XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH HCV GENOTYPE BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE NS5B

Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định được genotype HCV như phương pháp định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên vạch của Bayer đều dựa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH HCV GENOTYPE BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE NS5B

Sinh viên thực hiện : HOÀNG NGỌC MẠNH Niên khóa : 2009 - 2013

Tháng 6/2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH HCV GENOTYPE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE NS5B

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY HOÀNG NGỌC MẠNH

KS NGUYỄN PHAN THÀNH

Tháng 6/2013

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố

Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô

đã truyền đạt những kiến thức cho em trong suốt 4 năm học

Công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã đồng ý và hỗ trợ tốt trong quá trình thực

tập tại công ty cũng như để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình

Tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô Viện công nghệ sinh học và môi trường, Đại

học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt

thời gian thực tập

PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy và KS Nguyễn Phan Thành đã tận tình hướng

dẫn và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Anh Trần Huỳnh Minh Nhật, chị Thái Ngọc Khánh Linh và các anh chị trong

phòng thí nghiệm công ty Việt Á đã giúp đỡ em nhiều trong quá trình làm thí nghiệm

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 06 năm 2013

Hoàng Ngọc Mạnh

Bệnh xơ gan, ung thư gan đang có dấu hiệu gia tăng đáng báo động trong những năm qua Phần lớn số bệnh nhân tử vong do xơ gan, ung thư gan đều liên quan tới vi-rút viêm gan C Số bệnh nhân mắc các bệnh xơ gan, ung thư gan liên quan tới vi-rút viêm gan C chiếm 80%, số người chết hàng năm do biến chứng xơ gan giai đoạn nặng hoặc ung thư gan Vi-rút viêm gan C là loại virus nguy hiểm Hiện nay trên thế giới có khoảng 2 tỷ người nhiễm virus viêm gan, cứ 12 người thì có 1 người bị viêm gan mạn tính do nhiễm vi-rút viêm gan C Trong những năm gần đây Việt Nam đã trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu thế giới Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn trễ hoặc không xác định chính xác chủng viêm gan C nên việc chữa trị không còn hiệu quả

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định chính xác chủng vi-rút viêm gan C dựa trên vùng gen NS5B Vùng trình tự được xem là có nhiều biến động phù hợp mục tiêu không những xác định kiểu gen mà còn cả đến mức subtype Một quy trình đã được thiết lập bao gồm thực hiện RT-PCR khuếch đại vùng NS5B, giải trình tự, hiệu chỉnh trình tự sau khi giải và xây dựng các cây phân loài Dù mới được thử nghiệm trên số bệnh phẩm ít ỏi (chỉ có 6 mẫu), nhưng quy trình với tính logic khoa học cao sẽ được tiếp tục thử nghiệm với cỡ mẫu lớn hơn trong thời gian tới

Cirrhosis, liver cancer is showing signs of increased alarmingly in recent years The majority of patients die from cirrhosis, liver cancer associated with hepatitis C virus Number of patients with liver cirrhosis, liver cancer associated with hepatitis C virus accounted for 80%, the annual number of deaths due to complications of severe

cirrhosis or liver cancer Hepatitis C virus is a malicious virus Currently in the world there are about 2 billion people infected with hepatitis, then 1 every 12 people who are infected with chronic hepatitis due to hepatitis C virus In recent years, Vietnam has become the country with the incidence of liver cancer leading The majority of patients

to detect the disease in late stage or not accurately identify strains of hepatitis C

treatment should no longer effective

This study was conducted to determine the exact strain of hepatitis C virus based on the NS5B gene Region sequences are considered to be more appropriate target

changes not only identify but also to genotype subtype level A process has been established, including implementation of RT-PCR amplified NS5B regions,

sequencing, sequence editing and after the construction of the plant subspecies

Although a number of patients tested in the small (only 6 samples), but with the

process of scientific logic will be further tested with larger sample sizes in the future

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

DANH SÁCH VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan bệnh viêm gan siêu vi C 3

2.2 Cấu trúc vi-rút HCV 5

2.3 Bộ gen vi-rút HCV 5

2.4 Sự phân bố các kiểu gen và kiểu phụ HCV: 7

2.5 Vai trò của nghiên cứu xác định kiểu gen (genotype) và kiểu phụ (subtype) bao 8

2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi C 8

2.6.1 Phát hiện kháng thể Anti-HCV Error! Bookmark not defined 2.6.2 Các thử nghiệm kháng thể HCV 8

2.6.3 Thử nghiệm số lượng siêu vi 9

2.6.4 Thử Nghiệm Chức Năng và Sinh Hóa của Gan 9

2.6.5 Sinh thiết gan (Liver Biopsy) 10

2.7 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước 10

2.7.1 Nghiên cứu nước ngoài 10

2.7.2 Nghiên cứu trong nước 11

2.8 Định danh HCV dựa vào vùng non-structure NS5B 12

2.8.1 Phương pháp giải trình tự 12

2.8.2 Hiệu chỉnh trình tự (Proofreading) 13

2.8.3 Nghiên cứu phát sinh loài 14

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Phương pháp xây dựng database vùng NS5B HCV genotype 19

3.3.2 Phương pháp thu thập và đánh giá các bộ mồi 20

3.4.4Thực nghiệm 21

3.3.4.1 Thu nhận mẫu 21

3.3.4.2 Ly trích RNA và xác định sự hiện diện của vi-rút HCV 22

Quá trình ly trích RNA từ dịch virus và huyết thanh 22

3.3.4.3 Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách chiết: 23

3.3.4.4 Phản ứng PCR 23

3.3.4.5 Điện di xác định kết quả 24

3.3.4.6 Hiệu chỉnh trình tự 24

3.3.4.7 Dựng cây phả hệ 25

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Kết quả thu thập trình tự xây dựng database cục bộ 26

4.2 Kết quả đánh giá và thiết kế mồi 26

4.3 Kết quả hiệu chỉnh tình tự sau khi giải 28

4.4 Kết quả so sánh với cơ sở dữ liệu Genbank 31

4.4 Kết quả xây dựng cây phân loài xác định subtype 33

4.5 Kết quả xác định subtype 35

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38   

Nu : Nucleotide HCV : Hepatitis C virus

HCC : Hepatocellular carcinoma

HBV : Hepatitis B virus

rNTP : Ribonucleoside triphosphate RNA : Ribonucleic acid

DNA : Deoxyribonucleic acid RNase inhibitor : Ribonuclease inhibitor WHO : World Health Organization Virion: là hạt virus đã đc lắp ráp hoàn chỉnh gồm vỏ protein bao bọc bên ngoài (capsit), bên trong là lõi acid nucleic (genom), ngoài ra còn có một số hợp chất khác như một số có vỏ ngoài (tạo bởi lipit kép+protein) và có thể có thêm gai glicoprotein Versant HCV (Lipa): Phương pháp xác định các kiểu gen HCV bằng hệ thống máy tự động

Chỉ số bootstrap: là tần số xuất hiện của một nhóm trên số lần giản đồ được thiết lập Đơn vị tính là % (phần trăm)

HCC: ung thư gan do viêm gan siêu vi C gây ra

Bảng 3.2 Các bước của phản ứng PCR 17

Bảng 4.1 Vị trí Nu nghi ngờ 23

Bảng 4.2 Kết quả hiệu chỉnh trình tự sau khi giải 25

Bảng 4.3 Độ tương đồng của các mẫu trên cây phả hệ 27

Bảng 4.4 Kết quả phân loại suptype 28

Hình 2.1 Diễn biến bệnh viêm gan C 4

Hình 2.2 Cấu trúc vi-rút HCV 5

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen HCV 6

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quan quy trình xác định kiểu gen HCV 16

Hình 3.2 Hiện tượng gap và đa nu 19

Hình 3.3 Trình tự sau khi giải 20

Hình 3.4 Peak nghi ngờ 20

Hình 3.5 Cách xác định subtype 21

Hình 4.1 Mẫu database cục bộ 22

Hình 4.2 Vùng trình tự đầu của mạch xuôi bị nhiễu tín hiệu 24

Hình 4.3 vùng trình tự đầu của mạch ngược bị nhiễu tín hiệu 24

Hình 4.2 Peak Nu 306, 307, 308 25

Hình 4.2 Cây phân loài 26

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Viêm gan do siêu vi C (HCV) là một bệnh nguy hiểm, khó điều trị vì triệu chứng lâm sàng mơ hồ, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại rất nặng nề: 50%-80% chuyển qua mạn tính, và có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới WHO, trung bình 3% dân số bị nhiễm vi-rút HCV, khoảng 170-200 triệu người Nhiễm mới từ 1-3 trường hợp /100.000 người mỗi năm Việt Nam có tỷ lệ nhiễm HCV chiếm từ 1-5% dân số ước tính khoảng 8 triệu người bị nhiễm virus viêm gan B hoặc C Theo con số thống kê hiện nay thì số người

bị nhiễm đã tăng lên 20 triệu người Trong đó có khoảng 4,5 triệu người nhiễm vi-rút HCV Khoảng 60% trường hợp xơ gan và gần 80% trường hợp ung thư gan sau nhiễm vi-rút viêm gan B hoặc C Ung thư gan là nguyên nhân thứ hai gây tử vong ở nam giới tại Việt Nam Trong khi đó tỉ lệ số người mắc bệnh viêm gan ngày một gia tăng mà chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và chi phí điều trị rất cao (WHO, 2002)

Vì vậy, việc xác định, định lượng cũng như định được type của HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó mới lựa chọn phương pháp điều trị, theo dõi diễn tiến và phòng ngừa sự lây lan của vi rus HCV

Ðể chẩn đoán viêm gan do siêu vi C, ngoài các xét ngiệm đánh giá chức năng gan, siêu âm thì các xét nghiệm tìm HCV giữ một vai trò rất quan trọng Vì điều trị đặc hiệu HCV rất tốn kém và có tác dụng phụ, cho nên trước khi tiến hành điều trị ta nên đánh giá khả năng điều trị thành công cao hay thấp Hai yếu tố giữ vai trò quan trọng trong đáp ứng điều trị là số lựơng virus và loại (type) vi-rút

Hiện nay đã có nhiều phương pháp xác định được genotype HCV như phương pháp định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên vạch của Bayer đều dựa trên một đoạn nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’-NC Đây

là cả hai phương pháp được y học chấp nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng Phương pháp InoLIPA kém hơn phương pháp giải trình tự vì có nhiều trường hợp không thể phân biệt được các subtype Vì phương pháp này phải thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả năng bị ngoại nhiễm là khá cao, đây chính là lí do giải thích được tại sao có khá nhiều trường hợp InoLIPA có

kết quả không thể xác định được genotype Phương pháp giải trình tự trên vùng 5’NC cũng được tiến hành để xác định type HCV nhưng người ta thấy rằng giải trình tự trên vùng 5’NC để xác định kiểu gien không thể phân biệt genotype 6 và genotype 1 Mà type 6 thường xuất hiện ở các nước Đông Nam Á (Nguyễn Thanh Bảo và Phạm Hùng Vân 2008.)

Bên cạnh đó, có một số nhà nghiên cứu cho rằng nếu định genotype bằng giải trình

tự vùng 5’-NC sẽ không cho kết quả chính xác mà phải giải trình tự vùng NS5B trên

bộ gen của HCV Một số y văn trên thế giới chứng minh rằng nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ có thể phân biệt được các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’-

NC, cũng như là phân biệt được type 6 với subtype 1bhay 1a và 1b chính xác hơn

(Laperche S 2005, Jean-Jacques Lefrère 2005)

Vì vậy đề tài này được xây dựng nhằm xác định type HCV dựa trên vùng NS5B của virus HCV.

1.2 Yêu cầu đề tài

Giải trình tự gene NS5B và xác định các genotype của virus HCV bằng phương pháp phả hệ phân tử nhằm phục vụ cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh viêm gan do vi-rút HCV gây ra tại Việt Nam

1.3 Nội dung đề tài

Sau khi giải trình tự vùng gen này và hiệu chỉnh vùng gen sau khi giải

Thu thập trình tự mẫu trên cơ sở dữ liệu sinh học, tiến hành dựng cây phân loài cùng với bộ mẫu đã thu thập và chọn lọc trên các cơ sở dữ liệu sinh học

Xác định chủng vi-rút có trong mẫu bệnh phẩm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan bệnh viêm gan siêu vi C

Vào năm 1970 Harvay J A chứng minh là nhiễm virus sau truyền máu phần lớn là

do vi-rút viêm gan không phải A và cũng không phải B được đặt tên là vi-rút không A không B 17 năm sau Houghton M và cộng sự dùng sinh học phân tử để tạo dòng và xác định chính xác vi-rút không A không B Năm 1989, vi-rút gây viêm gan không A không B có tên chính thức là vi-rút viêm gan C Hiện nay y học đã xác định vi-rút HCV được phân làm 6 genotype Trong từng genotype, HCV lại được phân thành các subtype Như genotype 1 có các subtype là 1a, 1b, 1c Genotype 2 có các subtype là 2a, 2b, 2c Genotype 1-3 phân bố khắp toàn cầu, trong đó subtype 1a và 1b thường gặp nhất, chiếm 60% trường hợp nhiễm HCV và khó chữa trị hơn (Colin Tidy, 2012) HCV xâm nhập thẳng vào cơ thể qua máu, rồi tấn công tế bào gan và nhân lên tại đây HCV làm cho tế bào gan bị viêm và đồng thời giết các tế bào gan Có đến 80% những người bị nhiễm HCV có khả năng trở thành bệnh mãn tính - có nghĩa là 6 tháng sau khi bị nhiễm, bệnh vẫn không hết Ða số những người bị HCV mãn tính không thấy có triệu chứng nào và vẫn có cuộc sống bình thường Tuy nhiên, trong số 10 - 25% người có HCV mãn tính, bệnh sẽ âm thầm tiến triển trong khoảng 10 - 40 năm,

và có thể làm hư gan trầm trọng, xơ gan, hoặc ung thư gan Hiện nay bệnh viêm gan C

là nguyên nhân hàng đầu đưa đến việc thất bại trong thay ghép gan tại Hoa Kỳ Cho đến nay chưa có vacine đặc hiệu đối với căn bệnh này Tuy nhiên đã có nhiều phương pháp trị liệu được áp dụng có thể tiêu diệt hoặc làm chậm lại sự phát triển của siêu vi HCV cho một số bệnh nhân Những nghiên cứu gần đây cho thấy HCV có thể tồn tại trong môi trường, ở nhiệt độ phòng ít nhất 16 giờ nhưng không lâu quá 4 ngày Sau khi

bị nhiễm HCV, thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ 2 đến 26 tuần, trung bình từ 7 đến 9 tuần (Colin Tidy, 2012)

2.2 Diễn tiến bệnh viên gan siêu vi C

- Giai đoạn đầu gọi là nhiễm trùng cấp tính : thường chấm dứt sau 2 đến 12 tuần, phần lớn bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng trong khi một số khác có triệu chứng giống như bị cảm cúm nhẹ như buồn nôn, mệt mỏi, sốt, nhức đầu, ăn không

ngon, đau vùng bụng, và nhức bắp thịt hay ở khớp, có thể vàng da, vàng mắt, nước tiểu đậm màu Chẩn đoán bệnh dựa vào xét nghiệm máu

- Nhiễm trùng mãn tính: Khoảng 80% trường hợp, cơ thể của họ không đào thải được hết vi-rút sau 6 tháng, nên chuyển thành viêm gan mãn tính Ðặc điểm nổi bật của bệnh viêm gan C mạn tính là sự tiến triển rất thầm lặng qua 10-30 năm, vì thế người bệnh thường không được chẩn đoán và điều trị kịp thời Tỉ lệ nhiễm HCV đưa đến xơ gan 15-20% sau 20 năm, tỉ lệ càng tăng nếu thời gian nhiễm càng lâu.Trong nhóm bệnh nhân xơ gan do HCV, mỗi năm 1.4-3.3% chuyển sang ung thư gan và 2.6-4% tử vong (Stephen L Chen, 2006)

Hình 2.1 Các giai đoạn chuyển biến bệnh viêm gan C

2.3 Các đường lây truyền chính của siêu vi viêm gan C

- Sử dụng kim chích chung

- Quan hệ tình dục với người bị viêm gan siêu vi C

- Truyền máu và các chế phẩm của máu nhiễm siêu vi viêm gan C

- Từ mẹ bị viêm gan siêu vi C qua con

- Không rõ đường lây truyền

(Colin Tidy, 2012)

80% không triệu chứng 20% có triệu chứng

Nhiễm SVC cấp

60-70% viêm gan mạn sau 10 năm

80-90% viêm gan C mãn tính 10-20% hồi phục

20% sơ gan sau 20 năm 15% ung thư gan sau 30 năm

2.2 Cấu trúc vi-rút HCV

Hình 2.2 Cấu trúc vi-rút HCV

(Lindenbach et al, 2006)

HCV là loại vi rút hướng gan dưới kính hiển vi điện tử người ta phát hiện HCV có

hình cầu, đa diện hoặc hình que, kích thước nhỏ 55-65nm và có các vỏ ngoài với các gai nhỏ khoảng 6nm được cấu tạo bằng glycoprotein, bao quanh một nucleocapsid 30-

35 nm có cấu trúc đối xứng 20 mặt Các thể hình cầu HCV có mặt trong hệ tuần hoàn dưới dạng các phức hợp miễn dịch hoặc kết hợp với lipoprotein huyết thanh

- Vùng mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’ Vùng này chỉ có một khung đọc mở duy

nhất gồm 9379-9481 nucleotide Khung đọc mở duy nhất này được dịch mã và tiến hành sản xuất một sản phẩm protein duy nhất, mà sau đó được tiếp tục xử lý

để sản xuất các protein hoạt động nhỏ hơn

- Đầu 3’ không mã hóa 3 'UTR chứa khoảng 225 nucleotide, bao gồm ba cấu trúc

vòng lặp SL1, SL2 và SL3 3 'UTR tương tác với NS5B RdRp và với hai trong số bốn cấu trúc vòng lặp ổn định nằm ở đầu 3' của trình tự NS5B

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen HCV (Mónica Anzola và cvt, 2003).

Các protein cấu trúc bao gồm:

- E1: Là glycoprotein xuyên màng đóng vai quan trọng trong nhập bào tạo điều kiện cho các phản ứng tổng hợp

- E2: Đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm vào tế bào chủ Vi-rút xâm nhập tế bào thông qua sự tương tác E2 với một hoặc một số thành phần của phức hợp thụ thể (Chevaliez S, Pawlotsky JM 2006)

Các protein không cấu trúc bao gồm:

- NS2: là một protein màng đóng vai trò là một protease và tương tác với các protein tế bào chủ

- NS3: là protein có đầu N serine protease hoạt động và đầu C chứa NTPase /

helicase hoạt động Nằm trong mạng lưới nội chất và tạo thành một phức hợp

heterodimeric với NS4A

- NS4B: là protein màng, nằm trong mạng lưới nội chất và đóng một vai trò quan

trọng đối với việc thu nhận các protein virus khác Nó tạo ra những thay đổi về

hình thái đối với mạng lưới nội chất tạo thành một cấu trúc gọi là hệ thống màng

- NS5A: là một phosphoprotein, đóng vai trò quan trọng trong việc nhân lên của

virus, điều khiển các phản ứng interferon Nó có nguồn gốc từ một polyprotein lớn được dịch từ bộ gen HCV, và tiếp tục được xử lý bởi protein 3(NS3)

protease (Chevaliez.S và Pawlotsky.JM 2006)

Rfd RNA virut viêm gan C

      5’NTR protein cấu trúc protein phi cấu trúc 3’NTR

- NS5B: có chức năng quan trọng của sao chép RNA của HCV bằng cách sử dụng

các sợi RNA dương làm mẫu và xúc tác các phản ứng triphosphate

ribonucleoside (rNTP) khi sao chép RNA Protein do NS5B mã hóa giữ vai trò sao chép RNA virus, không có hoạt tính sửa sai nên bộ gene HCV có khả năng mang nhiều sai sót qua các lần sao chép, vì thế đặc tính khá quan trọng của HCV

là tính biến động di truyền cao Tuy nhiên tính biến động này phân bố không đồng đều trên bộ gen. (Chevaliez S, Pawlotsky JM 2006) Cụ thể:

Tính biến động cao ở vùng không mã hóa vỏ ngoài E1 (31-47%) và E2/NS1 43%), cao nhất ở đoạn vùng siêu biến 1 (HVR1) của E2 (50%)

(29-Tính biến động nhất thấp ở 5’URT (<10%), ở vùng lõi (12-19%) và ở vùng NS3 (20-30%), do chức năng quan trọng của vùng này nên không chịu được nhiều biến dị

So sánh trình tự nucleotid của các HCV – RNA ở những người bị nhiễm HCV từ các vùng địa lý khác nhau người ta thấy có sự khác biệt giữa các chuỗi nucleotid của các virus HCV phân lập được Tuỳ theo mức độ khác biệt này người ta phân loại theo các kiểu gen hoặc các kiểu phụ khác nhau:

- Khi có sự khác biệt >20% về trình tự các nucleotid ở các genome thì chúng thuộc

các kiểu gen (genotype) khác nhau

- Cùng một genotype nhưng có sự khác biệt <20% trình tự nucleotid thì được xếp

thành các kiểu phụ (subtype) khác nhau

Sự xếp loại các kiểu gen (genotype) dựa trên so sánh các vùng khác nhau trên bộ gen Nếu dựa vào vùng 5’ không mã hoá để so sánh thì có 6 kiểu gen, và 11 kiểu phụ khác nhau Nếu dựa vào vùng gen E1 của 51 chủng phân lập khắp thế giới thì ít nhất

có 12 kiểu gen khác nhau

2.4 Sự phân bố các kiểu gen và kiểu phụ HCV

- Kiểu 1a thường gặp ở Bắc Mỹ và Nam Mỹ, Australia

- Kiểu 1b thường gặp ở Châu Âu và Châu Á

- Kiểu 2a thường gặp ở Nhật và Trung quốc

- Kiểu 2b thường gặp ở Mỹ và Bắc Âu

- Kiểu 2c thường gặp ở Tây và Nam Âu

- Kiểu 3a thường gặp ở Australia và Nam Á

- Kiểu 4a thường gặp ở Ai cập và Zaire

- Kiểu 4c thường gặp ở miền trung Châu Phi

- Kiểu 5a thường gặp ở Nam Phi

- Kiểu 6a thường gặp ở Nam Á, Việt Nam

- Kiểu 7a và 7b thường gặp ở Thái Lan

- Kiểu 8a, 8b và 9a thường gặp ở Việt nam

- Kiểu 10a và 11a gặp ở Indonesia

- Kiểu 1b, 2b và 2a chủ yếu gặp ở vùng Viễn đông và miền nam Châu Phi

(Nizar N Zein, 2000)

2.5 Vai trò của nghiên cứu xác định kiểu gen (genotype) và kiểu phụ (subtype)

- Xác định nguy cơ lây nhiễm: Genotype 1b thường gặp ở bệnh nhân được truyền máu, genotype 3a thường gặp ở đối tượng tiêm chích ma túy Hiện nay nhiễm vi rút C genotype 3a gia tăng do số người tiêm chích ma túy tăng lên, còn những người nhiễm HCV genotype 1b thì giảm do tiến bộ trong kỹ thuật truyền máu

- Liên quan giữa genotype và mô học: Genotype 1b có nguy cơ trở thành HCC (ung thư gan) cao gấp 3 lần so với các genotype khác điều này được lý giải là do những người nhiễm genotype 1b thường sớm hơn những người nhiễm genotype 2 và 3 vài thập kỷ Các nghiên cứu ở Ý và Pháp lại thấy các tổn thương mô học độc lập với các genotype

- Genotype và dự đoán đáp ứng với điều trị: Thông tin về genotype rất quan trọng

và được sử dụng để dự đoán kết quả điều trị Tỉ lệ đáp ứng kéo dài khi sử dụng Peginterferon kết hợp với Ribavirin thường cao hơn ở genotype 2, 3 so với genotype1 Genotype 1 được xem là genotype khó khăn nhất với các liệu pháp điều trị hiện nay Genotype 2 và 3 đáp ứng với điều trị hiện nay tốt hơn có thể lên đến 70% - 90% Nhiều ý kiến cho rằng các genotype vi rút viêm gan C khác nhau có thời gian sống khác nhau dẫn đến thời gian và phương pháp điều trị khác nhau Ví dụ như theo giả thiết thì genotype 2, 3 vi rút viêm gan C có đời sống ngắn hơn genotype 1, vì thế sự thải loại genotype 2, 3 thì dễ hơn (Trương Phi Hùng, 2009)

2.6 Các phương pháp thử nghiệm lâm sàng chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi C hiện nay

2.6.2 Các thử nghiệm kháng thể HCV

ELISA II là một cuộc thử nghiệm máu đơn giản để phát hiện kháng thể HCV Kỹ thuật này gồm 3 thành phần chính tham gia: kháng nguyên, kháng thể, chất chỉ thị màu

Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 oxy hóa cơ chất chỉ thị màu từ đó phát hiện vi-rút viêm gan C

Ưu điểm: đơn giản

Nhược điểm: độ đặc hiệu bị giới hạn (chỉ sử dụng 1 epitop – nhận diện kháng nguyên) Phải đánh dấu cho từng kháng nguyên chuyên biệt Phải thử nghiệm nhiều kháng nguyên khác nhau để có độ tin cậy

2.6.3 Thử nghiệm số lượng siêu vi

Một số thử nghiệm máu để đo lường sức hoạt động của gan Chỉ số đo lường phổ thông nhất là ALT và AST (alanine aminotransferase & aspartate aminotransferase -

mà trước đây gọi là SGPT và SGOT) ALT và AST là những enzyme được tiết vào trong máu khi gan bị hư và thường tăng cao ở người bị nhiễm HCV Bệnh nhân bị nhiễm HCV cho chỉ số hai loại men gan này cao, đây là dấu hiệu đầu tiên họ đã bị nhiễm bệnh Những cách đo lường khác là ALK và GGT (alkaline phosphatase & gamma-glutamyl transpeptidase) cũng được sử dụng trong việc thử nghiệm Mức độ bất thường có thể biểu lộ tình trạng xơ gan hoặc ống dẫn mật bị nghẹt, cũng như một

số trường hợp bất thường khác Ngoài ra có thể đo thời gian đông máu bằng phương pháp đo thời lượng "prothrombin" và mức độ mật vàng (bilirubin) Bilirubin là một sắc

tố thường thấy trong máu của người có viêm gan Chất bilirubin cao sẽ gây ra chứng vàng da (Philippe Halfon, 2006)

2.6.4 Thử Nghiệm Chức Năng và Sinh Hóa của Gan

Một số thử nghiệm máu để đo lường sức hoạt động của gan Số đo lường phổ thông nhất là ALT và AST (alanine aminotransferase & aspartate aminotransferase - mà trước đây gọi là SGPT và SGOT) ALT và AST là những chất men (enzymes) được tiết vào trong máu khi gan bị hư và thường tăng cao ở người bị nhiễm HCV Bệnh nhân bị nhiễm HCV cho chỉ số hai loại men gan này cao, đây là dấu hiệu đầu tiên họ

đã bị nhiễm bệnh Những cách đo lường khác là ALK và GGT (alkaline phosphatase

& gamma-glutamyl transpeptidase) cũng được sử dụng trong việc thử nghiệm Mức

độ bất thường có thể biểu lộ tình trạng xơ gan hoặc ống dẫn mật bị nghẹt, cũng như một số trường hợp bất thường khác Ngoài ra có thể đo thời gian đông máu bằng phương pháp đo thời lượng (prothrombin) và mức độ mật vàng (bilirubin) Bilirubin là một sắc tố thường thấy trong máu của người có viêm gan Chất bilirubin cao sẽ gây ra chứng vàng da

2.6.5 Sinh thiết gan (Liver Biopsy)

Sinh thiết (hay thử mẫu tế bào) gan được dùng để đo lường mức độ viêm, số lượng sẹo, và tình trạng sức khỏe của gan Phương pháp này cũng có thể dùng để xác định cách chữa trị (Alan Franciscus 2013)

2.7 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước

Dựa trên mức độ nguy hiểm của vi-rút viêm gan C nên đã có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước được tiến hành nhằm pháp hiện và xác định chủng vi-rút HCV ở mức type và subtype nhằm phục vụ cho việc điều trị

2.7.1 Nghiên cứu nước ngoài

P Halfon (2001) Xác định kiểu gen Virus viêm gan C Dựa trên 5’NC bằng phân tích trình tự (Trugene) Đây là một trong những xét nghiệm kiểu gen thường được sử dụng trên toàn thế giới, trong nghiên cứu này tác giả đã dựa vào bước giải trình tự trên vùng gen NS5B để tính độ chính xác và nhằm so sánh kết quả Phương pháp này không đòi hỏi bước xử lý mẫu bổ sung và sử dụng các sản phẩm thu được từ phản ứng khuếch đại duy nhất, do đó loại trừ sự chậm trễ và nguy cơ ô nhiễm Tuy nhiên, phương pháp này tốn kém đòi hỏi thiết bị đặc biệt Mức độ bảo tồn trong khu vực này không thể phân biệt chủng, như trong trường hợp với phân nhóm 2a và 2c

Nakatani SM và vtc (2010) Thực hiện nghiên cứu xác định genotype viêm gan siêu

vi C dựa trên vùng gen NS5B Trong phương pháp này, tác giả thiết kế mồi bám vào các trong khu vực bảo tồn của vùng gen NS5B Một cặp mồi và ba đầu dò khác nhau được dán nhãn với fluorophore khác nhau được thiết kế để khuếch đại và phát hiện kiểu gen 1a, 1b, 3a Tương tự như vậy tác giả thiết kế mồi và đầu dò tương thích để phát hiện kiểu gen 2a, 2b, và 2c Với 304 mẫu bệnh lâm sàng được sử dụng để so sánh giữa hai phương pháp real - time PCR genotyping với LiPA v 1 Trong số đó có 9 mẫu real-time PCR không khuếch đại được nên xuất hiện 3% kết quả âm tính giả 295 mẫu còn lại cả 2 phương pháp đều cho kết quả như nhau khi xác định ớ mức type Nhưng khi xác định ở mức subtype thì có 68 mẫu phương pháp real-time PCR xác định được còn phương pháp LiPA v 1thì không Real-time PCR genotyping mô tả ở đây cho thấy độ chính xác cao ở cấp subtype, ít bước xử lý và thời gian quay vòng nhanh, chi phí thấp, có thể cung cấp chính xác hơn mối tương quan giữa các kết quả lâm sàng và các kiểu gen khác nhau Nhưng nghiên cứu này chỉ dừng lại ở các subtype 1a, 1b, 3a, 2a,2b, và 2c, không thể khuếch đại 3% số mẫu (9 mẫu) Những kết quả này

cho thấy nếu nhắm mục tiêu vào khu vực có nhiều biến đổi như vùng gen NS5B có khả năng làm suy yếu hiệu quả khuếch đại Những biến đổi tiềm tàng trên vùng gen này có thể làm giảm hiệu năng của mồi PCR và các đầu dò

Sueli M Nakatani và ctv (2011) tiến hành so sánh hiệu năng xác định kiểu gen HCV dựa trên khu vực 5 'UTR với một phần trình tự trên khu vực NS5B của 171 bệnh nhân Brazil mắc bệnh viêm gan C mãn tính Kết quả cho thấy không có sự khác biệt trong việc phân loại của tất cả 171 mẫu bằng hai phương pháp phân tích trình tự NS5B và Lipa (5'UTR) Tuy nhiên, sự khác biệt ở cấp subtype đã được tìm thấy tới 47,9% (82/171) Trong đó phương pháp Lipa không thể phân biệt 39,6% (40/101) kiểu gen ở cấp subtype mà chủ yếu là nhầm lẫn giữa subtype 1a, 1b Hiện nay, xét nghiệm dựa trên khu vực 5’UTR chính xác với hơn 95% với các kiểu gen đã được xác định trình tự nucleotide của khu vực NS5B hoặc vùng mã hóa khác của bộ gen HCV (Simmonds P

và ctv,1993 ) Trong nghiên cứu này, phương pháp Lipa và giải trình tự trên vùng gen NS5B cho thấy sự phù hợp 100% xác chính xác các type Tuy nhiên, tùy thuộc vào khu vực địa lý, kiểu gen xác định dựa trên 5'UTR có thể không đáng tin cậy bởi vì một

số kiểu gen 6 biến thể đã được tìm thấy ở Đông Nam Á có trình tự 5'UTR giống hệt các kiểu gen 1a hoặc 1b ( Murphy DG và ctv, 2007)

2.7.2 Nghiên cứu trong nước

song song với những nghiên cứu của thế giới, ở Việt Nam cũng có những đề

nghiên cứu để có khả năng đáp ứng điều trị cho căn bệnh nguy hiểm này

Hồ Tấn Đạt và cộng sự (2005) Xác định HCVRNA bằng kỹ thuật nested PCR cho 327 trường hợp bệnh nhân người Việt Nam Kết quả cho thấy kiểu gen HCV chủ yếu ở người Việt Nam là kiểu gen 1 (Chiếm 58,4%), tiếp theo là kiểu gen 6 (23,9%),

và kiểu gen 2 (13,1%) có 14 trường hợp (4,3%) không xác định được kiểu gen HCV5 Trong nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật bDNA (Khuếch đại tín hiệu) để định lượng siêu vi C trong máu Ưu điểm của kỹ thuật này là tín hiệu nhận được sẽ tuyến tính với

số lượng siêu vi C trong mẫu, từ đó giúp cho việc định lượng chính xác hơn, tuy nhiên lại có một nhược điểm là độ nhạy thấp nên sẽ có một số trường hợp dưới ngưỡng định lượng được mà siêu vi C vẫn còn hoạt động nên vẫn có khả năng lây nhiễm

Nguyễn Thanh Bảo và Phạm Hùng Vân (2008) Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét

nghiệm định gen HCV Nghiên cứu tiến hành trên 2000 mẫu HCV-RNA dương tính và

được xác định genotype bằng cách giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của qui trình qPCR Kết quả định lượng tương ứng với kết quả xác định genotype của 234 mẫu trong 2000 mẫu được phân tích

Phương Thị Hà (2011) Xác định kiểu gen vi-rút viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR Hệ mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV thiết kế đặc trưng cho HCV genotype 1, 2, 3 và 6 Việc bố trí thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự cho các genotype còn lại Kết quả là xác định được genotype của 228 mẫu bệnh Trong số 151 mẫu của bệnh nhân đã xác định

là genotype l lấy ngẫu nhiên 30 trường hợp đem giải trình tự gen trên đoạn NS5b thì thấy tỉ lệ nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 trong 30 mẫu định type bằng phương pháp Real-time PCR với phương pháp giải trình tự gen là 40,74% Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: tiện lợi, nhanh, chi phi thấp phù hợp với đa số điều kiện của bệnh nhân, tuy nhiên không xác định được subtype và nhầm lẫn giữa type 1 và type 6 vì vậy sẽ ảnh hưởng đến kết quả điều trị của bệnh nhân, do các genotype HCV có sự khác nhau về độc lực, khả năng gây bệnh và khả năng đáp ứng điều trị và genotype 1 thường đáp ứng thấp hơn với các genotype khác

2.8 Định danh HCV dựa vào vùng non-structure NS5B

Vùng NS5B thuộc vùng gen không cấu trúc, nằm ở gần đầu 3’UTR.Vùng NS5B có

độ bảo tồn và độ biến động cao, đặc trưng cho từng genotype và có thể dùng để phân biệt đến từng subtype

2.8.1 Phương pháp giải trình tự

Phương pháp giải trình tự vùng NS5B được xem là phương pháp chuẩn để xác định genotype và subtype của virus HCV Hai phương pháp chính được thực hiện là: phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert và phương pháp enzyme học của Sanger sử dụng các dideoxynucleotide và một phương pháp được sử dụng hiện nay là phương pháp giải trình tự bằng máy tự động

Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình

tự gen bằng phương pháp hóa học Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào sự thủy phân phân tử DNA bằng phương pháp hóa học Trước hết, tạo mạch khuôn DNA trên

cơ sở các phân tử DNA được đánh dấu phóng xạ P32 ở đầu 5’ và biến tính phân tử DNA thành các mạch đơn không tự xoắn lại với nhau Sau đó, thực hiện kĩ thuật xử lý

hóa học đặc hiệu để phân cắt các mạch đơn thành các đoạn ngắn hơn kém nhau một nucleotide, từ đó xác định trình tự DNA bằng phương pháp điện di

Ưu điểm: dễ tiến hành, chi phí thấp

Nhược điểm: độ chuẩn xác không cao, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các

sai sót để chọn kết quả gần đúng nhất

Phương pháp enzyme giải trình tự DNA

Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977,

và ngày nay phương pháp này càng được hoàn thiện và thực hiện dễ dàng tại các phòng thí nghiệm.Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ enzyme DNA polymerase Bằng việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide và các nucleotide thông thường, kết quả là sự hình thành tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau Cuối cùng phân tích các đoạn đó qua điện di để xác định trình tự các nucleotide

Ưu điểm: các bước tiến hành đơn giản, có độ chính xác cao và là cơ sở cho máy giải

trình tự gen tự động

Nhược điểm: chỉ đọc được một đoạn trình tự ngắn

Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)

Máy được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng các dNTP do Sanger và cộng sự phát minh Trong quá trình tổng hợp DNA có sử dụng các mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau Tất cả các đoạn cùng kết thúc tại một loại dNTP sẽ cho cùng một màu Sau khi điện di, kết quả sẽ được đưa ra qua một hệ thống máy tính

Ưu điểm: giảm các thao tác, tiết kiệm hóa chất Kiểm soát được các sai sót, đảm bảo

độ chính xác cao và trình tự đọc dài hơn so với 2 phương pháp trên

2.8.2 Hiệu chỉnh trình tự (Proofreading)

Trình tự sau khi được xác định bằng hệ thống máy tự động (như ABI…) chưa thể

sử dụng ngay cho việc phân tích Việc đọc base tự động do các máy thực hiện (automated base-calling) có một tỷ lệ sai sót nhất định tuỳ theo phương pháp và loại máy sử dụng Sự sai sót này xảy ra bởi cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được không phải lúc nào cũng rõ ràng Khoảng cách không đồng đều giữa các mũi tín hiệu cũng như sự chồng lắp các tín hiệu dẫn đến việc máy tính nhận và hiển thị sai kết quả Hiện

tượng này xảy ra do nhiều nguyên nhân như bản chất của trình tự khảo sát, sự nhiễm các mẫu DNA khi thực hiện, thao tác và loại phương pháp giải trình tự sử dụng

Mặc dù những cải tiến về mặt kỹ thuật và thuật toán nhằm cải thiện độ chính xác trong việc đọc các base của máy đang được nghiên cứu tích cực, tuy nhiên tỷ lệ sai sót vẫn có thể xảy ra và khó có thể đọc chính xác tuyệt đối bằng phương pháp tự động Khi một base bị đọc sai có thể dẫn đến nhiều sai lầm nghiêm trọng trong việc phân tích sau này Do vậy, biện pháp hiệu chỉnh lại trình tự cần được thực hiện trực tiếp bằng phương pháp thủ công (quan sát) nhằm khắc phục tối đa việc xác định sai base (Ewing và ctv, 1998)

2.8.3 Nghiên cứu phát sinh loài

Nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loài là một lĩnh vực đã được tìm hiểu từ hàng thế kỷ nay Các nhà hệ thống học luôn cố gắng sử dụng các phương pháp có độ tin cậy cao nhằm mô phỏng, suy luận cây tiến hoá chính xác nhất có thể từ các dữ liệu sinh học Trong những năm trước đây, việc thiếu những tiêu chuẩn khách quan cũng như những phương pháp hỗ trợ đã khiến cho việc xây dựng các mô hình này rất khó khăn Các nghiên cứu thường tập trung xem xét các vấn đề về định nghĩa loài, sự hình thành loài mới mà ít quan tấm đến vấn đề phát sinh loài Ngày nay, việc nghiên cứu phát sinh chủng loài không chỉ dừng lại ở việc mô tả, định danh mà còn góp phần giải thích những quá trình sinh học diễn ra trong tế bào, cơ thể sống hay mối quan hệ giữa các nhóm loài với nhau

Những thành tựu của Sinh học phân tử vào những năm 1960 và sự hỗ trợ của máy tính trong việc phân tích dữ liệu đã giúp đây nhanh việc nghiên cứu phát sinh loài rất nhiều Phản ứng PCR, lai DNA-DNA, kỹ thuật RAPD, hay DNA fingerprinting là những kỹ thuật mới được ứng dụng Bên cạnh đó, những kỹ thuật cũ như điện di dị enzyme hay di truyền học tế bào vẫn tiếp tục được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Và hiện nay, để có thể xây dựng một mô hình phát sinh loài chính xác cần kết hợp nhiều các công cụ với nhau Với những sự kết hợp trên, những kết quả nghiên cứu

có độ tin cậy cao ngày một tăng, cho phép kiểm chứng những giả thuyết phát sinh loài Một trong các mục tiêu xây dựng cây phát sinh chủng loài dựa trên các trình tự phân tử là nhằm tái hiện lại lịch sử tiến hoá của các loài Để có được một cây phát sinh loài chính xác, cần phải nghiên cứu trên nhiều họ gene Ngoài ra, một vấn đề thường gặp phải trong nghiên cứu phát sinh loài dựa vào dữ liệu phân tử là sự đối lập với các

dữ liệu hình thái học Để giải quyết các mâu thuẫn này là cần xem xét khi nào thì đặc tính hình thái hay phân tử phù hợp với vấn đề đặt ra, nghĩa là dữ liệu sau khi phân tích phải tương thích với các dữ liệu khác mà nó có cùng quan hệ (Avise JC.1994)

Để có một nghiên cứu phát sinh loài đầy đủ cần thực hiện những bước cơ bản sau:

Chọn lựa dữ liệu và lấy mẫu đại diện

Nếu mục đích phân tích phát sinh chủng loài chỉ nhằm nghiên cứu trên một họ gene thì việc chọn lựa dữ liệu là điều dễ dàng Tuy nhiên khi quan tâm đến sự phát sinh chủng loài của một nhóm sinh vật thì việc chọn dữ liệu có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều vùng DNA khác nhau Với những loài sinh vật mà người ta cho là có quan hệ gần thì người ta có thể chọn những vùng DNA có độ biến động cao (như intron hay ITS), nhưng với nhóm sinh vật có quan hệ xa thì người ta lại chọn vùng DNA có độ bảo tồn cao (ví dụ ribosomal LSU rDNA, gene mã hóa protein) Nếu việc chọn vùng DNA có độ bảo tồn cao hay độ biến động cao sẽ có thể ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng, vì vậy khuynh hướng hiện nay cũng là khuynh hướng tốt nhất là kết hợp cả hai hướng này cho cùng một nghiên cứu

Trong việc chọn mẫu sinh vật đại diện, người ta có khuynh hướng chọn những loài đại diện sao cho nó thể hiện tính da dạng sinh học tốt nhất có thể Với trường hợp phân tích một họ gene thì 2 điều kiện bắt buộc phải thỏa mãn là: sinh vật chọn lấy mẫu phải đảm bảo tính đa dạng sinh học, gene trực giao và gene đẳng giao (orthologous và paralogous) trong cùng một sinh vật lấy mẫu phải được đọc trình tự đầy đủ

Để xác định hướng tiến hóa, việc thêm nhóm đối chứng (outgroup) có ý nghĩa quan trọng đáng kể Thông thường để tăng độ chính xác của cây tiến hóa, nhóm outgroup được chọn thường là nhóm có quan hệ gần nhất với nhóm đang được phân tích

Đọc trình tự gene, hiệu chỉnh trình tự và sắp cột thẳng hàng

Các phân tích phát sinh chủng loài dựa trên sự khác biệt khi quan sát các trình tự được so sánh thẳng hàng Do đó lỗi trình tự có thể làm cây tiến hóa không chính xác Đặc biệt với trường hợp vùng DNA có độ bảo tồn cao và nhà phân tích chọn mô hình tiến hóa phức tạp thì lỗi trình tự sẽ cho ra kết quả có độ sai khác rất lớn Để tránh trường hợp này, người ta đọc trình tự cả hai sợi để việc hiệu chỉnh sau đó được đảm bảo tính khách quan hơn

Việc sắp cột thằng hàng có thể thực hiện bằng máy tính một cách tự động Tuy nhiên, với những gene hay vùng DNA kém bảo tồn thì quá trình sắp xếp thẳng hàng tự

động rất dễ gây ra lỗi Do đó với gene hay vùng DNA có độ biến thiên cao cần được trực tiếp thực hiện quá trình sắp xếp thẳng hàng bằng mắt Với những vùng không có khả năng sắp xếp thẳng hàng thì cần phải lọai bỏ trước khi đưa vào phân tích

Dò tìm cây tiến hóa tối thích

Các phương pháp suy luận cây phát sinh chủng lòai đã được biết khá rõ hiện nay đều là những phương pháp kết hợp thuật toán dò tìm cây tối thích Tiến trình thực hiện bằng việc dò tìm những cây tiến hóa tối thích, sau đó những cây tiến hóa này được đánh giá dưới những tiêu chuẩn tối ưu chọn trước để cho ra một cây tiến hóa tốt nhất

Về mặt lý thuyết, việc dò tìm được xem là tối ưu là phải dò tìm hết, không bỏ sót Tuy nhiên công việc này sẽ tốn rất nhiều thời gian và đòi hỏi máy tính phải có cấu hình mạnh Do đó trong thực nghiệm người ta chọn hai thuật toán dò tìm cây tiến hóa

đó là thuật toán phân nhánh và giới hạn (branch-and-bound) và thuật toán tự tìm (heuristics) Ngoài ra còn có phương pháp phân rã hình ngôi sao (star decomposition method) ( Nei M 1996)

Phân tích phát sinh chủng loài - Tiêu chuẩn tối ưu

Phương pháp Maximum parsimony giả định rằng cây tiến hóa mô tả tiến trình tiến hóa tốt nhất, các loài ít thay đổi nhất tức là có ít đột biến nhất, vì thế có điểm đánh giá thấp nhất theo một tiêu chuẩn định sẵn Phương pháp dò tìm cây theo thuật toán heuristics thường áp dụng cho phương pháp parsimony

Trong phương pháp khoảng cách (distance method), từng cặp trình tự một sẽ được sắp cột thẳng hàng, khoảng cách di truyền sẽ được tính toán theo từng cặp Để có được cây tiến hóa, phương pháp phân rã hình ngôi sao thường được sử dụng ví dụ phương pháp neighbor-joining Do phương pháp neighbor-joining là một trong những phương pháp nhanh nhất để dò tìm cây tiến hóa nên nó thường được sử dụng để phân tích khối

dữ liệu lớn với nhiều taxa ( Nei M 1996)

Phương pháp Maximum Likelihood - khả năng tối đa là phương pháp tiêu tốn nhiều thời gian nhất nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất Ứng với mỗi mô hình tiến hóa được chọn, phương pháp này sẽ tính tóan khả năng xác suất (dưới dạng – ln L) mà một cây tiến hóa có thể có từ chuỗi trình tự phân tích Cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được chọn Ngoài 3 phương pháp kể trên còn có phương pháp Bayes

Phân tích giá trị bootstrap

Phân tích bootstrap được thực hiện nhằm kiểm tra tính chính xác và độ tin cậy cho từng nhánh trong cây tiến hóa Đầu tiên, các vị trí từ chuỗi trình tự đã sắp xếp thẳng hàng sẽ được đảo chỗ cho nhau một cách ngẫu nhiên để tạo ra nhiều mẫu phụ (gọi là

sự lặp lại bootstrap) Như vậy các mẫu phụ có kích thước giống như mẫu gốc nhưng vị trí thành phần không giống nhau Sau đó các mẫu phụ sẽ được trải qua quá trình phân tích tương tự như mẫu gốc đã trải qua Kết quả từ những mẫu phụ sẽ được dùng để tính toán giá trị support (ủng hộ) cho một nhánh đơn lẻ nào đó Do giá trị support được biểu diễn bằng tỷ lệ % nên ít nhất phải có 100 lần lặp lại, tức 100 lần tạo mẫu phụ Thông thường thì người ta làm với 1000 lần lặp lại Nếu cho giá trị support từ 95% trở lên thì nhánh của nhóm này được cho là được ủng hộ mạnh mẽ (Felsenstein 1985 )

Sử dụng mô hình cây tiến hóa theo mục đích nghiên cứu

Ngay sau khi có kết quả cây tiến hóa, có thể so sánh kết quả với cây tiến hóa từ những nghiên cứu trước Sự sai khác giữa hai cây tiến hóa này có thể giúp việc quyết định chấp nhận kết quả hay quay lại hiệu chỉnh Ngoài ra cây tiến hóa có thể được đưa vào những chương trình xử lý hình ảnh đồ hoạ thông thường để hiệu chỉnh hay làm nổi bật nhóm loài cần chú ý trước khi công bố

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp từ 12/2012 đến 5/2013 tại công ty cổ phần công nghệ Việt Á

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Vật liệu: mẫu huyết thanh từ những bệnh nhân được gửi về từ trung tâm MEDIC

đã xác định Anti HCV dương tính xét nghiệm tại công ty cổ phần công nghệ Việt Á

- Hoá chất dùng trong ly trích RNA tổng số: bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) gồm: Cột lọc RNA, Ống thu nhận (2 ml), Dung dịch đệm 1, Dung dịch đệm 2, Dung dịch đệm 3, Dung dịch đệm 4

- Hoá chất và dụng cụ trong điện di gel TBE: Dung dịch đệm TBE 10X

(Promega), Agarose (Promega), dung dịch nạp mẫu (loading dye) 6X (Promega), dung dịch ethidium bromide (invitrogen), thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas)

- Thiết bị và dụng cụ: Tủ vô trùng, máy ly tâm, tủ -70oC, tủ - 20oC, tủ mát 4oC, máy vi sóng, máy chụp gel, máy PCR, máy vortex, bộ nguồn và bồn điện di, micropipet, máy tính, đầu tip và eppendorf, máy UV, giá để tube, tube

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp này được thực hiện chủ yếu bằng máy tính và phần mềm sinh học phân tử Vì vậy các phần mềm được sử dụng trong nghiên cứu này gồm:

- Phần mềm sắp cột thẳng hàng (SEAVIEW)

- Phần mềm hiệu chỉnh trình tự sau khi giải (Chromas pro)

- Phần mềm xây dựng cây phân loài (MEGA 5.2)

- Phần mềm kiểm tra khả năng, vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩm tạo thành trên vùng NS5B (Annhyb)

Hình 3.1 Sơ đồ tổng quan quy trình xác định kiểu gen HCV

3.3.1 Phương pháp xây dựng database vùng NS5B HCV genotype

- Trên cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen Los Alamos tải danh sách trình tự vùng NS5B HCV, lựa chọn các trình tự đáng tin cậy bằng cách kiểm tra từng trình tự trên ngân hàng gen NCBI Không thu thập những trình tự từ các bài báo

“Unpublished” hoặc ở những tạp chí không uy tín

- Từ cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI, tiếp tục thu nhận thêm các trình tự nucleotide của vùng gen NS5B của các genotype 1, 2, , 6 của HCV virus (chọn các trình tự có đủ độ dài của vùng NS5B cần thiết) Vì theo nhiểu nghiên cứu cho thấy chủng HCV mang subtype 1a,1b và type 6 xuất hiện nhiều ở Châu Á và Việt Nam nên nghiên cứu này tiến hành thu thập những trình tự có subtype từ 1đến 6

- Sau đó các trình tự này được sắp cột thẳng hàng bằng phần mềm SEAVIEW

- Quan sát các trình tự trên cùng một cột, nếu sảy ra hiện tượng đa nu hay các gap phân bố không đều thì phải được xóa bỏ để các trình tự mẫu có sự tương đồng Hiện tượng này được lý giải là do vi-rút nhân lên một cách nhanh chóng mà hệ

Thu nhận

mẫu 

Ly trích mẫu

Thiết

kế mồi (1) 

Sắp gióng cột (6) 

Khuếch đại đoạn gen (2) 

Giải trình

tự (3)

Hiệu chỉnh trình tự (4)

Xây dựng

bộ mẫu(5) 

Dựng cây phả hệ (7) 

Đánh giá kết quả 

(1) Lựa chọn và thiết kế 2-3 mồi

gen lại không có khả năng sửa sai Bên cạnh đó, trình tự gen NS5B là vùng gen

có nhiều biến động của vi-rút HCV

- Sau khi dựng thành công cây phân loại, kiểm tra độ đặc hiệu của cây phân loại bằng cách cho 1 trình tự ngẫu nhiên đã biết trước subtype (trình tự này được lấy trên 1 bài báo tin cậy) sắp gióng cột và vẽ lại 1 cây phân loại mới xem xếp nhóm genotype có phù hợp hay không

3.3.2 Phương pháp thu thập và đánh giá các bộ mồi

Nghiên cứu này sử dụng các bộ mồi cho các phản ứng xác định genotype HCV bằng phương pháp phả hệ phân tử trên vùng NS5B Vì vậy cần tiến hành thu thập, đánh giá hoặc thiết kế cặp mồi mới (nếu cần) bằng các công cụ tin sinh học sau:

- Thu nhận và tham khảo các cặp mồi giải trình tự vùng NS5B từ các bài báo nghiên cứu trước đó trên Pubmed

- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) với các thông số mặc định sẵn trên NCBI: nhằm xác định độ đặc hiệu của bộ mồi tham khảo

- IDT analyzer (www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/): giúp xác định các thông số quan trọng của mồi như kích thước, thành phần GC, nhiệt độ lai, khả năng tạo hairpin loop, primer-dimer, hetero-dimer,

- Annhyb: kiểm tra khả năng, vị trí bắt cặp của mồi và kích thước sản phẩmtạo thành trên vùng NS5B

Sau đó, tiến hành so sánh, nhận xét và đánh giá các cặp mồi của các nhóm tác giả đã

sử dụng hoặc mồi tự thiết kế (nếu cần) Từ đó đưa ra kết luận sử dụng mồi của nhóm tác giả hay mồi tự thiết kế mới

thu thập và tiến hành đánh giá 3 cặp mồi từ các bài báo thực nghiệm trước đó Kết quả đánh giá sơ bộ các thông số vật lý của 3 cặp mồi được thể hiện rõ trong bảng 3.1 Các cặp mồi trên đều được sưu tầm từ các tài liệu tham khảo là các bài báo của các tác giả nước ngoài được đăng trên các tạp chí tin cậy, các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại cho tất cả các kiểu genotype của HCV virus Kích thước sản phẩm của các cặp mồi có được bằng cách kiểm tra sự bắt cặp của mồi với trình tự gen H77 (mã số truy cập: NC_004102) bằng phần mềm Annhyb (bảng 3 phần phụ lục)