XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH

TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: LƯU THỊ KHÁNH HỒNG Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH GENOTYPE G BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH

TỰ TRỰC TIẾP SẢN PHẨM PCR KHUẾCH ĐẠI TỪ GENE VP7 CỦA ROTAVIRUS CÓ TRONG PHÂN TRẺ EM BỊ TIÊU CHẢY CẤP NHẬP VIỆN TẠI BỆNH VIỆN NHI ĐỒNG I

Tháng 08/2009

Anh Võ Đức Xuyên An, chị Hoàng Hiếu Ngọc cùng các anh chị trong phòng RD và phòng QC của Công ty TNHH Thương mại và Dịch vụ Nam Khoa đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi xin cám ơn tập thể lớp DH05SH luôn chia sẻ cùng tôi trong suốt 4 năm qua

Sinh viên thực hiện

Lưu Thị Khánh Hồng

TÓM TẮT

Đề tài “ Xác định genotype G bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR

khuếch đại từ gene VP7 của Rotavirus có trong phân trẻ em bị tiêu chảy cấp nhập viện tại bệnh viện Nhi Đồng I”, được thực hiện từ tháng 02 đến tháng 07/ 2009 tại phòng

Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Thương mại Dịch vụ và Sản xuất Nam Khoa

Hiện nay, tình hình trẻ em bị tiêu chảy trên toàn thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng là rất cao, do nhiều tác nhân gây ra nhưng chủ yếu là do tác nhân Rotavirus, đa phần là nhóm A (gene VP7 xác định genotype G của những nòi thuộc nhóm A) Rotavirus không chỉ gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em mà còn gây ra những bệnh lý dạ dày ruột, gây nhiễm trùng đường tiêu hóa và nghiêm trọng hơn là có khả năng gây tử vong cho trẻ Các biện pháp thông thường như rửa tay sạch sẽ, vệ sinh môi trường, bú sữa mẹ vẫn không thể ngăn ngừa hữu hiệu việc trẻ em bị tiêu chảy do nhiễm Rotavirus, vì thế Tổ chức Y tế thế giới đã khuyến cáo nên phòng ngừa Rotavirus bằng vaccine cho trẻ Vì vậy, trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành xác định genotype G nhóm

A của Rotavirus một mặt nhằm giúp cho việc phòng bệnh và chẩn đoán bệnh được tốt hơn, mặt khác dùng để kiểm tra chất lượng vaccine cũng như tiền đề cho việc chế tạo vaccine sau này Sau khi tiến hành đề tài, chúng tôi có được những kết quả sau:

1 Xác định được mẫu nhiễm Rotavirus bằng phương pháp phát hiện nhanh và phương pháp PCR vòng ngoài (phản ứng PCR với mix A1 – A4)

2 Khuếch đại toàn bộ đoạn gene VP7 của Rotavirus

3 Xác định genotype G của Rotavirus nhiễm trong phân của trẻ em bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại từ đoạn gene VP7

SUMMARY

The thesis “Determine the genotype G by direct sequencing the PCR product

amplified from the VP7 gene of rotavirus existed in the fecal samples collected from children with acute diarrhea hospitalized in Nhi Dong I Hospital” was carried out

from 02/2009 to 07/2009 at Research and Development Department, Nam Khoa Co Ltd

At the present, the state of diarrhea of children is critical in the world as well as Viet Nam This state is caused by many factors; but Rotavirus A is the most common and the gene VP7 determines the genotype G of the strain’s Rotavirus A Rotavirus cause not only diarrhea in children but also gastroenteritis, digestive tract infection The most serious effect of Rotavirus A in human leads to children’s death Due to that the precautionary measures such as washing hands , environmental sanitation as well as breast milk don’t make sense, World Health Organization encourages everybody to protect their children from Rotavirus by injecting them with vaccine To deal with this issue, we have carried out this thesis in order to make a progress in preventing and diagnosing this disease, on the other hand, it uses for controlling the quality vaccine and produce vaccine in the future After researching, we have got the following results:

1 Determine the infection Rotavirus by quick-test and reaction PCR with mix A1 – A4

2 To amplify the gene VP7

3 Determine the genotype G of Rotavirus in the fecal samples from children by direct sequencing the PCR product amplified from the gene VP7

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các bảng ix

Danh sách các hình x

Chương 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích về yêu cầu đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tiêu chảy cấp và tác nhân 3

2.2 Tác nhân Rotavirus 5

2.3 Các phương pháp phát hiện 6

2.4 Các type Rotavirus 8

2.5 Các vấn đề kỹ thuật 8

2.5.1 Phương pháp tách biệt RNA 8

2.5.2 Kỹ thuật PCR 8

2.5.2.1 Sơ lược về phương pháp PCR 8

2.5.2.2 Nguyên tắc PCR 9

2.5.3 Kỹ thuật giải trình tự 10

2.5.3.1 Phương pháp hóa học 10

2.5.3.2 Phương pháp emzyme 11

2.5.3.3 Giải trình tự bằng máy tự động 13

Chương 3 Vật liệu và phương pháp 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Vật liệu 17

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.2.2 Thiết bị dụng cụ và hóa chất 17

3.2.2.1 Thiết bị dụng cụ 17

3.2.2.2 Hóa chất 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Phương pháp phát hiện nhanh Rotavirus 18

3.3.2 Tách biệt RNA toàn phần 18

3.3.3 Điện di RNA sau khi ly trích 20

3.3.4 Phiên mã ngược RNA 20

3.3.5 Thực hiện phản ứng PCR 21

3.3.6 Kỹ thuật giải trình tự 22

Chương 4 Kết quả và thảo luận 26

4.1 Tỉ lệ nhiễm Rotavirus 26

4.2 Kết quả của sản phẩm PCR 27

4.3 Kết quà của phản ứng PCR với mix A2 – A4 27

4.4 Kết quả giải trình tự 29

Chương 5 Kết luận và đề nghị 34

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề nghị 34

Tài liệu tham khảo 35 Phụ lục

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

 bp: base - pair

 cDNA: complementary Deoxyribonucleotide Acid

 EDTA: Etylen Diamino Tetra Acetic

 dNTP: deoxynucleotide triphosphate

 ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate

 DNA: Desoxyribonucleic acid

 dsRNA: double – stranded RNA

 kDa: Kilo Dalton

 M: mol/ lít

 NPV: Negative Predict Value

 PCR: Polymerase Chain Reaction

 PPV: Positive Predict Value

 RNA: Ribonucleic acid

 RPM: Revolutions per minute

 Se: Sensitivity

 Sp: Specificity

 TBE: Tris – borate EDTA

 TE: Tris - EDTA

 tRNA: Transfer ribonucleic acid

 Tm: Temperature melting

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Bảng thành phần bộ kit NKRNAPREP 19

Bàng 3.2 Bảng thành phần mix A1 – A4 21

Bảng 3.3 Bảng thành phần mix A2 – A4 21

Bảng 3.4 Chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR 21

Bảng 3.5 Bảng thành phần mix chạy sequencing 25

Bảng 3.6 Chu kỳ nhiệt của sequencing 25

Bảng 4.1 Kết quả mẫu nhiễm Rotavirus 26

Bảng 4.2 Kết quả mẫu nhiễm khi chạy PCR mix A1 – A4 27

Bảng 4.3 Kết quả mẫu nhiễm khi chạy PCR mix A2 – A4 27

Bảng 4.4 Bảng độ nhạy và độ đặc hiệu, PPV và NPV 28

Bảng 4.5 Bảng kết quả xác định genotype G của các mẫu chạy PCR 31

Bảng 4.6 Bảng kết quả xác định genotype G của các mẫu chạy PCR tổ 32

Bảng 4.7 Bảng so sánh kết quả giải trình tự 32

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Rotavirus được quan sát dưới kính hiển vi 5

Hình 2.2 Vị trí của các protein cấu trúc 6

Hình 2.3 Dải điện di RNA của Rotavirus 7

Hình 2.4 Các mạch đơn DNA có đầu đánh dấu 32P 11

Hình 2.5 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA 12

Hình 2.6 Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự 14

Hình 2.7 Phương pháp giải trình tự với ddNTP 15

Hình 2.8 Máy ABI3130XL của Applied Biosystem 16

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện phương pháp phát hiện nhanh Rotavirus 18

Hình 3.3 Các bước tinh sạch DNA 23

Hình 4.1 Kết quả điện di dịch ly trích RNA 26

Hình 4.2 Kết quả điện di mẫu chạy PCR với mix A1 – A4 27

Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu chạy PCR tổ 27

Hình 4.4 Cây sinh dòng của genotype G của Rotavirus 33

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ quá trình tách biệt RNA toàn phần 19

Sơ đồ 3.4 Các bước tiến hành điện di chip 24

Tại các quốc gia có khí hậu nhiệt đới như trong vùng Ấn Độ, châu Phi, Đông Nam châu Á, trong đó có Việt Nam, ước tính hằng năm có đến gần 900.000 trường hợp tử vong do Rotavirus gây ra Bệnh không có tính chất theo tháng rõ rệt, và hầu như trẻ em dưới 5 tuổi thì đều bị ít nhất một lần tiêu chảy do nhiễm Rotavirus, nếu so sánh với các nguyên nhân khác thì Rotavirus là tác nhân thường gặp nhất chiếm đến

56 – 76 % ca tiêu chảy ở trẻ em trong các bệnh viện Đặc biệt đa số trường hợp bị tử vong do nhiễm Rotavirus xảy ra chủ yếu ở những nước đang phát triển, lý do chính là

cơ thể bị mất quá nhiều nước và chất điện giải Nghiêm trọng hơn là bệnh lại tập trung cao ở những trẻ nhỏ từ 6 – 24 tháng tuổi gây nên những triệu chứng như ói mửa, sốt cao, đau bụng, viêm đường hô hấp trên Tại Việt Nam mãi đến năm 1980 mới phát hiện được Rotavirus là căn nguyên gây tiêu chảy và viêm dạ dày ruột cấp cho trẻ em, đặc biệt tiêu chảy vào mùa hè và thu đông, chiếm khoảng ¼ (khoảng 27 %) trong số tác nhân gây tiêu chảy Vì vậy, việc phát hiện các chủng Rotavirus trong các mẫu bệnh phẩm là hết sức cần thiết nhằm giúp cho việc phòng ngừa và chẩn đoán cũng như điều trị Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định genotype G bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khuếch đại từ gene VP7 của Rotavirus có trong phân trẻ em bị tiêu chảy cấp nhập viện tại bệnh viện Nhi Đồng I”

1.2 Mục đích và yêu cầu đề tài

1.3 Nội dung thực hiện

 Thử nghiệm trên những mẫu phân đã xác định rõ bệnh tiêu chảy để phát hiện Rotavirus bằng phương pháp PCR dùng mồi đặc hiệu cho type G

 Giải trình tự đoạn gene VP7 trực tiếp từ sản phẩm khuếch đại

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tiêu chảy cấp và tác nhân tiêu chảy cấp

 Định nghĩa: tiêu chảy thường được định nghĩa là đi cầu phân lỏng hoặc tóe nước trên 3 lần trong 24 giờ Phân lỏng là phân không thành khuôn

 Ba hội chứng lâm sàng khác nhau của tiêu chảy, thể hiện ba cơ chế sinh bệnh khác nhau, đòi hỏi các biện pháp điều trị khác nhau:

– Tiêu chảy phân lỏng cấp tính: tiêu chảy kéo dài không quá 14 ngày (thường dưới 7 ngày), phân lỏng hoặc tóe nước, không thấy máu Tiêu chảy phân lỏng cấp tính gây mất nước, bệnh nhân có thể bị sốt, nôn và có thể bị suy dinh dưỡng

– Hội chứng lỵ: đây là bệnh tiêu chảy thấy có máu trong phân Tác hại chính của

lỵ là gây cho bệnh nhân chán ăn, sụt cân nhanh, niêm mạc bị tổn thương do sự xâm nhập của vi khuẩn

– Tiêu chảy kéo dài: là bệnh tiêu chảy kéo dài bất thường (ít nhất là 14 ngày) Bệnh nhân thường bị sút cân rõ rệt, suy dinh dưỡng, tổn thương hệ miễn dịch

 Dịch tễ học của bệnh tiêu chảy

– Sự lây lan các mầm bệnh tiêu chảy: các tác nhân gây tiêu chảy thường truyền bằng đường phân – miệng, thông qua thức ăn hoặc nước uống ô nhiễm, hay tiếp xúc trực tiếp với phân đã nhiễm khuẩn… và một số tập quán xấu như không rửa tay sau khi đi ngoài, trước khi chế biến thức ăn, để trẻ bò chơi ở vùng dơ bẩn có dính phân người hay gia súc

– Những tập quán làm tăng nguy cơ tiêu chảy: không nuôi con hoàn toàn bằng sữa mẹ trong 4 – 6 tháng đầu, tập quán cai sữa quá sớm trước 1 tuổi, để thức ăn đã nấu ngoài nhiệt độ phòng, dùng nước không đảm bảo độ an toàn, không xử lý phân đặc biệt là phân trẻ em một cách hợp vệ sinh

– Tuy nhiên, các yếu tố của cơ thể trẻ cũng làm tăng tính mắc bệnh tiêu chảy, như trẻ bị suy dinh dưỡng, trẻ đang bị bệnh sởi hoặc suy giảm miễn dịch

– Tính chất theo mùa: có sự khác biệt theo mùa rất rõ rệch, ở những vùng ôn đới tiêu chảy do vi khuẩn thường xảy ra vào mùa nóng, còn tiêu chảy do virus đặc biệt

là Rotavirus lại xảy ra cao vào mùa đông Còn những vùng nhiệt đới, tiêu chảy do

 Tác nhân gây tiêu chảy: có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến tình trạng tiêu chảy ở trẻ em, thông thường là do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng hay do uống thuốc và do rối loạn đường ruột

 Tác nhân vi khuẩn

– Staphylococcus aureus (S.aureus), Clotridium perfringens, Bacillus cereus,

Shigella, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus

– Salmonella, đặc biệt gây sốt thương hàn khi bị nhiễm Salmonella typhi

– Escherichia coli (E.coli) – thường bị nhiễm trong thịt chưa nấu chín, các nước

trái cây chưa qua diệt khuẩn theo phương pháp Pasteur, các nem chua, rau cải

– Vibrio cholerae – gây bệnh tả, thường gặp ở các nước đang phát triển

– Entamoeba histolytica – được lan truyền qua đường nước, thực phẩm đã bị dính

phân người hay có thể do trực tiếp tiếp xúc qua tay dơ bẩn kể cả quan hệ tình dục

– Cryptosporidium – có thể lan truyền qua thực phẩm, đặc biệt là các loại rau trộn

(salad) được trồng bằng phân bón.Và ký sinh trùng có khả năng sống được trong nước nên nguồn nước cũng có thể là nguồn lây lan ký sinh trùng này

 Tác nhân thuốc men

Năm 1973, Ruth Bishop đã phát hiện ra Rotavirus nhờ quan sát dưới kính hiển

vi điện tử mẫu sinh thiết tá tràng của trẻ em bị tiêu chảy cấp Với những nghiên cứu về hình thái học, các nhà khoa học đã xác định Rotavirus thuộc họ Reoviridae Và virus này được được đặt tên là Rotavirus là do quan sát dưới kính hiển vi điện tử virus có hình khối cầu, đường kính trung bình 65 – 75 nm, đường kính nhân virus từ 37 – 40

nm, các capsome của lớp trong xếp theo hình nan hoa và kéo nối với các capsome ở lớp bên ngoài tạo nên hình vòng như bánh xe, Rota tiếng Latinh có nghĩa là bánh xe

Rotavirus bao gồm có 7 loài: A, B, C, D, E, F và G; trong đó thì loài A, B, C là gây bệnh trên người nhưng 90 % là do Rotavirus A, và tất cả 7 loài trên đều gây bệnh trên động vật

Hình 2.1 Rotavirus được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

(http://www.afbini.gov.uk/em_11-2.jpg)

Cấu trúc nhân của Rotavirus là RNA gồm 2 sợi với 11 đoạn dsRNA, có tổng kích thước là 18,555 bp và trọng lượng phân tử của mỗi đoạn từ 20 – 125 kDa Mỗi đoạn này là một gene và được đánh số từ 1 – 11 theo nguyên tắc là giảm dần kích thước từ 3302 – 667 bp Hạt rotavirion có cấu trúc 3 lớp protein capsid, phức tạp và

không có màng bao bọc 11 dsRNA này sẽ mã hóa cho sáu loại protein cấu trúc là VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7 và sáu protein phi cấu trúc là NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 và NSP6

Hình 2.2 Vị trí của các protein cấu trúc trên vỏ capsid

(http://education.expasy.org/images/Rotavirus_maturation.jpg)

Việc xử lý nước hay đồ vật bị nhiễm Rotavirus là rất đơn giản, chúng ta có thể

xử lý bằng EDTA hay một số hóa chất tẩy uế, tuy nhiên nếu xử lý bằng Clo thì sẽ không hiệu quả Rotavirus có khả năng tồn tại trong phân lâu hơn trong nước, điều đáng chú ý là nếu phân được giữ ở nhiệt độ bình thường thì Rotavirus nhiễm trong phân sẽ có khả năng truyền bệnh trong thời gian dài từ vài ngày đến vài tuần Ngoài ra, Rotavirus còn bị tiêu diệt ở pH<3 hay pH>10 Formaldehyde có tác dụng ức chế hoạt động của Rotavirus trong khi đó các chất sát trùng ngoài da như Sodium hypochloride, chlorhexidine glutamate và providane-iodine không có tác dụng đối với Rotavirus

2.3 Các phương pháp phát hiện tác nhân Rotavirus

Với những hậu quả để lại khi bị bệnh tiêu chảy do Rotavirus đồng thời tránh việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách vô ích hay giảm chi phí điều trị cũng như giảm sự nhập viện không cần thiết nên việc chẩn đoán tác nhân Rotavirus cần thực hiện nhanh chóng

Cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật cũng như trong lĩnh vực sinh học thì việc phát hiện Rotavirus là rất đơn giản Những kỹ thuật dùng để chẩn đoán Rotavirus:

 Quan sát hình thái và cấu trúc Rotavirus dưới kính hiển vi điện tử

 Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang

 Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

 Phản ứng kết hợp bổ thể

 Thử nghiệm ELISA

 Kỹ thuật ly trích và điện di RNA

 Kỹ thuật ngưng kết trên hạt Latex

Kỹ thuật ly trích và điện di RNA cũng cho kết quả chính xác lại rẻ tiền, đơn giản

và nhanh hơn Như đã giới thiệu ở trên, nhân của Rotavirus là 2 sợi RNA bao gồm 11 đoạn kép hợp thành, vì vậy sau khi ly trích từ bệnh phẩm, đem điện di trên gel thì sẽ cho thấy sự sắp xếp một cách đặc thù của 11 đoạn này do chúng có kích thước hoàn toàn khác nhau

Hình 2.3 Dải điện di RNA của Rotavirus

(http://www.reoviridae.org/dsRNA_virus_proteins/images/04rotavirusfigure.jpg)

2.4 Các type Rotavirus và ý nghĩa của việc phát hiện type

Rotavirus gồm có 7 loài A – G, trong đó loài A là tác nhân gây bệnh chính trên người, do đó chúng tôi chỉ đề cập đến các type của loài A

Loài Rotavirus A có hệ thống phân loại kép, dựa trên protein ở lớp vỏ capsid ngoài cùng, đó chính là VP4 quy định cho type P còn VP7 thì quy định cho type G Các nghiên cứu đã cho thấy có 14 serotype G, 14 genotype G và 14 serotype P, 26 genotype P,nhưng chỉ có 5 sự kết hợp giữa P và G đó là P[8] với G1, G3, G4 và G9;

P[4] với G2, đó cũng chính là các type gây bệnh phổ biến trên toàn thế giới và tùy theo mỗi vùng mà có type gây bệnh khác nhau

Trên cơ sở đó, việc phát hiện chính xác các type gây bệnh là việc làm hết sức cần thiết và quan trọng vì sẽ giúp cho việc chẩn đoán được chính xác hơn và việc điều trị sẽ tốt hơn Ngoài ra, việc xác định các type còn giúp cho việc tạo vaccine trong việc phòng ngừa bệnh tiêu chảy do tác nhân Rotavirus

2.5 Các vấn đề kỹ thuật có liên quan trong nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp tách biệt RNA toàn phần

Phương pháp dựa trên phương pháp do CHOMCZYNSKI và SACCHI sáng chế Nguyên tắc là dùng Guanidine 14M và ure, phối hợp với phenol và các chất tẩy khác để làm các chất gây biến tính các protein, kết quả là các protein trong mẫu thử sẽ

bị vón lại, DNA sẽ tan trong phase phenol, còn RNA thì nằm lại trong phase nước và

sẽ được tách ra khỏi phase phenol nhờ thêm vào chloroform và quay ly tâm lắng tách RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol với sự hỗ trợ của tRNA

và glycogen

Phương pháp tách chiết thô RNA toàn phần áp dụng cho hầu hết các mẫu thử, các mục đích sử dụng vì đây là phương pháp rất hiệu quả cho tất cả các loại RNA từ virus, vi khuẩn, nấm men cho đến dịch tế bào có nhân Do vậy, mẫu thử có thể là các canh cấy tế bào có nhân hay mô nghiền, vi khuẩn hay virus trong các dịch sinh học như máu, huyết thanh, huyết tương và các dịch khác (TS.BS Phạm Hùng Vân, 2009)

2.5.2 Kỹ thuật PCR

2.5.2.1 Sơ lược về phương pháp PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 được sử dụng

rộng rãi nhất Thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện

của tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng tứ 10 μl đến 50 μl với các thành phần chủ yếu là:

 Enzyme polymerase chịu nhiệt, thường được dùng hiện nay là Taq polymerase

(được tách triết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus), có hoạt tính tối

đa ở 720C và bền với nhiệt độ, xúc tác sự tổng hợp suốt quá trình phản ứng

 Bốn loại dNTP là Adenine, Thymine, Guanine và Cytosine (dATP, dTTP,dGTP

 Ion Mg++ trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp

 Dung dịch đệm Tris-KCl để làm dung môi thích hợp cho phản ứng

Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ chu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler), mà chúng ta thường gọi là máy PCR, chương trình nhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ, nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra (TS.BS Phạm Hùng Vân, 2009)

2.5.2.2 Nguyên tắc của PCR

Về nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn sau:

 Bước 1: Giai đoạn biến tính

Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 940C (nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, ở nhiệt độ này thì các liên kết hydro của mạch đôi DNA

sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch DNA đơn

 Bước 2: Giai đoạn lai

Ở giai đoạn này, nhiệt độ sẽ được hạ xuống đến 550C – 650C là nhiệt độ thích hợp

để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích Thời gian của giai đoạn này kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút tùy thuộc vào nhiệt

độ nóng chảy Tm của các mồi sử dụng

 Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (giai đoạn kéo dài)

Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ – 3’ của 2 mồi nhờ

hoạt động của polymerase Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase

hoạt động tốt nhất Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân lên thành hai bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại n lần thì từ một DNA đích sẽ nhân bản thành 2n bản sao Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR là khuếch đại một đoạn gene quan tâm bằng

mồi chuyên biệt kết hợp với hoạt động của enzyme chịu nhiệt polymerase như Taq DNA polymerase trong một chu kỳ nhiệt hợp lý Tác động của mồi được xem như yếu

tố đánh dấu cho hoạt động của polymerase khi nó được gắn kết vào DNA mạch đơn

làm khuôn trong giai đoạn bắt cặp Mồi bên trái tác động trên dây DNA 3’ – 5’ còn được gọi là mồi xuôi – forward primer, kí hiệu là F Mồi bên phải tác động trên dây 5’ – 3’ còn được gọi là mồi ngược – reverse primer, kí hiệu là R

2.5.3 Kỹ thuật giải trình tự

2.5.3.1 Phương pháp hóa học giải trình tự DNA

Vào năm 1977, Maxam và Guilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA Nguyên tắc của phương pháp này là:

 (1) Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P)

 (2) Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA Ví dụ, dimethylsulphate để làm biến đổi Guanine bằng cách thêm một gốc methyl ở vị trí nitrogen thứ 7 (N7), hydrazine làm biến đổi Thymine và Cytosine, hydrazine

và NaCl để làm biến đổi Cytosine, acid để làm biến đổi Guanine và Adenine, NaOH để làm biến đổi Adenine và Cytosine với Adenine ưu tiên hơn Cytosine Như vậy, trong giai đoạn này phải dùng ít nhất 4 ống nghiệm và trong mỗi ống nghiệm DNA được xử lý với một lượng rất giới hạn của một trong các chất hóa học nêu trên để mỗi ống nghiệm chỉ có chứa các đoạn DNA mà trên mỗi đoạn DNA này chỉ có một vị trí nucleotide đặc hiệu với chất hóa học là bị biến đổi

 (3) Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung phosphate của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung

đường- (4) Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel khơng bị biến đổi trong quá trình điện di

Nhờ đĩ, sau khi hồn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phĩng xạ do các mạch đơn đều cĩ một đầu được đánh dấu bằng 32P Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này, cĩ thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA Phương pháp hĩa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế khơng phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thơng số tối ưu cho thí nghiệm, trong

đĩ khĩ nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hĩa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ cĩ một base bị biến đổi để ứng với mỗi

vị trí của base bị biến đổi thì sẽ cĩ một mạch đơn cĩ đầu đánh dấu 32P được tách ra Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đĩ các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn (TS.BS Phạm Hùng Vân, 2009)

Mạch đơn DNA 32 P A p G p C p T p T p T p G p A p G p G p A p C p G p A

Các mạch DNA

đơn có đầu bị

đánh dấu 32 P

Hình 2.4 Các mạch đơn DNA cĩ đầu đánh dấu 32P (TS.BS Phạm Hùng Vân, 2009)

Các mạch đơn cĩ một đầu đánh dấu với 32 P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung

do bị biến đổi Các mạch đơn này cĩ chiều dài ngắn khác nhau tùy thuộc vào vị trí của

Guanine trên đoạn DNA

2.5.3.2 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA

Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm

1977, và ngày nay phương pháp này càng ngày càng được hồn thiện và thực hiện dễ dàng tại các phịng thí nghiệm

Nguyên tắc chung của phương pháp này cĩ thể được tĩm tắt như sau:

Hình 2.5 Phương pháp enzyme giải trình tự DNA

(TS.BS Phạm Hùng Vân, 2009)

Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector

từ vi khuẩn để thành các vector tự do

Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide

tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nucleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP

có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A,T,C và G) Phản ứng được thực hiện trong 4 ống nghiệm, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau Bắt đầu từ đoạn mồi, men

DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí cacbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc

Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người

ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA

Cấu tạo của máy tự động giải trình tự gồm hai phần chủ yếu sau:

 Phần điện di với gel polyacrylamide – có thể là một bản gel hay một ống mao quản chứa gel

 Phần phát hiện các vạch điện di – là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó

Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này

sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA

A G C T T A C G G A C T A A T G C

Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4

Chùm tia LASER

Máy vi tính

Các con mắt cảm quang phát hiện vạch điện di phát sáng khi đi qua chùm tia laser

Chiều điện di

Hình 2.6 Sơ đồ khối máy tự động giải trình tự dùng bản gel polyacrylamide

(TS.BS Phạm Hùng Vân, 2009)

Với các máy thế hệ mới sau này, người ta cĩ thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự cĩ thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm và khi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà khơng cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây

GGAATGC CCTTACG CATACGTGG

CGTAAGGCCdA

dA

CGTAAGGCdC CGTAAGGCCAC CGTAAGGCCACGT CGTAAGGdC CGTAAGGCCACGTA T CGTAAGGCCAdC CGTAAGGCCACG dT

CGTAAGGCCACGTA dT

dG

dG

theâm dNTP, DNA polymerase,

ddTTP , ddCTP

Nếu dùng điện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần

mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít, như máy giải trình tự CEQ8000 của Becman Coulter có 8 mao quản, còn máy ABI 3130XL của Applied Biosystem có 16 mao quản Các thế hệ máy về sau này ngày càng có những chương trình đi kèm chẳng những giúp cho việc hiển thị tự động các ký tự hóa học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên cứu:

 Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã mở đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở, trình tự đặc hiệu cho các enzyme cắt giới hạn, các dấu ấn di truyền…

mà các chi tiết này rất cần thiết để lập bản đồ gene…

 Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định hay phỏng đoán, hoặc làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gene…

 Tự động so sánh trình tự DNA trong thí nghiệm hay một trình tự DNA nạp vào máy, hay có thể trình tự acid amin của protein với các trình tự khác đã có trong ngân hàng dữ liệu để phát hiện được sự tương đồng với trình tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở xác định gene và chức năng gene…

Hình 2.8 Máy ABI 3130XL của Applied Biosystem

http://www.ucc.ie/en/genbiotech/equip/image,51643,en.JPG

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009 tại phòng Nghiên cứu và Phát triển của Công ty TNHH Thương Mại và Dịch Vụ Nam Khoa 793/58 Trần Xuân Soạn, P.Tân Hưng, quận 7, TP.Hồ Chí Minh

 Micropipette các loại và các đầu cone tương ứng và eppendorf 200 μl, 1,5 ml

 Máy ly tâm lạnh, máy ủ nhiệt khô,máy vortex, máy hút chân không

 Bio clean bench (tủ cấy vi sinh)

 Máy PCR, bồn điện di (Bio-rad), máng đổ gel, lò vi sóng

 Hệ thống chụp hình điện di Gel Doc của Bio-rad

 Máy giải trình tự ABI 3130XL của Applied Biosystem

 Máy điện di chip của hãng Agilent Technologies

 Khẩu trang và găng tay dùng trong y tế

3.2.2.2 Hóa chất

 Bộ kit trích biệt RNA toàn phần do Công Ty TNHH Nam Khoa cung cấp

 Bộ thuốc thử để tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên do Công ty TNHH Nam Khoa cung cấp

 Bộ hóa chất dùng cho phản ứng khuếch đại PCR

 Bộ hóa chất dùng cho quá trình giải trình tự

 Cồn 960 , Agarose, TE, TBE, Ethidium bromide, Loading dye, nước cất

Các hóa chất đều có nguồn gốc từ các hãng Bio-rad, Promega, Merck, Invitrogen

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Mẫu phân được chúng tôi thu thập từ các bệnh nhi bị tiêu chảy cấp đang được điều trị tại bệnh viện Nhi Đồng I

3.3.1 Phương pháp phát hiện nhanh Rotavirus

Sử dụng bộ kit SD Bioline Rotavirus với quy trình như sau:

Bước 1: Lấy khoảng 50 mg mẫu phân bằng tăm bông vô trùng có sẵn

Bước 2: Nhúng tăm bông vào trong lọ đựng dung dịch pha loãng

Bước 3: Lắc đều cho đến khi mẫu hòa tan đều trong dung dịch

Bước 4: Bỏ tăm bông ra khỏi lọ dung dịch

Bước 5: Đậy nắp lọ đựng mẫu bệnh phẩm lại

Bước 6: Rút thanh thử từ trong bao ra và đặt trên bề mặt khô ráo

Bước 7: Sau khi lắc đều dung dịch, bẻ gãy nút phía trên lọ Nhỏ 3 – 4 giọt dung dịch (120 – 150 μl) vào vùng nhỏ mẫu thử (S) của thanh thử (phải lọc hết chất kết tủa) Bước 8: Đọc kết quả trong vòng 10 – 20 phút, không đọc sau 20 phút

Hình 3.1 Sơ đồ thực hiện phương pháp phát hiện nhanh Rotavirus

3.3.2 Tách biệt RNA toàn phần

Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA toàn phần bằng bộ thuốc thử NKRNAPREP

do công ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp

Bảng 3.1 Bảng thành phần bộ kit NKRNAPREP

Cách tiến hành:

Sơ đồ 3.2 Quá trình tách biệt RNA toàn phần

3.3.3 Điện di RNA sau khi ly trích

Như đã được giới thiệu ở phần tổng quan tài liệu, việc điện di RNA cũng là một cách để xác định Rotavirus, vì vậy trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành điện di RNA sau khi ly trích với các bước thực hiện như sau:

 Bước 1: Chuẩn bị TBE 0,5 X Cho 50 ml TBE 10 X vào ống đong đã chứa 950

ml nước cất rồi lắc đều

 Bước 2: Chuẩn bị gel agarose 1,5% bằng cách cho 3 gram agarose vào 200 ml dung dịch TBE 0,5 X Sau đó, đun sôi trong lò viba cho đến khi tan hoàn toàn không còn lợn cợn, trong khi nấu thỉnh thoảng cần lắc đều dung dịch agarose để đảm bảo cho agarose tan hết và tránh để dung dich agarose trào ra ngoài khi nấu

 Bước 3: Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút rồi cho tiếp 8 μl Ethidium bromide 10 mg/ml, trộn và hòa tan đều Ethidium bromide vào trong thạch, tránh làm thạch có bọt khí khi trộn

 Bước 4: Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn rồi đổ thạch vào khuôn cho đạt được bề dày 4 – 5 mm Để nguội thạch và đặc thạch trong nhiệt độ phòng

 Bước 5: Khi thạch đặc, gỡ lược Sau đó đặt thạch vào trong máng điện di rồi đổ dung dịch TBE 0,5 X cho ngập mặt thạch

 Bước 6: Hút 5 μl loading dye trộn với 5 μl mẫu

 Bước 7: Dùng micropipette cho toàn bộ dung dịch trên vào giếng theo đúng thứ

tự Chạy điện di 45 phút ở dòng điện 135 V

 Bước 8: Sau khi chạy xong, lấy gel ra khỏi máng và đọc kết quả dưới tia UV Rồi chụp lại kết quả

3.3.4 Phiên mã ngược RNA để tổng hợp cDNA

Dùng kit tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên – NK cDNASYNTHESIS kit, do công ty Nam Khoa sản xuất và cung cấp Bộ kit bao gồm các thành phần sau: Reverse transcriptase, RNAsin, dNTP, oligo (dT), random hexaner, enhancer

Phương pháp tiến hành:

 Bước 1: Cho 9 μl mẫu tách chiết RNA vào một tube PCR 0,2 có chứa sẵn 3 μl

NKRT mix đang ngâm trong đá