XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LƯU THỊ KHÁNH HỒNG Niên khóa: 2005 – 2009 Tháng 08/2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực TS.BS PHẠM HÙNG VÂN LƯU THỊ KHÁNH HỒNG Tháng 08/2009 LỜI CẢM ƠN Con xin chân thành cám ơn ba mẹ anh chị người thân gia đình ln ủng hộ, động viên bên Con vô biết ơn TS.BS Phạm Hùng Vân, người thầy ln tận tình dạy dỗ truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho Con chân thành cám ơn bác Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, người thầy người bác bên cho lời khuyên hữu ích Em xin cám ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, thầy cô anh chị Bộ môn Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt đề tài Anh Võ Đức Xuyên An, chị Hoàng Hiếu Ngọc anh chị phịng RD phịng QC Cơng ty TNHH Thương mại Dịch vụ Nam Khoa tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian qua Cuối xin cám ơn tập thể lớp DH05SH chia sẻ suốt năm qua Sinh viên thực Lưu Thị Khánh Hồng iii TÓM TẮT Đề tài “ Xác định genotype G kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ gene VP7 Rotavirus có phân trẻ em bị tiêu chảy cấp nhập viện bệnh viện Nhi Đồng I”, thực từ tháng 02 đến tháng 07/ 2009 phòng Nghiên cứu Phát triển Công ty TNHH Thương mại Dịch vụ Sản xuất Nam Khoa Hiện nay, tình hình trẻ em bị tiêu chảy tồn giới nói chung Việt Nam nói riêng cao, nhiều tác nhân gây chủ yếu tác nhân Rotavirus, đa phần nhóm A (gene VP7 xác định genotype G nịi thuộc nhóm A) Rotavirus khơng gây nên bệnh tiêu chảy trẻ em mà gây bệnh lý dày ruột, gây nhiễm trùng đường tiêu hóa nghiêm trọng có khả gây tử vong cho trẻ Các biện pháp thông thường rửa tay sẽ, vệ sinh môi trường, bú sữa mẹ ngăn ngừa hữu hiệu việc trẻ em bị tiêu chảy nhiễm Rotavirus, Tổ chức Y tế giới khuyến cáo nên phòng ngừa Rotavirus vaccine cho trẻ Vì vậy, sở chúng tơi tiến hành xác định genotype G nhóm A Rotavirus mặt nhằm giúp cho việc phịng bệnh chẩn đốn bệnh tốt hơn, mặt khác dùng để kiểm tra chất lượng vaccine tiền đề cho việc chế tạo vaccine sau Sau tiến hành đề tài, chúng tơi có kết sau: Xác định mẫu nhiễm Rotavirus phương pháp phát nhanh phương pháp PCR vịng ngồi (phản ứng PCR với mix A1 – A4) Khuếch đại toàn đoạn gene VP7 Rotavirus Xác định genotype G Rotavirus nhiễm phân trẻ em kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại từ đoạn gene VP7 iv SUMMARY The thesis “Determine the genotype G by direct sequencing the PCR product amplified from the VP7 gene of rotavirus existed in the fecal samples collected from children with acute diarrhea hospitalized in Nhi Dong I Hospital” was carried out from 02/2009 to 07/2009 at Research and Development Department, Nam Khoa Co Ltd At the present, the state of diarrhea of children is critical in the world as well as Viet Nam This state is caused by many factors; but Rotavirus A is the most common and the gene VP7 determines the genotype G of the strain’s Rotavirus A Rotavirus cause not only diarrhea in children but also gastroenteritis, digestive tract infection The most serious effect of Rotavirus A in human leads to children’s death Due to that the precautionary measures such as washing hands , environmental sanitation as well as breast milk don’t make sense, World Health Organization encourages everybody to protect their children from Rotavirus by injecting them with vaccine To deal with this issue, we have carried out this thesis in order to make a progress in preventing and diagnosing this disease, on the other hand, it uses for controlling the quality vaccine and produce vaccine in the future After researching, we have got the following results: Determine the infection Rotavirus by quick-test and reaction PCR with mix A1 – A4 To amplify the gene VP7 Determine the genotype G of Rotavirus in the fecal samples from children by direct sequencing the PCR product amplified from the gene VP7 v MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt viii Danh sách bảng ix Danh sách hình x Chương Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Nội dung thực Chương Tổng quan tài liệu 2.1 Tiêu chảy cấp tác nhân 2.2 Tác nhân Rotavirus 2.3 Các phương pháp phát 2.4 Các type Rotavirus 2.5 Các vấn đề kỹ thuật 2.5.1 Phương pháp tách biệt RNA 2.5.2 Kỹ thuật PCR 2.5.2.1 Sơ lược phương pháp PCR 2.5.2.2 Nguyên tắc PCR 2.5.3 Kỹ thuật giải trình tự 10 2.5.3.1 Phương pháp hóa học 10 2.5.3.2 Phương pháp emzyme 11 2.5.3.3 Giải trình tự máy tự động 13 Chương Vật liệu phương pháp 17 vi 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.2 Vật liệu 17 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 3.2.2 Thiết bị dụng cụ hóa chất 17 3.2.2.1 Thiết bị dụng cụ 17 3.2.2.2 Hóa chất 17 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phương pháp phát nhanh Rotavirus 18 3.3.2 Tách biệt RNA toàn phần 18 3.3.3 Điện di RNA sau ly trích 20 3.3.4 Phiên mã ngược RNA 20 3.3.5 Thực phản ứng PCR 21 3.3.6 Kỹ thuật giải trình tự 22 Chương Kết thảo luận 26 4.1 Tỉ lệ nhiễm Rotavirus 26 4.2 Kết sản phẩm PCR 27 4.3 Kết quà phản ứng PCR với mix A2 – A4 27 4.4 Kết giải trình tự 29 Chương Kết luận đề nghị 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 34 Tài liệu tham khảo 35 Phụ lục vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  bp: base - pair  cDNA: complementary Deoxyribonucleotide Acid  EDTA: Etylen Diamino Tetra Acetic  dNTP: deoxynucleotide triphosphate  ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate  DNA: Desoxyribonucleic acid  dsRNA: double – stranded RNA  kDa: Kilo Dalton  M: mol/ lít  NPV: Negative Predict Value  PCR: Polymerase Chain Reaction  PPV: Positive Predict Value  RNA: Ribonucleic acid  RPM: Revolutions per minute  Se: Sensitivity  Sp: Specificity  TBE: Tris – borate EDTA  TE: Tris - EDTA  tRNA: Transfer ribonucleic acid  Tm: Temperature melting viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Bảng thành phần kit NKRNAPREP 19 Bàng 3.2 Bảng thành phần mix A1 – A4 21 Bảng 3.3 Bảng thành phần mix A2 – A4 21 Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 21 Bảng 3.5 Bảng thành phần mix chạy sequencing 25 Bảng 3.6 Chu kỳ nhiệt sequencing 25 Bảng 4.1 Kết mẫu nhiễm Rotavirus 26 Bảng 4.2 Kết mẫu nhiễm chạy PCR mix A1 – A4 27 Bảng 4.3 Kết mẫu nhiễm chạy PCR mix A2 – A4 27 Bảng 4.4 Bảng độ nhạy độ đặc hiệu, PPV NPV 28 Bảng 4.5 Bảng kết xác định genotype G mẫu chạy PCR 31 Bảng 4.6 Bảng kết xác định genotype G mẫu chạy PCR tổ 32 Bảng 4.7 Bảng so sánh kết giải trình tự 32 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1 Rotavirus quan sát kính hiển vi Hình 2.2 Vị trí protein cấu trúc Hình 2.3 Dải điện di RNA Rotavirus Hình 2.4 Các mạch đơn DNA có đầu đánh dấu 32P 11 Hình 2.5 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA 12 Hình 2.6 Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự 14 Hình 2.7 Phương pháp giải trình tự với ddNTP 15 Hình 2.8 Máy ABI3130XL Applied Biosystem 16 Hình 3.1 Sơ đồ thực phương pháp phát nhanh Rotavirus 18 Hình 3.3 Các bước tinh DNA 23 Hình 4.1 Kết điện di dịch ly trích RNA 26 Hình 4.2 Kết điện di mẫu chạy PCR với mix A1 – A4 27 Hình 4.3 Kết điện di mẫu chạy PCR tổ 27 Hình 4.4 Cây sinh dịng genotype G Rotavirus 33 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ q trình tách biệt RNA tồn phần 19 Sơ đồ 3.4 Các bước tiến hành điện di chip 24 x PHỤ LỤC Bảng Danh sách mẫu STT (1) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 CODE BỆNH NHÂN (2) 10/09/2008-113120/09 08/09/2008-138879/09 01/11/2006-115087/09 02/01/2008-9822-09 01/06/2008-411736/08 29/11/2007-119747/09 24/12/2005-309691/07 17/08/2006-349076/06 08/12/2006-139730/07 25/11/2008-113851/09 03/04/2009-1189799 15/10/2008-116958/09 18/09/2008-52767/09 12/01/2007-121411/09 02/08/2008-108584/09 141284/09 08/04/2008-118045/09 03/08/2008-118066/09 2008-137981/09 13/02/2008-96621/08 24/03/2007-459418/08 10/11/2007-130135/09 11/07/2008-13568/09 26/06/2008-268461/08 2008-31951/09 06/09/2008-127634/09 24/12/2007-109240/09 11/06/2008-116656/09 25/12/2007-233886/08 17/09/2008-133903/09 01/04/2009-KHOA 32 TIEU HOA 33 25/02/2009-107372/09 34 13/01/2008-137640/09 CODE (3) HỌ VÀ TÊN (4) 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 NGUYỄN ANH KIỆT PHÙNG NHẬT PHÚC NGUYỄN QUỐC THIỆN NGUYỄN NGỌC TRÀ MY ĐỖ YẾN NGỌC NGUYỄN KIM NGÂN NGUYỄN TUẤN KIỆT TRẦN ANH THƯ ĐINH KIM NGỌC NGUYỄN VĂN TRƯỜNG CHUA KEBMKEL NGUYỄN QUỐC ĐẠT TRƯƠNG ĐỨC NHẬT HUỲNH THỊ PHƯƠNG THẢO NGUYỄN ANH THƯ PHAN VĂN HOÀNG THÔNG NGUYỄN LÊ HUY BẢO NGUYỄN QUANG HUY NGUYỄN THỊ MINH THƯ NGUYỄN PHỤNG HOÀNG TRẦN TẤN PHÁT PHẠM THỊ THANH LAM NGUYỄN PHI HÙNG NGUYỄN THANH HOA SEN NGÔ CHÍ HÀO TRẦN THỊ TUYẾT NHUNG LUI THUẬN TÂY LÊ CÁT TƯỜNG TRẦN QUANG HUY HỒ HOÀI AN PHẠM ĐĂNG KHÔI 321 VŨ NGỌC THANH THẢO HUỲNH NGUYỄN NHƯ NGỌC PHẠM BÁ THANH 322 323 Bảng (tt) Danh sách mẫu (1) 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 (2) 2008-98785/09 2006-122190/09 01/12/2008-116671/09 22/02/2007-115437/09 03/11/2008-130449/09 22/09/2007-109330/09 10/09/2008-107623/09 141210/09 13/10/2007-83617/09 01/01/2008-106473/09 2007-120891/09 28/10/2008-119077/09 21/04/2008-123694/09 08/06/2008-433203/08 02/09/2008-124102/09 11/02/2008-124173/09 16/08/2008-135090/09 19/10/2005-110442/09 2008/117092/09 21/08/2008-120797/09 15/08/2007-370167/08 13/12/2007-113308/09 20/10/2007-109655/09 05/04/2008-135982/09 13/09/2008-331515/08 138594/09 26/10/2007-115942/09 08/10/2007-384410/08 2008-115699/09 27/10/2008-456902/08 17/05/2007-108307/09 03/08/2007-258613/07 18/09/2008-373852/08 06/03/2008-124400/09 28/01/2008-122249/09 19/01/2008-119942/09 21/01/2008-106311/09 (3) 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 (4) NGUYỄN HẢI BẮC ĐỖ THỊ PHƯƠNG VY LÂM THIÊN PHÚ NGUYỄN TẤN HƯNG LÊ VĂN MẠNH TRẦN LINH CHI BÙI PHÙNG KHÁNH HUY NGUYỄN THỊ NGỌC GIÀU CHÂU NGỌC THẢO LÂM NGỌC TRÂM NGUYỄN PHÚC NGUYÊN NGÔ VĂN NGHĨA NGUYỄN TÂN TIẾN TRẦN ANH KHOA NGUYỄN THỊ THÙY TRANG PHẠM HOÀNG ANH TOÀN VÕ QUỐC THẮNG NGUYỄN LÊ HÙNG LÊ THỊ NGỌC HUYỀN NGUYỄN KHÁNH AN HỒNG QUỐC TUẤN ĐỖ NGƠ KHÁNH LINH NGUYỄN MINH QUÂN PHẠM HUỲNH NGUYỄN VY ĐÀM NGỌC CẨM TIÊN NHAN TRUNG HIẾU NÔNG NGÔ CAO QUYỀN LÊ BẢO NGỌC PHẠM GIA HUY DƯƠNG HỒNG PHÚC NGUYỄN VĂN ĐIỆN TRẦN VĂN VŨ ĐOÀN THỊ TRÂM LÂM THIÊN PHÚC TRẦN ĐẠT PHONG PHAN THỊ KIM NGÂN NGUYỄN NGỌC HÂN THANG QUỐC ĐẠT Hình Hình điện di dịch ly trích RNA mẫu Hình Hình điện di dịch ly trích RNA mẫu Hình Hình điện di dịch ly trích RNA mẫu Hình Hình điện di dịch ly trích RNA mẫu Hình Hình điện di dịch ly trích RNA mẫu Hình Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A1 – A4 Hình Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A1 – A4 Hình Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A1 – A4 Hình Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A1 – A4 Hình 10 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A1 – A4 Hình 11 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A1 – A4 Hình 12 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A2 – A4 Hình 13 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A2 – A4 Hình 14 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A2 – A4 Hình 15 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A2 – A4 Hình 16 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A2 – A4 Hình 17 Hình điện di sản phẩm khuếch đại với mix A2 – A4 Hình 18 Hình điện di chip mẫu sau tinh (purify) Bảng Danh sách mẫu kết kèm STT (1) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 CODE (2) 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 RNA (3) A1 – A4 (4) (+) (+) A2 –A4 (5) TEST (6) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) Bảng (tt) Danh sách mẫu kết kèm (1) 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 TỔNG (+) (2) 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 (3) (+) (+) 72 (4) (+) (5) (+) (+) (6) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) 41 30 47 44 (+) (+) (+) (+) (+) (+) Hình 19 Search mẫu 291 phần mềm BioEdit Hình 20 Search mẫu 297 phần mềm BioEdit Hình 21 Search mẫu 297 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Hình 22 Search mẫu 297 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Hình 23 Search mẫu 297 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Hình 24 Search mẫu 297 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ... hành thực đề t? ?i: ? ?Xác định genotype G kỹ thuật gi? ?i trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đ? ?i từ gene VP7 Rotavirus có phân trẻ em bị tiêu chảy cấp nhập viện bệnh viện Nhi Đồng I? ?? 1.2 Mục đích... CGTAAGGCCACdG CGTAAGGCCACGTdA CGTAAGGdC CGTAAGGCCACGTA TdG CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACGdT CGTAAGGCCACGTAdT ? ?i? ??n di gel mao quản *CGTAAGGCCACGTA TdG *CGTAAGGCCACGTAdT *CGTAAGGCCACGTdA *CGTAAGGCCACGdT *CGTAAGGCCACdG... GAATACGCAAACGTTAGGAATAGGTTGTCAAACAACAAATGTAGACTCGTTTGAAATGGT TGCTGAAAATGAGAAACTAGCTATAGTGGATGTCGTTGATGGGATAAATCATAAAATAA ATTTGACAACTACGACATGTACTATTCGAAATTGTAAGAAGTTAGGTCCAAGAGAGAATG TAGCTGTAATACAAGTTGGTGGCTCTAATGTGTTAGACATAACAGCAGATCCAACGACTA