mạnh, gốc tự đƣợc cảm ứng aldehyde Enzym tham gia vào trình giải độc gan, enzym biểu giảm: hệ trình tiến triển thành ung thƣ gây suy giảm chức gan; thiếu hụt enzym dẫn tới tình trạng gan nhiễm độc, từ bị biến đổi thành tế bào ung thƣ KẾT LUẬN Bƣớc đầu phân tích proteomics miễn dịch bệnh nhân ung thƣ gan, rút số kết luận sau: Đã phân tách đƣợc protein mô gan gel 2-DE xác định đƣợc spot protein biểu khác biệt mô gan ung thƣ mô gan bình thƣờng bệnh nhân ung thƣ gan Trong có 52 spot khác biệt chung bệnh nhân gồm: 23 spot biểu tăng, 18 spot biểu giảm, spot xuất gel mô ung thƣ, spot không xuất gel mô ung thƣ 3 Đã nhận dạng đƣợc 52 spot tƣơng ứng với 38 protein đƣợc định danh 12 protein giả thuyết Các protein đƣợc chia thành nhóm chức năng, bao gồm: nhóm protein liên quan đến chu trình tế bào apoptosis; protein liên quan đến trình miễn dịch bảo vệ thể; protein tham gia cấu trúc tế bào; protein tham gia trình trao đổi chất protein tham gia vào trình phiên mã, dịch mã cải biến sau phiên mã, dịch mã Sử dụng kit ECL Advance Western Blotting Detection , xác đinh ̣ đƣơ ̣c t ỷ lệ pha loãng tố i ƣu kháng th ể bậc mô ̣t thẩm tách miễn dịch thành công cặp gel điện di chiều bệnh nhân ung thƣ gan xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch là : protein ST7L biểu tăng protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu giảm mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng KIẾN NGHỊ Trải qua nghiên cứu thực tế, đƣa số kiến nghị sau: Tiếp tục nhận dạng spot protein biểu khác biệt mô ung thƣ so với mô gan thƣờng kết hợp với kết phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều số lƣợng bệnh nhân lớn nhằm tìm protein có tính kháng nguyên đặc trƣng cho ung thƣ gan Tiếp tục thu thập mẫu phân tích proteomics miễn dịch mô gan bệnh nhân ung thƣ gan giai đoạn ung thƣ khác nhằm phân tích biến đổi thành phần protein liên quan đến bệnh Thu thập mẫu huyết tƣơng bệnh nhân viêm gan B C tiến triển thành ung thƣ gan bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử nhiễm HBV HCV nhằm tìm hiểu mối liên hệ viêm gan B , C ung thƣ gan các đố i tƣơ ̣ng bê ̣nh nhân ung t hƣ gan ở Viê ̣t Nam References Tiếng Việt Phan Văn Chi (2006), PROTEOMICS Khoa học hệ protein, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Phan Văn Chi (2009), “Thực trạng nghiên cứu Proteomics”, Hội thảo VNProteomics lần 1, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ 3 Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học sở, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội Hoàng Văn Sơn (2009), “Proteomics lâm sàng”, Hội thảo VNProteomics lần 1, Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ Hoàng Văn Sơn (2011), “Các tố ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt Nam, 348, 5-11 Bùi Phƣơng Thảo, Lê Lan Phƣơng, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích protein biểu khác biệt mô gan bệnh nhân ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt Nam, 348, 67-71 Trƣờng Đại học Y Hà Nội (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh American Cancer Society (2012), Cancer Facts & Figures, National Health Council Bradford M M (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical Biochemistry, 72, 248-254 10 Chen Y (2007), “Identification of tumor-associated antigens as markers for immunodiagnosis of human cancers”, ETD Collection for University of Texas, El Paso, Paper AAI3262904 11 Chen Y., Zhou Y., Qiu S., Wang K., Liu S., Peng X.X., Li J., Tan E.M., Zhang J.Y (2010), “Autoantibodies to tumor-associated antigens combined with abnormal alpha-fetoprotein enhance immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma”, Cancer Letters, 289(1), 32-39 12 Diamandis E.P (2004), “Identification of serum amyloid A protein as a potentially useful biomarker for nasopharyngeal carcinoma”, Clinical Cancer Research, 10, 5293-5294 13 Farazi P.A., Depinho R.A (2006), “Hepatocellular carcinoma pathogenses: from genes to evironment”, Nature Reviews Cancer, 6, 674-687 14 Farombi E.O (2006), “Aflatoxin contamination of foods in developing countries: Implications for hepatocellular carcinoma and chemopreventive strategies”, African Journal of Biotechnology, 5(1), 001-014 15 Govekar R and Zingde S.M (2007), “Cancer Proteomics: How far are we from the Clinics? ”, International Journal of Human Genetics, 7(1), 91-97 16 He Q.Y., Lau G.K.K., Zhou Y., Yuen S.T., Lin M.C., Kung H.F and Chiu J.F (2003), “Serum biomarkers of hepatitis B virus infected liver inflammation: A proteomic study”, Proteomics, 3(5), 666-674 17 Jain K.K (2002), “Role of proteomics in diagnosis of cancer”, Technology in Cancer Research and Treatment, 1(4), 281-286 18 Jemal A., Bray F., Center M M., Ferlay J., Ward E., Forman D., (2011), “Global Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 61, 69-90 19 Kim W., Lim S.O., Kim J.S., Ryu Y.H., Byeon J.Y., Kim H.J., Kim Y.L., Heo J.S., Park Y.M., and Jung G (2003), “Comparison of Proteome between Hepatitis B virus-and Hepatitis C virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clinical Cancer Research, 9, 5493-5500 20 Le L.P., Pham A.T., Trinh H.T (2010), “Proteomics analysis of human hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of Science, Natural Science and Technology, 26(1), 85-90 21 Li C., Tan Y.X., Zhou H., Ding S.J., Li S.J., Ma D.J., Man X.B., Hong Y., Zhang L., Li L., Xia Q.C., Wu J.R., Wang H.Y., Zeng R (2005), “Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential tumor markers”, Proteomics, 5(4), 1125-1139 22 Li L., Chen S.H., Yu C.H., Li Y.M and Wang S.Q (2008), “Identification of Hepatocellular-Carcinoma-Associated Antigens and Autoantibodies by Serological Proteome Analysis Combined with Protein Microarray”, Journal of Proteome Research, 7(2), 611-620 23 Liebler D.C (2002), Introduction to proteomics, Human Press, Totowa, New Jersey 24 Liu W., Peng B., Lu Y., Xu W., Qian W., Zhang J.Y (2011), “Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis”, Autoimmunity Reviews, 10(6), 331-335 25 Long J., Lang Z.W., Wang H.G., Wang T.L., Wang B.E (2010), “Glutamine synthetase as an early marker for hepatocellular carcinoma based on proteomic analysis of resected small hepatocellular carcinomas”, Hepatobiliary Pacreat Diseases International, 9(3), 296-305 26 Looi K.S., Nakayasu E.S., Diaz R.A., Tan E.M., Almeida I.C., Zhang J.Y (2008), “Using Proteomic Approach to Identify Tumor-Associated Antigens as Markers in Hepatocellular Carcinoma”, Journal of Proteome Research, 7(9), 4004-4012 27 Lu H., Goodell V., Disis M.L (2008), “Humoral immunity directed against tumor-associated antigens as potential biomarkers for the early diagnosis of cancer”, Journal of Proteome Research, 7(4), 1388-1394 28 Martin K., Ricciardelli C., Hoffmann P., K.Oehker M., (2011), “Exploring the Immunoproteome for Ovarian Cancer Biomarker Discovery”, International Journal of Molecular Sciences, 12, 410-28 29 Mendy M., Walton R (2009), “Molecular pathogenesis and early detection of Hepatocellular perspectives from West Africa”, Cancer Letters; 286(1), 44-51 30 Polanski M., Anderson N.L (2006), “A list of candidate cancer biomarkers for targeted proteomics”, Biomark Insights, 1, 1-48 31 Qin L.X., Tang Z.Y (2002), “The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma”, World Journal of Gastroenterology, 8(3), 385-392 32 Rubin P., Hansen J.T (2008), TNM Staging Atlas, Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer Business, Bogota, Colombia 33 Takashima M., Kuramitsu Y., Yokoyama Y., Iizuka N., Harada T., Fujimoto M., Sakaida I., Okita K., Oka M., (2006), “Proteomic analysis of autonantibides in patients with hepatocellular carcinoma”, Proteomics, 6(13), 3894-3900 34 Tan H., Low J., Lim S.G., Chung M.C (2009), “Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection”, FEBS journal, 276(23), 6880-6904 35 Tjalsma H., Schaeps R.M., Swinkels D.W (2008), “Immunoproteomics: From biomarker discovery to diagnostic applications”, Proteomics Clinical Appllications, 2(2), 167-180 36 Tran T.T., Le L.P, Trinh H.T (2011), “Analysis of differentially expressed proteins of plasma in hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of Science, Natural Science and Technology, 27(2), 279-284 37 Westermeier R., Naven T (2002), Proteomics in Practice, Wiley-VCH Verlag-GmbH, Freiburg 38 Wong C.H., Chan S.K.P., Chan H.L.Y., Tsui S.K.W (2006), “The Molecular Diagnosis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clinical Laboratory Sciences, 43(1), 69-101 39 Yao D.F., Dong Z.Z., Yao M (2007), “Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 6(3), 241-247 40 (2007), Zhang J.Y., Megliorino R., Peng X.X., Tan E.M., Chen Y., Chan E.K “Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma”, Journal of Hepatology, 46(1), 107114 Công cụ World Wide Web 41 http://benhvienk.com/index.php/vi/pcut/tin-tuc-phong-chong-ung-thu/677- dau-hieu-cua-benh-ung-thu-gan (5/6/2012) 42 http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/type/liver-cancer/about/types-of- primary-liver-cancer (14/02/2012) 43 http://expasy.org/swiss-2dpage/viewer (5/6/2012) 44 http://igrid-ext.cryst.bbk.ac.uk/WWW/PhD_thesis.htm (10/06/2012) 45 http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/adult-primary- liver/HealthProfessional/page3 (14/02/2012) 52 46 http://www.cancer.gov/dictionary?cdrid=45618 (15/03/2012) 47 http://www.hupo.org/research/hlpp/ (25/04/2012) 48 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54879 (10/06/2012) 49 http://www.mayoclinic.com/health/medical/IM04073 (30/03/2012) 50 http://www.medicinenet.com/liver_biopsy/article.htm (15/03/2012) 51 http://www.uniprot.org/ (05/06/2012) www.matrixscience.com (05/06/2012)