Mục lục I. ĐẶT VẤN ĐỀ 3 II. TỔNG QUAN 3 1. Giới thiệu 3 2. Các loại virus rota 3 3. Cấu trúc 4 4. Sự liên kết và xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột của Rotavirus 7 5. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu rotavirus 7 III. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ROTAVIRUS 8 1. Các yếu tố phơi nhiễm của Rotavirus đối với rau châu Á được tưới nước thải và mô hình xác suất gây bệnh 8 1.1 Chuẩn bị thí nghiệm. 9 1.2 Thí nghiệm dựa theo mô hình QMRA. 9 1.3 Kết quả 10 1.4 Thảo luận 11 2. Rotavirus nhóm A liên quan đến các đợt bùng phát tiêu chảy ở các trang trại nuôi lợn con (xác định chủng virus rota ở heo mang kiểu gen VP7 mới, G26) 12 2.1 Khái quát 12 2.2 Nghiên cứu 13 2.2.1 Mẫu phân tích 13 2.2.2 Kiểm tra vi khuẩn và ký sinh trùng 13 2.2.3 Chiết xuất RNA 13 2.2.4 Giải trình tự DNA và phân tích di truyền 13 2.3 Kết quả 14 2.4 Thảo luận 17 3. Ảnh hưởng của quá trình axit hóa, lên men vi khuẩn và nhiệt độ về sự tồn tại đến Rotavirus trong thức ăn dặm cai sữa 17 3.1 Khái quát 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Mẫu 18 3.2.2 Chuẩn bị thức ăn dặm 18 3.2.3 Chuẩn độ virus 18 3.2.4 Sự bất hoạt của vi rút bằng nhiệt 18 3.2.5 Axit khử hoạt tính của virus 19 3.3 Kết quả 19 3.4 Thảo luận 20 4. Phát triển một phương pháp phục hồi Rotavirus từ bề mặt của rau 20 4.1 Khái quát 20 4.2 Nguyên liệu và phương pháp 20 4.2.1 Nuôi cấy tế bào 20 4.2.2 Virus 21 4.2.3 Rau 21 4.2.4 Chất rửa giải 21 4.2.5 Rửa giải vi rút từ rau quả 21 4.2.6 Phân tích dữ liệu 22 4.3 Kết quả 22 4.4 Thảo luận 23 5. Nghiên cứu về bệnh đường ruột truyền nhiễm ở Anh: các yếu tố nguy cơ liên quan đến rotavirus nhóm A ở trẻ em 23 5.1 Khái quát 23 5.2 Phương pháp 23 5.3 Kết quả 25 5.4 Thảo luận 26 IV. KẾT LUẬN 26 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Rotavirus là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy cấp thường gặp ở trẻ em. Có nguồn gốc là từ phân. Virus này phân bố rộng khắp trên tự nhiên, có thể xâm nhiễm và bám vào thực phẩm của chúng ta gây bệnh cho cả con người và động vật. Không chỉ có ở nước ta mà có khắp nơi trên thế giới với các nước phát triển và đang phát triển. Theo thống kê ở Việt Nam có 56% số trẻ nhập viện do viêm dạ dày ruột cấp là do nhiễm virusrota. Hàng năm, số trẻ chết do vi rút Rota chiếm từ 48% trong tổng số trẻ dưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên nhân. Ở các nước đang phát triển, hàng năm có khoảng trên 125 triệu ca tiêu chảy do vi rút Rota ở trẻ em dưới 5 tuổi. Trẻ càng nhỏ càng có nguy cơ nhiễm bệnh, thường hay gặp ở trẻ dưới 2 tuổi, đặt biệt là dưới 12 tháng. Đối với ca bệnh nhẹ có triệu chứng nôn ói, tiêu chảy. Nặng thì có thể dẫn đến trụy mạch và tử phong nếu không điều trị kịp thời. Hơn nữa đây là loài có thời gian tồn tại ở môi trường ngoài và vòng đời khá lâu có khả năng sinh sản mạnh, chính vì thế có khả năng lấy nhiễm rất cao. Nếu thực phẩm nhiễm virusrota sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến cơ thể chúng ta. Thấy được tầm quan trọng của nó, nhóm mình đã nghiên cứu các đặc điểm tính chất và các kết quả con số của loài virus này thông qua bài tiểu luận trình bày. Mục đích của bài tiểu luận này để chỉ ra những số liệu về việc nhiễm virus từ các bài nghiên cứu khác nhau, từ đó có những định hướng cho việc tìm hiểu và phát triển các phương pháp xác định virus cũng như các phương pháp hạn chế virus trong thực phẩm và cách tạo ra vaccince. Giúp người đọc hiểu rõ hơn về đặc điểm tính chất và cách phòng ngừa để bảo vệ sức khỏe II. TỔNG QUAN 1. Giới thiệu Rotavirus là một chi của virus ARN sợi kép trong gia đình Reoviridae. Rotavirus là nguyên nhân phổ biến nhất của bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Gần như mọi trẻ em trên thế giới đều bị nhiễm vi rút rota ít nhất một lần khi được 5 tuổi. Khả năng miễn dịch phát triển với mỗi lần nhiễm trùng, vì vậy các lần nhiễm trùng tiếp theo ít nghiêm trọng hơn; người lớn hiếm khi bị ảnh hưởng. Vi rút lây truyền qua đường phânmiệng . Nó lây nhiễm và thiệt hại các tế bào lót ruột non và gây ra viêm dạ dày ruột (mà thường được gọi là cúm dạ dày mặc dù không có liên quan đến cúm ).Ngoài ảnh hưởng đến sức khỏe con người, virus rota còn lây nhiễm sang các động vật khác và là mầm bệnh cho vật nuôi. 2. Các loại virus rota Có 9 loài rotavirus, được gọi là A, B, C, D, F, G, H, I và J. Con người chủ yếu bị nhiễm bởi các loài rotavirus A. Các loài A – I gây bệnh cho các động vật khác, loài H ở lợn, D, F và G ở chim, I ở mèo và J ở dơi. Trong rotavirus A có các chủng khác nhau, được gọi là serotype. Cũng như đối với vi rút cúm , một hệ thống phân loại kép được sử dụng dựa trên hai protein trên bề mặt của vi rút. Các glycoprotein VP7 xác định týp huyết thanh G và proteaseProtein nhạy cảm VP4 xác định các kiểu huyết thanh P. Bởi vì hai gen xác định loại G và loại P có thể được truyền riêng rẽ cho các vi rút thế hệ con cháu, các tổ hợp khác nhau được tìm thấy. Một hệ thống định dạng gen toàn bộ đã được thiết lập cho rotavirus A , được sử dụng để xác định nguồn gốc của các chủng không điển hình. Tỷ lệ phổ biến của các loại G và P riêng lẻ khác nhau giữa các quốc gia và các năm. Có ít nhất 32 loại G và 47 loại P nhưng trong các trường hợp nhiễm trùng ở người, chỉ có một số sự kết hợp của loại G và P chiếm ưu thế. Đó là G1P, G2P, G3P, G4P, G9P và G12P. 3. Cấu trúc Bộ gen của rotavirus bao gồm 11 phân tử chuỗi xoắn kép duy nhất của RNA (dsRNA) với tổng số 18.555 nucleotide. Mỗi chuỗi xoắn, hoặc đoạn, là một gen , được đánh số từ 1 đến 11 theo kích thước giảm dần. Mỗi gen mã cho một loại protein , ngoại trừ gen 9, mã cho hai loại. RNA được bao quanh bởi một capsid protein ba lớp hình tam giác . Các hạt virus có đường kính lên đến 76,5 nm và không được bao bọc. Rotavirus là loại virus RNA sợi kép (dsRNA) không bao bọc có cấu trúc phức tạp gồm ba capsid đồng tâm bao quanh bộ gen gồm 11 đoạn dsRNA. Các phân đoạn RNA mã hóa sáu protein virus cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 và VP7) và sáu protein không cấu trúc (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 và NSP6). Các protein trong hạt virus trưởng thành quyết định tính đặc hiệu của vật chủ, sự xâm nhập tế bào và các chức năng của enzym cần thiết cho việc sản xuất các bản sao virus và chứa các biểu mô tạo ra các phản ứng miễn dịch. Các protein không cấu trúc tham gia vào quá trình sao chép bộ gen và đối kháng với phản ứng miễn dịch bẩm sinh (một vai trò đặc biệt đối với NSP1) và bao gồm độc tố ruột của virus NSP4. Rotavirus giống như một bánh xe với các nan ngắn và vành ngoài nhẵn. Cấu trúc này bao gồm lớp capsid bên trong (protein virus VP2), lớp capsid giữa (VP6) và lớp capsid bên ngoài (VP7 và protein nhọn VP4). VP4 được phân cắt theo phương pháp protein thành VP8 và VP5. Protein cấu trúc VP2, các enzym VP1 và VP3 và bộ gen virus tạo nên lõi virion. Protein lớp capsid giữa (VP6) xác định các đặc tính của loài, nhóm và phân nhóm. Lớp capsid bên ngoài bao gồm hai protein, VP7 và VP4, tạo ra phản ứng miễn dịch ở vật chủ bị nhiễm, dẫn đến sản xuất các kháng thể đặc hiệu với rotavirus. Dựa trên sự khác biệt về trình tự và kháng nguyên của VP6 đã phân thành mười loài rotavirus khác nhau (A – J). Hình 1. Cấu trúc của Rotavirus • a) Ảnh hiển vi của Rotavirus • b) Sơ đồ mặt cắt 3 lớp • c) Hồ sơ di chuyển điện di của 11 đoạn RNA sợi kép (dsRNA) của rotavirus và các protein được mã hóa cho chủng virus SA11 simian Rotavirus có mặt ở khắp nơi và lây nhiễm cho hầu hết mọi trẻ em trên toàn cầu từ 3–5 tuổi. Sự tiến hóa của vi rút được thúc đẩy bởi sự tích tụ của các đột biến điểm và sắp xếp lại bộ gen, có thể xảy ra sau khi nhiễm trùng kép các tế bào riêng lẻ bởi các chủng virus A khác nhau, dẫn đến thế hệ con virus có sự kết hợp của các bộ gen của bố mẹ. Nhiễm rotavirus gây ra các triệu chứng tiêu chảy, nôn mửa, khó chịu và sốt. Rotavirus được thải ra với số lượng lớn trong phân trong các đợt tiêu chảy do rotavirus. Về quá trình lây nhiễm, virus lây truyền chủ yếu qua đường phân miệng, chủ yếu là tiếp xúc giữa người với người. Rotavirus lây nhiễm và sao chép trong các tế bào ruột trưởng thành, không phân chia ở giữa và đầu nhung mao và trong các tế bào nội tiết ở ruột non, cho thấy rằng các loại tế bào này biểu hiện các yếu tố cần thiết để lây nhiễm và sao chép hiệu quả. Tính nhạy cảm của các tế bào ruột trưởng thành và các tế bào nội tiết ruột trưởng thành đối với nhiễm trùng đã được chứng minh ở chuột, trong dòng tế bào nội tiết ruột đã biến đổi của người và trong các mẫu cấy vi khuẩn đường ruột ở người. Sự gắn kết của rotavirus vào tế bào vật chủ qua trung gian bởi protein capsid bên ngoài VP4.
Mục lục I ĐẶT VẤN ĐỀ Rotavirus nguyên nhân gây tiêu chảy cấp thường gặp trẻ em Có nguồn gốc từ phân Virus phân bố rộng khắp tự nhiên, xâm nhiễm bám vào thực phẩm gây bệnh cho người động vật Không có nước ta mà có khắp nơi giới với nước phát triển phát triển Theo thống kê Việt Nam có 56% số trẻ nhập viện viêm dày ruột cấp nhiễm virusrota Hàng năm, số trẻ chết vi rút Rota chiếm từ 4-8% tổng số trẻ tuổi bị chết nguyên nhân Ở nước phát triển, hàng năm có khoảng 125 triệu ca tiêu chảy vi rút Rota trẻ em tuổi Trẻ nhỏ có nguy nhiễm bệnh, thường hay gặp trẻ tuổi, đặt biệt 12 tháng Đối với ca bệnh nhẹ có triệu chứng nơn ói, tiêu chảy Nặng dẫn đến trụy mạch tử phong không điều trị kịp thời Hơn lồi có thời gian tồn mơi trường ngồi vịng đời lâu có khả sinh sản mạnh, có khả lấy nhiễm cao Nếu thực phẩm nhiễm virusrota ảnh hưởng trực tiếp đến thể Thấy tầm quan trọng nó, nhóm nghiên cứu đặc điểm tính chất kết số lồi virus thơng qua tiểu luận trình bày Mục đích tiểu luận để số liệu việc nhiễm virus từ nghiên cứu khác nhau, từ có định hướng cho việc tìm hiểu phát triển phương pháp xác định virus phương pháp hạn chế virus thực phẩm cách tạo vaccince Giúp người đọc hiểu rõ đặc điểm tính chất cách phòng ngừa để bảo vệ sức khỏe II TỔNG QUAN Giới thiệu Rotavirus chi virus ARN sợi kép gia đình Reoviridae Rotavirus nguyên nhân phổ biến bệnh tiêu chảy trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Gần trẻ em giới bị nhiễm vi rút rota lần tuổi Khả miễn dịch phát triển với lần nhiễm trùng, lần nhiễm trùng nghiêm trọng hơn; người lớn bị ảnh hưởng Vi rút lây truyền qua đường phân-miệng Nó lây nhiễm thiệt hại tế bào lót ruột non gây viêm dày ruột (mà thường gọi "cúm dày" khơng có liên quan đến cúm ).Ngoài ảnh hưởng đến sức khỏe người, virus rota lây nhiễm sang động vật khác mầm bệnh cho vật nuôi Các loại virus rota Có lồi rotavirus, gọi A, B, C, D, F, G, H, I J Con người chủ yếu bị nhiễm loài rotavirus A Các loài A – I gây bệnh cho động vật khác, loài H lợn, D, F G chim, I mèo J dơi Trong rotavirus A có chủng khác nhau, gọi serotype Cũng vi rút cúm , hệ thống phân loại kép sử dụng dựa hai protein bề mặt vi rút Các glycoprotein VP7 xác định týp huyết G protease-Protein nhạy cảm VP4 xác định kiểu huyết P Bởi hai gen xác định loại G loại P truyền riêng rẽ cho vi rút hệ cháu, tổ hợp khác tìm thấy Một hệ thống định dạng gen tồn thiết lập cho rotavirus A , sử dụng để xác định nguồn gốc chủng không điển hình Tỷ lệ phổ biến loại G P riêng lẻ khác quốc gia năm Có 32 loại G 47 loại P trường hợp nhiễm trùng người, có số kết hợp loại G P chiếm ưu Đó G1P, G2P, G3P, G4P, G9P G12P Cấu trúc Bộ gen rotavirus bao gồm 11 phân tử chuỗi xoắn kép RNA (dsRNA) với tổng số 18.555 nucleotide Mỗi chuỗi xoắn, đoạn, gen , đánh số từ đến 11 theo kích thước giảm dần Mỗi gen mã cho loại protein , ngoại trừ gen 9, mã cho hai loại RNA bao quanh capsid protein ba lớp hình tam giác Các hạt virus có đường kính lên đến 76,5 nm không bao bọc Rotavirus loại virus RNA sợi kép (dsRNA) khơng bao bọc có cấu trúc phức tạp gồm ba capsid đồng tâm bao quanh gen gồm 11 đoạn dsRNA Các phân đoạn RNA mã hóa sáu protein virus cấu trúc (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 VP7) sáu protein không cấu trúc (NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 NSP6) Các protein hạt virus trưởng thành định tính đặc hiệu vật chủ, xâm nhập tế bào chức enzym cần thiết cho việc sản xuất virus chứa biểu mô tạo phản ứng miễn dịch Các protein không cấu trúc tham gia vào trình chép gen đối kháng với phản ứng miễn dịch bẩm sinh (một vai trò đặc biệt NSP1) bao gồm độc tố ruột virus NSP4 Rotavirus giống bánh xe với nan ngắn vành nhẵn Cấu trúc bao gồm lớp capsid bên (protein virus VP2), lớp capsid (VP6) lớp capsid bên (VP7 protein nhọn VP4) VP4 phân cắt theo phương pháp protein thành VP8* VP5* Protein cấu trúc VP2, enzym VP1 VP3 gen virus tạo nên lõi virion Protein lớp capsid (VP6) xác định đặc tính lồi, nhóm phân nhóm Lớp capsid bên ngồi bao gồm hai protein, VP7 VP4, tạo phản ứng miễn dịch vật chủ bị nhiễm, dẫn đến sản xuất kháng thể đặc hiệu với rotavirus Dựa khác biệt trình tự kháng nguyên VP6 phân thành mười lồi rotavirus khác (A – J) Hình Cấu trúc Rotavirus • • • a) Ảnh hiển vi Rotavirus b) Sơ đồ mặt cắt lớp c) Hồ sơ di chuyển điện di 11 đoạn RNA sợi kép (dsRNA) rotavirus protein mã hóa cho chủng virus SA11 simian Rotavirus có mặt khắp nơi lây nhiễm cho hầu hết trẻ em toàn cầu từ 3– tuổi Sự tiến hóa vi rút thúc đẩy tích tụ đột biến điểm xếp lại gen, xảy sau nhiễm trùng kép tế bào riêng lẻ chủng virus A khác nhau, dẫn đến hệ virus có kết hợp gen bố mẹ Nhiễm rotavirus gây triệu chứng tiêu chảy, nơn mửa, khó chịu sốt Rotavirus thải với số lượng lớn phân đợt tiêu chảy rotavirus Về trình lây nhiễm, virus lây truyền chủ yếu qua đường phân - miệng, chủ yếu tiếp xúc người với người Rotavirus lây nhiễm chép tế bào ruột trưởng thành, không phân chia đầu nhung mao tế bào nội tiết ruột non, cho thấy loại tế bào biểu yếu tố cần thiết để lây nhiễm chép hiệu Tính nhạy cảm tế bào ruột trưởng thành tế bào nội tiết ruột trưởng thành nhiễm trùng chứng minh chuột, dòng tế bào nội tiết ruột biến đổi người mẫu cấy vi khuẩn đường ruột người Sự gắn kết rotavirus vào tế bào vật chủ qua trung gian protein capsid bên ngồi VP4 Hình Chu trình nhân lên Rotavirus Chu trình nhân lên Rotavirus Rotavirus gắn vào thụ thể glycan khác bề mặt tế bào chủ, tùy thuộc vào chủng virus, thông qua tương tác với miền virus VP8* VP4 Các sialoglycan coi đối tác glycan quan trọng VP8* Các thụ thể đề xuất khác cho xâm nhập tế bào rotavirus bao gồm tích phân, protein sốc nhiệt 70 protein kết nối phân tử kết dính chức A, chất kết dính protein nối chặt ZO-1 Sau liên kết ban đầu, VP7 miền VP5* VP4 tương tác với số đồng thụ thể này, chúng tập trung nhóm lipid để làm trung gian cho xâm nhập virus Tùy thuộc vào chủng virus rota, virus nội bào hóa vào tế bào đường nội bào phụ thuộc clathrin không phụ thuộc clathrin không phụ thuộc vào caveolin Mức canxi thấp bên endosome kích hoạt việc loại bỏ lớp capsid bên ngồi, lớp vỏ giải phóng hạt hai lớp có hoạt tính phiên mã (DLP) vào tế bào chất MRNA virus sử dụng để dịch mã làm khuôn mẫu để tổng hợp RNA q trình chép gen; RNA sau đóng gói thành DLP viroplasms (cấu trúc chuyên biệt bao gồm protein tế bào virus đòi hỏi thành phần giọt lipid để hình thành) Sự lắp ráp hạt ba lớp liên quan đến liên kết DLP hình thành với protein khơng cấu trúc (NSP4), đóng vai trò thụ thể nội bào, nảy chồi DLP vào lưới nội chất (ER) Ngoài ra, NSP4 làm trung gian làm tăng nồng độ canxi tế bào chất, cần thiết cho nhân lên virus Trong ER, quan sát thấy hạt bao bọc thoáng qua protein capsid bên VP4 VP7 thêm vào DLP Sau đó, lớp vỏ bị đi, hạt vi rút trưởng thành virion hệ cháu giải phóng khỏi tế bào thông qua ly giải tế bào chế vận chuyển mụn nước không độc lập với Golgi tế bào biểu mô phân cực Sự liên kết xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột Rotavirus Rotavirus lây nhiễm vào tế bào ruột trưởng thành phần phần nhung mao ruột non, cuối dẫn đến tiêu chảy Thông tin việc xâm nhập vào tế bào Rotavirus tạo thành trình nhiều bước Các mơ hình gần cho thấy rotavirus tương tác với thụ thể axit sialic sau với thụ thể khơng phụ thuộc axit sialic Người ta đề xuất thụ thể phần vi miền lipid nhận tích phân Theo quan điểm điều thông tin khác, hai giả thuyết đối lập đưa cách Rotavirus xâm nhập vào tế bào đích: thơng qua xâm nhập trực tiếp dung hợp thông qua Ca2+ phụ thuộc Q trình nội bào hóa phụ thuộc Ca2+ đại diện cho phương thức xâm nhập hấp dẫn dựa thực tế Rotavirus lây nhiễm nội bào hóa với nồng độ Ca2+ thấp dẫn đến dịng truyền Ca2+ từ túi đến tế bào chất Một nồng độ Ca2+ endosome cân với tế bào chất, mức quan trọng ổn định capsid bên ngoài, virus protein bên ngồi sau ly giải với màng túi, cho phép virus thoát tế bào chất Tầm quan trọng việc nghiên cứu rotavirus Việc nghiên cứu rotavirus có ý nghĩ quan trọng ngành công nghiệp thực phẩm sức khỏe người, rotavirus dễ lây lan từ môi trường vào thực phẩm chúng nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy cấp trẻ em Việc nghiên cứu rotavirus giúp ta biết tính chất, cấu tạo môi trường sống rotavirus chế hoạt động khả sinh sản, phát triển chúng, từ có nghiên cứu giúp phịng ngừa, chẩn đốn kiểm sốt virus thực phẩm thể người Những mục đích mà ta đạt trình nghiên cứu rotavirus là: • Đảm bảo cho thực phẩm đạt chuẩn an tồn vệ sinh thực phẩm, mang tiêu thụ: Rotavirus loại virus dễ lây lan thực phẩm với nhiều tác hại hệ lụy nặng nề Chúng tồn thực phẩm từ trước chúng đưa vài nhà máy, có khả tái nhiễm từ mơi trường bên ngồi thông qua khâu sơ chế chế biến thực phẩm khâu thực mà không đảm bảo mặt an toàn vệ sinh thực phẩm Việc nghiên cứu kiểm nghiệm rotavirus giúp ta biết loại thực phẩm có virus hay không liều lượng bao nhiêu, khả ảnh hưởng đến sức khỏe người chúng, từ đưa phương pháp nhằm loại bỏ virus thay đổi quy trình sản xuất để đảm bảo lượng virus có thực phẩm mức thấp nhất, không đủ khả gây nguy hại cho sức khỏe người Đây tiêu quan trọng cho doanh nghiệp kinh doanh lĩnh vực thực phẩm để xuất sản phẩm thị trường, đảm bảo sản phẩm thực phẩm đủ tiêu chuẩn độ an tồn đến tay người tiêu dùng • Nghiên cứu để phòng ngừa bệnh tạo vaccine: Theo thống kê Tổ chức Y tế giới WHO, năm giới có khoảng 1,5 tỷ lượt trẻ tuổi mắc tiêu chảy triệu trẻ chết bệnh này, 80% xảy trẻ tuổi Nhiễm Rotavirus gây tử vong cho 453.000 trẻ em tuổi giới năm nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước phát triển Ở Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy virut Rota chiếm 50% tổng số trẻ em tuổi bị tiêu chảy điều trị số Bệnh viện Nhi Trong có khoảng 5.300 đến 6.800 ca tử vong bệnh này, chiếm 8% - 11% tỷ lệ tử vong trẻ độ tuổi [Nguyen Van Man et al: Epidermiological profile and burden of rotavirus diarrhea in Vietnam: years of sentinel hospital surveillance, 1998-2003.J Infect Dis 192 Suppl 1: S127-32] Việc nghiên cứu tính chất chế hoạt động phát triển rotavirus góp phần khơng nhỏ giúp tạo nhiều loại vaccine điều trị bệnh rotavirus gây nên, không giảm thiểu số lượng trẻ em mắc bệnh tử vong mà hỗ trợ giảm thiểu gánh nặng kinh tế mà chi phí điều trị bệnh vô tốn Tại phải nghiên cứu rotavirus nhiều kỹ thuật khác nhau? Việc nghiên cứu loài vi sinh vật nhiều kỹ thuật khác giúp ta tìm biện pháp thích hợp để sử dụng cách có hiệu vi sinh vật có lợi biện pháp tích cực nhằm ngăn ngừa vi sinh vật có hại Đối với rotavirus, việc nghiên cứu chúng nhiều phương pháp kỹ thuật khác giúp ta tìm phương pháp phù hợp để nghiên cứu hình thái, tính chất, chế hoạt động, khả sinh sản phát triển, rotavirus, từ ta có sở liệu để tìm hiểu biện pháp phịng tránh ngăn ngừa loại vi sinh vật có hại có mơi trường thực phẩm gây nguy hại làm ảnh hưởng đến tiêu an toàn thực phẩm để tạo loại vaccine giúp bảo vệ sức khỏe người III CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ROTAVIRUS Các yếu tố phơi nhiễm Rotavirus rau châu Á tưới nước thải mơ hình xác suất gây bệnh Ở vùng khan nước nước phát triển sử dụng nước thải để tưới rau loại nông nghiệp Việc gây việc nhiễm số bệnh cho thể, rotavirus chẳng hạn Rotavirus nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy nặng trẻ sơ sinh trẻ nhỏ Bài nghiên cứu sử dụng (QMRA) theo khuyến nghị WHO để xác định xem việc tưới nước thải có đáp ứng tiêu chuẩn sức khỏe hay khơng 1.1 Chuẩn bị thí nghiệm Các loại rau sử dụng để thực thí nghiệm Châu Á giới, gồm có: cải thìa, cải ngồng, cải rổ xà lách Thí nghiệm thực khu vườn chợ thương mại ngoại ô Melbourne, Victoria, Úc, vào ngày 28/1/2013 Các loại rau thu hoạch sau tưới 30 phút vận chuyển đến phịng thí nghiệm để cân làm khơ máy quay rau với khăn giấy để loại bỏ nước bề mặt Ba loại cải tách để đảm bảo không bị đọng nước Xà lách cắt thành nhiều đoạn nhỏ trước 1.2 Thí nghiệm dựa theo mơ hình QMRA Các QMRA xác suất xây dựng cách sử dụng yếu tố phơi nhiễm thử nghiệm để mô nguy sức khỏe người trẻ em từ việc tiêu thụ loại rau quanh năm sau tưới tiêu nước thải qua xử lý thứ cấp Bắc Kinh, Trung Quốc Liều lượng rotavirus mà người tiêu dùng tiếp xúc xác định công thức: Trong đó: • • • • • • C nồng độ rotavirus nước thải (đơn vị virus /L) V thể tích nước tưới mà trồng thu (mL / g) M lượng rau tiêu thụ hàng ngày đầu người (g/người/ngày) k số phân rã động học vi rút ruộng (ngày-1) W giảm nồng độ vi rút thông qua rửa rau sau thu hoạch (đơn vị log10) t thời gian giữ lại lần tưới nước thải cuối kiện thu hoạch/tiêu thụ (ngày) Phân phối hỗn hợp nồng độ rotavirus nước thải xử lý thứ cấp lấy từ hai nghiên cứu theo dõi nồng độ virus sáu nhà máy xử lý nước thải đô thị khác khắp Bắc Kinh Cả hai nghiên cứu sử dụng phương pháp luận tương tự: bổ sung SiO2 AlCl3 vào mẫu nước để xác định nồng độ phần tử virus, sử dụng dụng cụ chiết xuất RNA Qiagen khuếch đại virus rota thông qua phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (PCR) với đoạn mồi thiết kế để nhắm vào gen VP7 rotavirus nhóm A Nồng độ rotavirus truyền nhiễm 1/1.000 gen rotavirus Hiệu phục hồi không báo cáo hai nghiên cứu hiệu suất phục hồi (60%) Các cơng thức tính tốn để làm thí nghiệm: - Xác suất lây nhiễm cho ngày thứ k (pinf: người ngày) tính tốn cách sử dụng mơ hình đáp ứng liều beta-Poisson siêu đo:: pinf = – 1F1 (α, α + β , - λ) Trong đó: 1F1 hàm siêu thị hợp lưu Kummer Giá trị cho thông số phù hợp α β (0,167; 0,191) Xác suất bệnh tật có điều kiện sau nhiễm bệnh (pill; người ngày): • • - pill = pinfI Trong đó: I tỷ lệ người nhiễm vi rút rota bị bệnh - Xác suất bệnh tật nhiễm trùng hàng năm cho mơ thứ j mơ hình (p; người năm [pppy]): pk xác suất bệnh tật nhiễm trùng cho lần lặp lại thứ k số 365 sư kiện tiếp xúc hàng ngày lần thứ j số 1.000 lần mơ kiện giả định độc lập - Gánh nặng bệnh tật hàng năm (A; DALY pppy) bệnh vi rút rota ước tính là: A=PDSF Trong đó: • • • P xác suất bệnh tật hàng năm D gánh nặng bệnh tật virus rota SF tỷ lệ dân số nhạy cảm với bệnh Phân tích độ nhạy hữu ích để khảo sát ảnh hưởng độ không đảm bảo thay đổi thông số đầu vào xác suất đầu QMRAs Nó thường liên quan đến việc áp dụng kỹ thuật tương quan hồi quy cho mảng ghép nối biến vào ra, trình phức tạp 1.3 Kết Cải ngồng gây rủi ro lớn nhất, cải thìa gây rủi ro nhỏ bốn loại rau Xác suất lây nhiễm trung bình hàng năm dự đốn dao động: Cải thìa: 7,70×10−4/năm, cải ngồng: 4,64×10−3/năm, Cải rổ: 2,67×10−3/năm, xà lách: 2,64×10−3/năm Vegetable Bok choy Choy sum Gai lan Lettuce C V M k Value t W 0.751*** 0.763*** 0.904*** 0.845*** 0.090*** 0.121*** 0.119*** 0.097*** 0.556*** 0.504*** 0.185*** 0.385*** -0.029*** -0.008 -0.041*** -0.016 -0.142*** -0.166*** -0.197*** -0.177*** -0.208*** -0.230*** -0.271*** -0.239*** Bảng 1: Phân tích độ nhạy cho xác suất nhiễm trùng ngày 1.4 Thảo luận Đây trình bày phép đo lưu giữ nước cho loại rau châu Á đánh giá rủi ro vi rút việc tiêu thụ rau từ tưới nước thải Trung Quốc Cải rổ cải ngồng thu nhiều nước tưới loại rau nghiên cứu, tiêu thụ nước thải tưới cho cải ngồng có nguy lớn nhất, cịn cải thìa có nguy Hình 3: Xác suất tích lũy Rủi ro từ tưới tiêu nông nghiệp nước thải cần quản lý, hướng dẫn WHO tái sử dụng nước thải cung cấp cấu trúc để xây dựng hướng dẫn tái sử dụng cho quốc gia cụ thể họ kết hợp phương pháp QMRA ngưỡng 10−6 DALY pppy vào hướng dẫn Tuy nhiên, việc giải thích ngưỡng khơng nên mang tính chất quy định Hướng dẫn WHO nêu rõ gánh nặng bệnh tật tổng thể từ đường phơi nhiễm khác cao, đặt mức độ rủi ro chấp nhận thấp 10−4 hay 10−5 việc sử dụng nước thải an tồn 10 2.2.1 Mẫu phân tích Dịch tiêu chảy bùng phát lợn sữa lần khoảng thời gian từ tháng 2/2009 đến tháng 3/2010 trang trại lớn lứa đẻ với 4000 lợn nái tỉnh Miyazaki, Nhật Bản Tổng số 28 mẫu phân (một mẫu lứa, đến 11 mẫu ổ dịch) thu thập từ trực trạng lợn bị tiêu chảy chưa điều trị kháng sinh 2.2.2 Kiểm tra vi khuẩn ký sinh trùng Kiểm tra vi khuẩn thực Escherichia coli, Salmonella enterica Clostridium perfringens , kiểm tra ký sinh trùng thực Coccidia Cryptosporidium parvum , mô tả trước 2.2.3 Chiết xuất RNA Các mẫu phân pha lỗng với mơi trường thiết yếu tối thiểu Eagle thành huyền phù 10% làm rõ cách ly tâm 500 x g 10 phút Phần phía thu thập RNA tổng số chiết xuất từ 250 μL huyền phù phân cách sử dụng TRIzol LS RNA tổng số thu hồi lơ lửng 50 μL nước khơng có RNase / DNase bảo quản -20 ° C sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) điện di gel polyacrylamide (PAGE) 2.2.4 Giải trình tự DNA phân tích di truyền Các amplicon gen GAR VP7 VP4 tinh cách sử dụng Cột HR MicroSpin S-400 Các sản phẩm PCR tinh khiết sử dụng làm khuôn mẫu để giải trình tự máy giải trình tự DNA tự động Applied Biosystems 3100 sử dụng hóa học giải trình tự chu trình Dye terminator giải trình tự từ hai hướng Để xác định vùng mã hóa hồn chỉnh gen VP7 dịng TJ4-1, cặp mồi TJ4-1 494F (5'-GTA ACC CAA TGG ACA TTA CAC TG-3 ') TJ4-1 368R (5'-CTA CTG AAA ATG ATG CGA TGT C-3 ') sử dụng làm mồi giải trình tự Các trình tự tập hợp, chỉnh sửa phân tích phần mềm MEGA ***Số gia nhập trình tự nucleotide Các trình tự nucleotide xác định nghiên cứu nộp cho GenBank theo số gia nhập sau: • • • • • • • TJ1-1 (VP7: AB611688, VP4: AB621582) TJ2-1 (VP7: AB611689, VP4: AB621587) TJ2-2 (VP7: AB611690, VP4: AB621583) TJ3-2 (VP7: AB611692, VP4: AB621585) TJ4-1 (VP7: AB605258, VP4: AB621586) TJ4-3 (VP4: AB611691, VP4: AB621584) TJ4-5 (VP7: AB611693, VP4: AB621588) 12 2.3 Kết Các đợt bùng phát dịch tiêu chảy ảnh hưởng đến hầu hết số lợn sinh từ 20% - 30% số lợn nái cho bú sữa ,xảy vào tháng 2,3,5 năm 2009 tháng năm 2010 Các dấu hiệu lâm sàng thường gặp bao gồm tiêu chảy nhiều nước nước kéo dài khoảng tuần Tỷ lệ tử vong 5% Bùng phát Tháng năm xảy 2/2009 3/2009 5/2009 3/2010 Số lượng lợn lấy mẫu Phạm vi (trung bình) Ngày tuổi 4-7 6-20 2-5 3-7 11 5 Gieo giống 1-7 1-8 1-1 1-3 Bảng Số lượng, tuổi lứa lợn Hơn 80% mẫu thu thập đợt bùng phát dương tính với GAR, xác định RT-PCR nhắm mục tiêu VP7 liệt kê Bảng Một số mẫu có chứa tác nhân gây bệnh đường ruột khác: GBR, Isospora suis, Eimeria porci, GCR Những kết GAR tác nhân gây bệnh đường ruột phổ biến liên quan đến đợt bùng phát tiêu chảy lặp lặp lại nguyên nhân Bùng phát Tên mẫu TJ1-1 TJ1-2 TJ1-3 TJ1-6 TJ1-7 TJ1-8 TJ1-9 TJ1-10 TJ1-11 TJ2-1 TJ2-2 TJ2-3 TJ2-4 TJ3-1 TJ3-2 TJ3-3 TJ3-4 TJ3-5 TJ4-1 TJ4-2 TJ4-3 TJ4-4 TJ4-5 TJ4-6 Loại điện tử eI eI eI - a) eI eI eI eI eII eI eI eII eIII eIII eIII eIII eIII eIV eIV eV eV eVI eV 13 Sự kết hợp kiểu gen G P G9 P G9 P G9 NS nd b) NS G9 P G9 P G9 NS G9 P G9 P G9 P NS P NS NS NS NS NS NS G3 P NS NS G3 P NS NS c) G26 P NS NS G9 P NS NS G5 P NS NS Bảng 3: Kiểu gen kết hợp kiểu gen G P chủng GAR Trong đó: a) Mẫu âm tính với GAR RNA-PAGE b) Mẫu dương tính với GAR RT-PCR, khơng thể xác định trình tự nucleotide • c) Kiểu gen VP7 (G) xác định nghiên cứu • • Tất 11 phân đoạn RNA gen GAR hình dung 22 mẫu số 28 mẫu xử lý RNA-PAGE Các kiểu di chuyển RNA phân loại thành kiểu chủng vi khuẩn điện tử từ eI đến eVI (Hình 4) Một kiểu điện cực khác quan sát thấy đợt bùng phát, tóm tắt Bảng OSU dòng GAR lợn tham chiếu với kiểu di chuyển RNA dài RNA-PAGE không tìm thấy mẫu bị nhiễm nhiều dịng GAR Hình 4: Các chủng vi khuẩn điện tử (eI đến eVI) chủng GAR ***Phân tích di truyền gen GAR VP7 xác định kiểu gen G mới: Trình tự nucleotide gen VP7 (933 bp, tương ứng với nucleotide từ 69 đến 1001 gen VP7 chủng lợn G5 OSU) xác định thành cơng 15 mẫu Phân tích tìm kiếm BLAST phân tích phylogenic gen VP7 với 25 kiểu gen G thiết lập dẫn đến việc phân loại 15 chủng GAR thành kiểu gen: G9, G3, G5 kiểu gen G phân loại (Hình 2a ) 14 Hình 5: Trình tự nucleotide phần gen VP7 Viết tắt: Hu human,Po lợn, Bo bị, Si khỉ, Mu chuột, Eq ngựa, Ca chó, Bat dơi, Ch gà, Ph chim trĩ, Pi chim bồ câu, Tu gà tây 11 chủng G9 với chủng phát lần bùng phát đầu tiên, hai lần thứ hai lần thứ tư (Bảng 5) Một sinh thực vật dựa chọn lọc chủng G9 người động vậ 11 chủng tạo thành nhánh riêng biệt có liên quan xa với chủng G9 người lợn bao gồm G9 dịng III VI (Hình 5b) Đặc điểm nhận dạng nucleotide 11 chủng 99,4% đến 100% so với nhau, 90,6% đến 93,2% dòng phân lập G9 lợn Nhật Bản cũ JP16-3, JP32-4, JP13-3, JP35-7, JP3-6, JP29 -6, Hokkaido-14 thuộc dòng G9 VI, 87,2% đến 93,8% dòng G9 người lợn thuộc dòng G9 III VI Hai chủng G3 TJ3-1 TJ3-2, hai xác định đợt bùng phát thứ ba, tạo thành nhánh riêng biệt có liên quan xa với chủng G3 lợn, bao gồm dòng I (Hình 2c) Đặc điểm nhận dạng nucleotit gen VP7 chúng 100% so với nhau, 15 87,6% đến 91,6% dòng G3 lợn bao gồm dòng I, 87,3% đến 90,9% dòng G3 người bao gồm dòng I, 79,1% đến 82,4% Các chủng G3 bao gồm dòng khác Dòng phân lập G5 TJ4-5, xác định lần bùng phát thứ tư, tạo thành nhánh riêng biệt có liên quan xa với chủng G5 người lợn bao gồm dịng III (Hình 2d ) Đặc điểm nhận dạng nucleotide gen VP7 86,3% đến 90,3% so với chủng G5 bao gồm dòng III, 85,4% đến 87,4% cho dòng I 85,3% đến 87,6% cho dịng II Gen G khơng thể thay đổi TJ4-1, xác định lần bùng phát thứ tư, khơng phân cụm với trình tự tham chiếu từ nhóm 25 kiểu gen G (Hình 2a), đặc điểm nhận dạng nucleotide gen VP7 93,1% so với 57vp7w, dịng G3 người khơng phổ biến xác định Thái Lan lên đến 80,5% chủng G3 khác lên đến 78,8% chủng có kiểu gen G khác Do đó, chúng tơi xác định đặc điểm chủng TJ4-1 cách phân tích trình tự mã hóa hồn chỉnh gen VP7, gen dài 981 bp bao gồm protein dự đoán gồm 326 axit amin Mức độ nhận dạng cao với dòng G3 RRV (80,2% mức nhận dạng nucleotide 87,5% mức độ nhận dạng axit amin), với mức nhận dạng nucleotide axit amin thấp so với chủng khác, tương ứng từ 61,1% đến 78,1% 57,2% đến 85,5% 2.4 Thảo luận Dựa vào nghiên cứu trên, khẳng định GAR truyền lợn người, khiến lợn trở thành ổ chứa tiềm cho xuất chủng GAR khác thường lạ người Trên thực tế, chủng G26 tìm thấy gần giống với chủng 57vp7w người Chủng 57vp7w báo cáo chủng người gặp G3P.Tổng hợp lại, phát cho thấy 57vp7w phân loại lại lợn người dòng lợn Ở đây, chứng minh đa dạng di truyền GAR có liên quan đến đợt bùng phát tiêu chảy lặp lặp lại heo trang trại khoảng thời gian năm Sự đa dạng di truyền trang trại đặt thách thức cho việc phát triển phương pháp hiệu phòng chống tiêu chảy nhiễm GAR Ảnh hưởng trình axit hóa, lên men vi khuẩn nhiệt độ tồn đến Rotavirus thức ăn dặm cai sữa 3.1 Khái quát Rotavirus tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp chủ yếu lây lan qua đường phân – miệng Các đối tượng từ người lớn đến trẻ em có khả nhiễm Rotavirus Tuy nhiên việc nhiễm Rotavirus thường gặp trẻ sơ sinh trẻ nhỏ thiếu niên Ăn dặm thời gian đặc biệt nguy hiểm trẻ sơ sinh liên quan đến việc làm giảm đặc tính chống nhiễm trùng sữa mẹ Sự thay sữa mẹ loại thực phẩm thường có lượng thấp tiếp xúc hệ miễn dịch chưa trưởng 16 thành với nguồn lây nhiễm mơi trường Người ta ước tính 15-70% tổng số đợt tiêu chảy trẻ nhỏ liên quan đến thức ăn Rotavirus có khả tồn bền vững mơi trường Chúng sống nhiều tay nhiều ngày bề mặt cứng (sàn nhà, đồ chơi, vật dụng gia đình ) Rotavirus lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa, tồn phân người bệnh truyền nhiễm qua tiếp xúc với tay Việc lên men với vi khuẩn lactic công nghệ thiết lập, nhờ mà hư hỏng vi khuẩn gây bệnh bị ức chế Các nghiên cứu việc sử dụng trình lên men lactic để cải thiện an toàn thức ăn dặm mang lại kết đầy hứa hẹn Sử dụng công thức ưu tiên có độ pH có tác dụng đáng kể lên loại vi khuẩn 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Mẫu Virus: Simian rotavirus SA-11 cung cấp Khoa sinh học, Đại học Surrey Nó tinh chế năm lần cách hạn chế pha loãng cấy vào tế bào MA-104 kiểm tra kính hiển vi điện tử để xác nhận danh tính Tế bào Các tế bào sử dụng thuộc dịng MA-104 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum Nó trồng môi trường MR (Oxoid, London) sử dụng làm nước dùng thạch ủ aerobically 30°C qua đêm 3.2.2 Chuẩn bị thức ăn dặm Gạo Mỹ hạt dài, trấu, xay thô chày cối Huyền phù 5% 10% gạo xay nước cất tạo thành thể tích 100 ml hấp tiệt trùng (10psig/10 phút) 3.2.3 Chuẩn độ virus Các độ pha loãng nối thập phân mẫu môi trường chuẩn độ virus cấy (50µl) vào bốn giếng nhân microtiter chứa đơn lớp tế bào MA-104 Giếng ba giếng cuối dãy trùng với môi trường chuẩn độ virrus không bị nhiễm làm đối chứng Để nhiệt độ phòng 30 phút Ngồi ra, thêm 200µl mơi trường chuẩn độ virus thêm vào giếng, bbịt kín nhựa tự kết dính, ủ 37°C ngày tủ ấm thông thường Giếng kiểm tra kính hiển vi từ ngày thứ trình ủ kết chuẩn độ đọc hiệu ứng tế bào (CPE) vào ngày cuối Các giếng gọi dương tính có đặc điểm cytopathice virus rota SA-11 nhìn thấy đơn lớp Điểm kết thúc tính phương pháp SpearmanKarber Giá trị sau biểu thị tỷ lệ mức độ chủng virus sử dụng 3.2.4 Sự bất hoạt vi rút nhiệt 17 Ở lần lấy mẫu, 0,4 ml lấy từ chai chuyển sang chai tương tự làm lạnh trước nước đá bảo quản 4°C trước chuẩn độ Nơi virus bị bất hoạt dung dịch tinh bột, huyền phù ủ qua đêm 22°C với alpha-amylase (Sigma) 500 đơn vị/ml mẫu sau xử lý- nhẩm trước chuẩn độ Thủ tục làm tăng rõ ràng hiệu giá vi rút hệ số xấp xỉ 10 3.2.5 Axit khử hoạt tính virus Huyền phù virus mơi trường phát triển virus bình thủy tinh điều chỉnh đến độ pH cần thiết Mẫu (0,1ml) loại bỏ định kỳ thêm vào đệm chuẩn độ vi rút (0,9 ml) nhiệt độ phòng (22°C), vừa để làm mát trung hòa mẫu bảo quản 4°C trước chuẩn độ 3.3 Kết Ở 30 40°C, vi rút ổn định 24 giờ.Các tỷ lệ tử vong giảm rõ ràng theo thời gian có lẽ khơng quần thể virus chịu nhiệt nhiều kể từ virus làm cách hạn chế pha loãng để đảm bảo đồng số lượng Ở nhiệt độ cao hơn, q trình khử hoạt tính vi rút diễn nhanh chóng với chu kỳ giảm 3,25 log 60°C phút giảm chu kỳ 4,5 log phút 70 °C Khơng có tác dụng bảo vệ khỏi nguyên liệu thực phẩm rõ ràng SA-11 làm nóng 60°C phút Mức giảm, liên quan đến đối chứng không xử lý, rotavirus ủ nhiệt độ khác pH giá trị điển hình phạm vi thu trình lên men lactic (3.3 4.0) Ở nhiệt độ, virus nhạy cảm với nhiệt pH trung tính, nhạy cảm giá trị pH thấp Ở 30°C, virus tương đối ổn định Sự tiếp xúc virus rota với dịch lọc nuôi cấy L plantarum (Canh thang MRS, pH 3,5) 30 ° C cho kết tương tự mơi trường phát triển vi rút axit hóa nhân tạo với giảm log-0,5 đơn vị sau 23 Mức độ lên men lactic thức ăn dặm kiểm soát lây truyền vi rút rota phụ thuộc nhiều cách thức lên men kết hợp vào thực phẩm có thực hành chuẩn bị ô nhiễm rotaviral giai đoạn giới thiệu Khi đun nóng pH gần trung tính, rotavirus bị phân hủy nhanh hồ hóa điển hình nhiệt độ nung chảy (ví dụ: 60 ° C), hiệu ứng không giảm thiểu diện nguyên liệu thực phẩm.Rotavirus thể tính ổn định cao rõ rệt so với mầm bệnh giá trị pH điển hình trình lên men lactic thực phẩm Kết thu rotavirus ủ diện môi trường nuôi cấy hoạt động L.plantarum dịch lọc nuôi cấy không diện chất kháng virus nào, chất chuyển hóa khác với axit hữu Khả gây chết tăng lên rotavirus đun nóng pH thấp cho thấy tác dụng bảo vệ q trình lên men cải thiện đáng kể thức ăn dặm hâm nóng trước tiêu thụ 18 3.4 Thảo luận Rotavirus có khả tồn bền vững mơi trường, tùy vào nhiệt độ pH khác phát triển củ có khác biệt Quá trình axit hóa, lên men vi khuẩn nhiệt độ có ảnh hưởng đến tồn Rotavirus thức ăn dặm cai sữa cho trẻ em Quan nghiên cứu, ta có thêm hiểu biết, từ có ý đặc biệt kiểm tra chuẩn xác khác khâu sản xuất để tạo sản phẩm khơng nhiễm rotavirus, an tồn cho người sử dụng, cụ thể đối tượng trẻ em, giúp giảm tỉ lệ nhiễm tử vong rotavirus Phát triển phương pháp phục hồi Rotavirus từ bề mặt rau 4.1 Khái quát Simian rotavirus SA-11 sử dụng làm mơ hình cho virus rota người, hấp thụ rau diếp tác dụng chất rửa giải khác thử nghiệm để phục hồi Sự phục hồi tối đa virus rota xảy với dung dịch chiết xuất thịt bò 3% pH 8,0 sau phút Phơi bày Nếu tiếp xúc lâu khả phục hồi virut không tăng Khả phục hồi virus rota virus bại liệt loại (LSC) đạt trung bình 80 65% Phục hồi virus rota từ rau không thấp hơn, trung bình 44% cần tây, cà rốt củ cải Phương pháp giúp nhận biết tồn virus rota Rotavirus gây viêm dày ruột đe dọa tính mạng người động vật Mặc dù chúng chủ yếu gây tiêu chảy trẻ em đợt bùng phát nghiêm trọng xảy người lớn (15) Rotavirus tiết với số lượng lớn phân từ người bị nhiễm bệnh (9), cách ly với nước bị ô nhiễm nước thải (13) Cây trồng tưới nước thải thô qua xử lý có khả truyền rotavirus sang người rotavirus tồn q trình xử lý nước thải thông thường (13) Đặc biệt quan tâm loại rau có thời gian sinh trưởng tương đối ngắn (rau diếp củ cải) ăn sống Đã có vài nghiên cứu khả sống sót phục hồi số vi rút đường ruột rau (1,8) Tuy nhiên, xuất tồn vi rút rota nghiên cứu nước (13), phương pháp chưa có sẵn để phục hồi virus rota từ rau Nghiên cứu thiết kế để phát triển phương pháp phục hồi vi rút rota từ rau 4.2 Nguyên liệu phương pháp 4.2.1 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào MA 104 (Sản phẩm sinh học MA, Bethesda, Md.), Là sử dụng cho xét nghiệm vi rút rota Khỉ xanh trâu (BGM) tế bào để xét nghiệm virus bại liệt Các tế bào ni mơi trường thiết yếu tối thiểu (MEM, phịng thí nghiệm Flow # 10-101-22) bổ sung 8% huyết bò thai, 0,075% natri bicarbonat, 100 U 19 penicilin / ml, 100 (JLg streptomycin / ml, 50 ( Đồ gá gentamyc in / ml 25 U mycostatin / ml 4.2.2 Virus Vì khó khăn trình tăng trưởng khảo nghiệm người rotavirus, phương pháp phát triển cách sử dụng virus rotavirus SA-11, có hình thái giống hệt người rotavirus chia sẻ nhiều kháng nguyên, vật lý hóa học tính chất Trước đây, sử dụng mơ hình để phát triển phương pháp phát virus rota người nước (13) Rotavirus SA-11 cung cấp H H Malherbe (11) nuôi cấy tế bào MA 104 Các mẫu vi rút pha loãng trước thử nghiệm dung dịch muối đệm Tris có chứa 1,58 g Trizmabase / L, 4,09 g NaCl / L, 0,18 g KC1 / L, 0,028 g NajPOVL, 0,10 g dextrose / L, 100 U penicillin / ml, 100 (Jig streptomycin / ml 25 U mycostatin / ml Các mẫu vi rút định lượng xét nghiệm mảng bám, sử dụng MA 104 tế bào lớp phủ thạch bổ sung trypsin (ICN, PLAIN VIEW, N.Y.) 15 (jLg / ml DEAEdextran 100 M.g / ml (12) 4.2.3 Rau Rau diếp, cần tây, cà rốt củ cải tươi cho phịng thí nghiệm nghiên cứu thu từ cửa hàng tạp hóa địa phương Tucson, Arizona Xà lách, cần tây, cà rốt cắt nhỏ mảnh có diện tích bề mặt khơng lớn 10 cm2 trước thêm huyền phù vi rút vào bề mặt chúng Củ cải sử dụng rễ củ hoàn chỉnh 4.2.4 Chất rửa giải Bốn chất rửa giải vi rút thường sử dụng để rửa giải vi rút đường ruột từ bề mặt kiểm tra khả khôi phục vi rút từ rau Các chất rửa giải chiết xuất thịt bò 3% (GIBCO, Grand Island, N.Y.), canh 3% tryptose phosphat (TPB) (DIFCO Phịng thí nghiệm, Detroit, Michigan), đệm glycine 0,05 M (BioRad, Richmond, California) nước cất Tất rửa giải mơi trường hịa tan nước cất Giá trị pH chất rửa giải điều chỉnh đến mức thích hợp với 1/ V natri hiđroxit 4.2.5 Rửa giải vi rút từ rau Hai mươi gam rau cho vào bình 100 ml huyền phù vi rút SA-11 (chứa 103 đến 104 PFU / ml đệm Tris) thêm vào Điều sau bị rung chuyển cách máy móc 20 phút phép vi rút hấp phụ chất lỏng bên gạn lọc Một mẫu lấy từ phần gạn để xác định số lượng vi rút chưa hấp thụ Sự rửa giải vi rút hấp thụ vào rau diếp đánh giá cách trộn 50 ml chất rửa giải với rau diếp khoảng thời gian khác lên đến 60 phút Eluents trung hòa, lọc qua màng lọc kích thước lỗ 0,2 n m, thử nghiệm Tồn quy trình trình bày Hình Cần tây, cà rốt 20 củ cải đánh giá virus rota phục hồi với chiết xuất thịt bò 3% pH 8.0 thời gian tiếp xúc phút 4.2.6 Phân tích liệu Số lượng vi rút hấp thụ chế phẩm rau định ước tính khác biệt số lượng vi rút diện chất cấy ban đầu thêm vào rau số lượng vi rút chất lỏng phía gạn lọc Lượng vi rút rửa giải từ chế phẩm rau bị ô nhiễm biểu thị phần trăm số ước tính hấp thụ Dữ liệu phân tích cách phân tích phương sai nhiều chiều với thử nghiệm chép đĩa nuôi cấy (14) Sự chuyển đổi liệu tới arcsin Vpercent / 100 sử dụng để đáp ứng yêu cầu phân tích phương sai thích hợp (16) Để thuận tiện, số phân tích thực máy tính DEC-10 (Trung tâm Máy tính Đại học Arizona) sử dụng chương trình FACTAN (14) Giới hạn độ tin cậy (CL) Cho ml huyền phù virut + 99 ml đệm tris khuấy vòng 10 phút sau thêm 20g rau vào để lắc vòng 20 phút mặt mẫu virut sau thêm 50 ml dung dịch rửa giải (pH 8, 9, 10) sau lắc lấy mẫu theo thời gian chu kỳ Trung hòa đến pH 7,2, lọc thơng qua màng kích thước lỗ 0,2 jjim lọc bảo quản - 20 ° C khảo nghiệm Đây quy trình đánh giá khả phục hồi virus rota từ rau 4.3 Kết Ảnh hưởng dung dịch rửa giải độ pH phục hồi rotavirus Bốn chất rửa giải thường sử dụng để phục hồi vi rút đường ruột từ lọc bề mặt rắn khác đánh giá cho phục hồi vi rút từ rau diếp Các chất rửa giải đánh giá 3% chiết xuất từ thịt bò, 3% TPB, 0,05 M đệm glycine, nước cất Chúng đánh giá pH sau Thời gian tiếp xúc 10, 30- 60 phút pH 10 sau 5, 10 15 phút Lượng vi rút rửa giải từ rau diếp pH phụ thuộc vào loại chất rửa giải, thời gian tiếp xúc Xử lý rau diếp bị ô nhiễm chất rửa giải “ở pH 10 phân tích riêng biệt kể từ thời gian tiếp xúc giảm xuống 5, 10 15 phút Phần trăm phục hồi vi rút bị hấp phụ nói chung thấp so với vi rút phân phát pH Tương tác hai chiều thời gian dung dịch rửa giải đáng kể Ở pH 10, ảnh hưởng việc tăng tiếp xúc với vi rút phục hồi rõ rệt so với pH Điều có lẽ phản ánh nhạy cảm ban đầu virus rota đến bất hoạt pH 10” “Phân tích phương sai thực theo sang giai thừa nhân tố với phép thử chép mẫu.” Thời gian tiếp xúc với dung dịch rửa giải ngắn đánh giá sử dụng chiết xuất thịt bò TPB pH Hơn đáng kể virus phục hồi cách sử dụng chiết xuất thịt bò với thời gian phút ngắn so với kết hợp điều trị khác Tương tác đáng kể dung dịch rửa giải thời gian tiếp xúc cho thấy sau 20 phút tiếp 21 xúc, phục hồi vi rút pH 8,0 thấp 10 phút giống chiết xuất thịt bò TPB Sự phục hồi tối ưu virusrota xảy pH 8,0 với soluton chiết xuất từ thịt bò sau tiếp xúc phút Sự tái tạo virus rota từ cần tây, cà rốt củ cải thấp đáng kể so với rau diếp trung bình 44% Phục hồi tối ưu virus bại liệt từ rau diếp xảy sau thời gian tiếp xúc phút với đường tiết bò trung bình 65% 4.4 Thảo luận Rotavirus nhạy cảm với tăng độ kiềm, rửa giải phục hồi virus tương lai pH 8,0 bị ảnh hưởng mạnh lựa chọn chất rửa giải thời gian tiếp xúc Rotavirus nguyên nhân gây tiêu chảy trẻ em ngồi gây bệnh đe dọa tính mạng người lớn Chúng coi nguyên nhân gây nên tiêu chảy số nghiên cứu, gây nhiều đợt bùng phát bệnh viêm dày ruột từ nước tồn giới Chúng tơi điều tra vụ bùng phát từ thực phẩm probable virútrota gây ra, chưa có phương pháp phát chúng thực phẩm Nghiên cứu cung cấp phương pháp phát virusrota thực phẩm phương pháp sử dụng để nghiên cứu xuất virus rota rau tưới nước thải, thời gian sống sót rau, tồn bề mặt thực phẩm, trình điều tra bùng phát thức ăn dày-ruột Nghiên cứu bệnh đường ruột truyền nhiễm Anh: yếu tố nguy liên quan đến rotavirus nhóm A trẻ em 5.1 Khái quát Hơn 140 triệu trẻ em toàn giới bị viêm dày ruột rotavirus năm Đây nguyên nhân hàng đầu gây tử vong tiêu chảy trẻ em nước thu nhập thấp trung bình Nghiên cứu bệnh đường ruột truyền nhiễm (IID) Anh cho thấy rotavirus nhóm A nguyên nhân phổ biến IID trẻ em tuổi Mục đích báo để xác định yếu tố nguy mắc bệnh đường ruột truyền nhiễm (IID) rotavirus nhóm A trẻ em 16 tuổi 5.2 Phương pháp Nghiên cứu báo cáo việc điều tra yếu tố nguy tiềm ẩn IID bị nhiễm rotavirus cộng đồng Anh 70 tình nguyên viên lựa chọn từ khung nghiên cứu thực hành chung Hội đồng Tuyển dụng thực hành so le vòng 18 tháng thực hành thu thập liệu năm Các biểu IID sử dụng nghiên cứu là: người có phân lỏng nôn mửa đáng kể kéo dài tuần, trường hợp khơng có ngun nhân, khơng lây nhiễm biết trước có thời gian khơng triệu chứng tuần Tất trường hợp IID yêu cầu kiểm tra phân 22 Trong trường hợp thành phần nhóm 16 tuổi trình bày với IID tuyển dụng vào nghiên cứu, cha mẹ người giám hộ họ yêu cầu hoàn thành bảng câu hỏi yếu tố nguy mẫu phân đăng lên Leeds Public HealthLaboratory (PHL), nơi mẫu thử nghiệm cho loạt sinh vật toàn diện, bao gồm rotavirus Bảng câu hỏi có mục yếu tố xã hội, chỗ ở, du lịch, tiếp xúc với người bị IID thực phẩm Bảng câu hỏi hoàn thành trước kết điều tra phân biết đến Bảng Các yếu tố phân tích đưa vào cho trẻ 16 tuổi Một phân tích thực 139 cặp 16 tuổi, trả lời bảng câu hỏi yếu tố nguy Phân tích thực cách sử dụng STATA Các biến nghi ngờ có liên quan đến nguy nhiễm rotavirus sở giả thuyết trước phân tích Đối với trẻ em 16 tuổi, bao gồm tầng lớp xã hội, du lịch, bơi lội, chỗ ở, ăn uống tiếp xúc với người có IID (Bảng 1); trẻ em trẻ sơ sinh cho ăn Phân tích ban đầu khơng có thay đổi, sau điều chỉnh yếu tố chỗ (sở hữu, thuê tư nhân, hội đồng th, số phịng hộ gia đình) tiếp xúc với người có IID tiêu thụ thực phẩm Tầng lớp xã hội, yếu tố trung gian cho có ảnh hưởng gián tiếp đến việc tiếp xúc với rotavirus (ví dụ: chỗ ở, du lịch) yếu tố trực tiếp tiếp xúc với người bị IID tiêu thụ thực phẩm Để cho phép khả hiệp hội tìm thấy nhiều thử nghiệm, chúng coi đáng kể mức 1% Các hiệp hội mức độ quan trọng từ 1% - 5% coi đường biên giới báo cáo Phân tích trẻ sơ sinh ban đầu khơng biến đổi, sau điều chỉnh để tiếp xúc với người có IID, số lượng nhỏ Trong trường hợp này, hiệp hội thực mức 5% khơng có nhiều thử nghiệm Các phân số quy dân số (PAF) tính cơng thức: 23 Trong đó: P’ tỷ lệ trường hợp nhóm tiếp xúc OR tỉ số chênh lệch 5.3 Kết Sự phân bố tuổi tất trường hợp kiểm soát 16 tuổi có phân thử nghiệm rotavirus trình bày Bảng Trong số này, liệu trình bày 139 cặp phù hợp, trường hợp kiểm soát 12% cặp cộng đồng 123 cặp tuổi, có 39 trẻ sơ sinh Có chậm trễ trung bình 24 ngày việc tuyển dụng trường hợp kiểm soát họ; 60% kiểm sốt tuyển dụng vịng tháng sau trường hợp họ 80% vòng tháng Sự phân bố trường hợp đạt đỉnh điểm tháng tháng Bảng Tuy nhiên, mối liên hệ đáng kể tìm thấy loại chỗ nhiễm rotavirus (Bảng 3) Thuê chỗ tăng nguy gấp năm lần Nguy sống chỗ cho thuê giảm điều chỉnh số phòng Một số rủi ro nhà th tính cách có chỗ phịng Có gia tăng nguy liên quan đến tiếp xúc với người khác bị viêm dày ruột, không thiết phải gia đình Điều chỉnh tầng lớp xã hội chỗ không ảnh hưởng đến nguy liên quan đến tiếp xúc với người bệnh Du lịch nước làm tăng rủi ro, khơng có ý nghĩa thống kê; có năm trường hợp du lịch nước ngồi PAF để sống chỗ hội đồng thuê 12% PAF để tiếp xúc với người bệnh 48% Do đó, 40% trường hợp phát sinh khơng thể giải thích hai biến số trẻ em 16 tuổi 24 Bảng Các yếu tố nguy mắc IID với rotavirus nhóm A phân người 16 tuổi 5.4 Thảo luận Đây số nghiên cứu mơ tả yếu tố nguy nhiễm rotavirus trẻ em, cộng đồng Kết cho thấy trẻ em 16 tuổi, có nguy mắc viêm dày ruột rotavirus tăng lên rõ rệt liên quan đến loại chỗ ở, đặc biệt nhà hội đồng th nhà có phịng tiếp xúc với người khác bị viêm dày ruột IV KẾT LUẬN Trong thực phẩm nhiều vi sinh vật có hại, chúng ảnh hưởngtoiws chất lượng thực phẩm sức khỏe người Trong đặc biệt có rotavirus loại trội Rotavirus nguyên nhân gây tiêu chảy trẻ em ngồi gây bệnh đe dọa tính mạng người lớn Chúng coi nguyên nhân gây nên tiêu chảy, số loại vi rút gây viêm dày ruột bùng phát từ nước toàn giới Qua nghiên cứu có đóng góp quan trọng chuẩn đốn loại viusrota từ kịp thời ngăn chặn rotavirus cắt khỏi lây lan Virus Rota lây nhiễm mạnh, trẻ nhiễm giai đoạn nhỏ bệnh để lại hậu nặng nề Chính thế, điều quan trọng bậc cha mẹ cần phải bảo vệ cho trẻ sớm tốt trước trẻ có nguy bị virus Rota công Nhưng đến chưa có phương pháp phát chúng thực phẩm Nghiên cứu cung cấp phương 25 pháp phát virusrota thực phẩm phương pháp sử dụng để nghiên cứu xuất virus rota rau tưới nước thải, thời gian sống sót rau, tồn bề mặt thực phẩm Vì cần làm tốt công tác vệ sinh thực phẩm giúp ngăn ngừa bệnh viêm dày-ruột từ vụ ngộ độc thức ăn Tuyên truyền, giáo dục sức khoẻ (vệ sinh chung vệ sinh cá nhân): Vệ sinh nguồn nước, ăn uống theo quy định vệ sinh an tồn thực phẩm khơng ăn loại thịt sống chưa nấu chín, rửa rau trước ăn sống, giáo dục thói quen vệ sinh ăn uống, rửa tay trước ăn Vệ sinh dụng cụ dùng cho trẻ em ăn (đặc biệt trẻ tháng tuổi), người mẹ phải giữ gìn vệ sinh tốt thời kỳ cho bú Vệ sinh phòng dịch: Sát khuẩn, tẩy uế chất thải đồ dùng có liên quan đến bệnh nhân Quản lý phân, xử lý phân thật tốt (dùng hố xí tự hoại, hố xí hai ngăn), khơng dùng phân tươi bón cối, hoa Chủ động cách chủng ngừa vắc xin cách phịng bệnh hiệu Hiện nay, có loại vắc-xin phòng tiêu chảy Rota sử dụng rộng rãi, bao gồm: Vắc-xin Rotarix sản xuất Bỉ Vắc-xin Rotateq sản xuất Mỹ Hai loại vắc-xin sản xuất công ty dược lớn giới đánh giá cao hiệu chủng ngừa Ngoài phát triển thêm nhiều loại vacxin để phòng chống rotavirus 26 ... chất Tầm quan trọng việc nghiên cứu rotavirus Việc nghiên cứu rotavirus có ý nghĩ quan trọng ngành công nghiệp thực phẩm sức khỏe người, rotavirus dễ lây lan từ môi trường vào thực phẩm chúng... nghiên cứu rotavirus là: • Đảm bảo cho thực phẩm đạt chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm, mang tiêu thụ: Rotavirus loại virus dễ lây lan thực phẩm với nhiều tác hại hệ lụy nặng nề Chúng tồn thực phẩm từ... bùng phát bệnh viêm dày ruột từ nước tồn giới Chúng tơi điều tra vụ bùng phát từ thực phẩm probable virútrota gây ra, chưa có phương pháp phát chúng thực phẩm Nghiên cứu cung cấp phương pháp phát