XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH HCV GENOTYPE BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE NS5B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH HCV GENOTYPE BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE NS5B Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : HỒNG NGỌC MẠNH Niên khóa : 2009 - 2013 Tháng 6/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH HCV GENOTYPE BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE NS5B Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực PGS.TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY HOÀNG NGỌC MẠNH KS NGUYỄN PHAN THÀNH Tháng 6/2013     LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học Công ty cổ phần công nghệ Việt Á đồng ý hỗ trợ tốt q trình thực tập cơng ty để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Tập thể cán q Thầy - Cơ Viện công nghệ sinh học môi trường, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian thực tập PGS.TS Lê Huyền Ái Thúy KS Nguyễn Phan Thành tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho em suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Anh Trần Huỳnh Minh Nhật, chị Thái Ngọc Khánh Linh anh chị phịng thí nghiệm công ty Việt Á giúp đỡ em nhiều q trình làm thí nghiệm Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 06 năm 2013 Hoàng Ngọc Mạnh i    TÓM TẮT Bệnh xơ gan, ung thư gan có dấu hiệu gia tăng đáng báo động năm qua Phần lớn số bệnh nhân tử vong xơ gan, ung thư gan liên quan tới virút viêm gan C Số bệnh nhân mắc bệnh xơ gan, ung thư gan liên quan tới vi-rút viêm gan C chiếm 80%, số người chết hàng năm biến chứng xơ gan giai đoạn nặng ung thư gan Vi-rút viêm gan C loại virus nguy hiểm Hiện giới có khoảng tỷ người nhiễm virus viêm gan, 12 người có người bị viêm gan mạn tính nhiễm vi-rút viêm gan C Trong năm gần Việt Nam trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu giới Phần lớn bệnh nhân lại phát bệnh giai đoạn trễ khơng xác định xác chủng viêm gan C nên việc chữa trị khơng cịn hiệu Nghiên cứu tiến hành nhằm xác định xác chủng vi-rút viêm gan C dựa vùng gen NS5B Vùng trình tự xem có nhiều biến động phù hợp mục tiêu khơng xác định kiểu gen mà cịn đến mức subtype Một quy trình thiết lập bao gồm thực RT-PCR khuếch đại vùng NS5B, giải trình tự, hiệu chỉnh trình tự sau giải xây dựng phân loài Dù thử nghiệm số bệnh phẩm ỏi (chỉ có mẫu), quy trình với tính logic khoa học cao tiếp tục thử nghiệm với cỡ mẫu lớn thời gian tới ii    SUMMARY Cirrhosis, liver cancer is showing signs of increased alarmingly in recent years The majority of patients die from cirrhosis, liver cancer associated with hepatitis C virus Number of patients with liver cirrhosis, liver cancer associated with hepatitis C virus accounted for 80%, the annual number of deaths due to complications of severe cirrhosis or liver cancer Hepatitis C virus is a malicious virus Currently in the world there are about billion people infected with hepatitis, then every 12 people who are infected with chronic hepatitis due to hepatitis C virus In recent years, Vietnam has become the country with the incidence of liver cancer leading The majority of patients to detect the disease in late stage or not accurately identify strains of hepatitis C treatment should no longer effective This study was conducted to determine the exact strain of hepatitis C virus based on the NS5B gene Region sequences are considered to be more appropriate target changes not only identify but also to genotype subtype level A process has been established, including implementation of RT-PCR amplified NS5B regions, sequencing, sequence editing and after the construction of the plant subspecies Although a number of patients tested in the small (only samples), but with the process of scientific logic will be further tested with larger sample sizes in the future iii    MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii DANH SÁCH VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bệnh viêm gan siêu vi C 2.2 Cấu trúc vi-rút HCV 2.3 Bộ gen vi-rút HCV 2.4 Sự phân bố kiểu gen kiểu phụ HCV: 2.5 Vai trò nghiên cứu xác định kiểu gen (genotype) kiểu phụ (subtype) bao 2.6 Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi C 2.6.1 Phát kháng thể Anti-HCV Error! Bookmark not defined 2.6.2 Các thử nghiệm kháng thể HCV 2.6.3 Thử nghiệm số lượng siêu vi 2.6.4 Thử Nghiệm Chức Năng Sinh Hóa Gan 2.6.5 Sinh thiết gan (Liver Biopsy) 10 2.7 Một số nghiên cứu nước 10 2.7.1 Nghiên cứu nước 10 2.7.2 Nghiên cứu nước 11 2.8 Định danh HCV dựa vào vùng non-structure NS5B 12 2.8.1 Phương pháp giải trình tự 12 2.8.2 Hiệu chỉnh trình tự (Proofreading) 13 2.8.3 Nghiên cứu phát sinh loài 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 iv    3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 18 3.3.1 Phương pháp xây dựng database vùng NS5B HCV genotype 19 3.3.2 Phương pháp thu thập đánh giá mồi 20 3.4.4Thực nghiệm 21 3.3.4.1 Thu nhận mẫu 21 3.3.4.2 Ly trích RNA xác định diện vi-rút HCV 22 Q trình ly trích RNA từ dịch virus huyết 22 3.3.4.3 Kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết: 23 3.3.4.4 Phản ứng PCR 23 3.3.4.5 Điện di xác định kết 24 3.3.4.6 Hiệu chỉnh trình tự 24 3.3.4.7 Dựng phả hệ 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết thu thập trình tự xây dựng database cục 26 4.2 Kết đánh giá thiết kế mồi 26 4.3 Kết hiệu chỉnh tình tự sau giải 28 4.4 Kết so sánh với sở liệu Genbank 31 4.4 Kết xây dựng phân loài xác định subtype 33 4.5 Kết xác định subtype 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .37 5.1 Kết luận 37 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38    v    DANH SÁCH VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ Nu : Nucleotide HCV : Hepatitis C virus HCC : Hepatocellular carcinoma HBV : Hepatitis B virus rNTP : Ribonucleoside triphosphate RNA : Ribonucleic acid DNA : Deoxyribonucleic acid RNase inhibitor : Ribonuclease inhibitor WHO : World Health Organization Virion: hạt virus đc lắp ráp hoàn chỉnh gồm vỏ protein bao bọc bên (capsit), bên lõi acid nucleic (genom), ngồi cịn có số hợp chất khác số có vỏ ngồi (tạo lipit kép+protein) có thêm gai glicoprotein Versant HCV (Lipa): Phương pháp xác định kiểu gen HCV hệ thống máy tự động Chỉ số bootstrap: tần số xuất nhóm số lần giản đồ thiết lập Đơn vị tính % (phần trăm) HCC: ung thư gan viêm gan siêu vi C gây vi    DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.2 Các bước phản ứng PCR 17 Bảng 4.1 Vị trí Nu nghi ngờ 23 Bảng 4.2 Kết hiệu chỉnh trình tự sau giải 25 Bảng 4.3 Độ tương đồng mẫu phả hệ 27 Bảng 4.4 Kết phân loại suptype .28 vii    DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Diễn biến bệnh viêm gan C Hình 2.2 Cấu trúc vi-rút HCV Hình 2.3 Cấu trúc gen HCV Hình 3.1 Sơ đồ tổng quan quy trình xác định kiểu gen HCV 16 Hình 3.2 Hiện tượng gap đa nu 19 Hình 3.3 Trình tự sau giải 20 Hình 3.4 Peak nghi ngờ 20 Hình 3.5 Cách xác định subtype 21 Hình 4.1 Mẫu database cục .22 Hình 4.2 Vùng trình tự đầu mạch xi bị nhiễu tín hiệu 24 Hình 4.3 vùng trình tự đầu mạch ngược bị nhiễu tín hiệu .24 Hình 4.2 Peak Nu 306, 307, 308 25 Hình 4.2 Cây phân lồi 26 viii      Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Xác định xác mức type subtype mẫu bệnh phẩm nhận từ trung tâm y khoa MEDIC Bước đầu xây dựng thành cơng quy trình thực nghiệm định HCV genotype phương pháp giải trình tự vùng gen NS5B kết hợp với phương pháp phả hệ phân tử Tạo tiền đề cho nghiên cứu sau liên quan đến xác định genotype HCV 5.2 Đề nghị Cần tiến hành thu thập thêm trình tự mẫu bổ sung cho database cục Đặc biệt chủng có khả xuất Việt Nam Phân tích thêm nhiều trình tự từ nhiều nguồn khác nhằm đánh giá tồn diện xác hiệu đưa vào thực nghiệm phương pháp giải trình tự NS5B kết hợp phả hệ phân tử xác định genotype HCV 37     TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân 2008 Áp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT Real-time PCR vùng 5’-NC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCV Y học TP Hồ Chí Minh, 13, pp.243-248 Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Thanh Tịng, Nguyễn Bảo Tồn, Phan Hữu Bội Hồn, Nguyễn Bá Tịng, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Đỗ Thị Thùy Trang 2005 Kiểu gen siêu vi vêm gan C Việt Nam Đề tài nghiên cứu khoa hoc Trung Tâm Y Khoa MEDIC, TP Hồ Chí Minh Phương Thị Hà 2011 Xác định kiểu gen virut viêm gan C huyết bệnh nhân viêm gan C kỹ thuật sinh học phân tử Real time – PCR Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên Tài liệu tiếng Anh Andrew S Bae, Karin S Ku, Michael D Miller, Hongmei Mo, and Evguenia S Svarovskaia 2011 lele-Specific Real-Time PCR System for Detection of Subpopulations of Genotype 1a and 1b Hepatitis C NS5B Y448H Mutant Viruses in Clinical Samples Journal of clinical microbiology 3168–3174 Alan Franciscus 2013 An Overview of HCV Diagnostic Tests HCSP FACT SHEET San Francisco 94142-7037 Barnes E Pybus G.O, Taggart R, Lemey P, Markov V.P, Rasachak B, Syhavong B, Phetsouvanah R, Sheridan I, Humphreys S.I, Lu L, Newton N.P and Klenerman P 2008 Genetic history of hepatitis C virus in East Asia Virology 1071 – 1082 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M 1989 Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral patitis genome Science 359-362 Chevaliez S, Pawlotsky JM 2006 HCV Genome and Life Cycle Hepatitis C Viruses: Genomes and Molecular Biology Norfolk (UK): Horizon Bioscience DR Nelson , AH xám, JA Kolberg, J Joh, MS Urdea, M Mizokami, GL Davis, JYN Lau 1995 Variations of hepatitis C virus NS5B sequence (nucleotides 8261–8566) not correlate with response to interferon-α therapy J.Viral Hepat 285-92 10 Duarte CAB, Foti L, Nakatani SM, Riediger IN, Poersch CO, et al 2010 A Novel Hepatitis C Virus Genotyping Method Based on Liquid Microarray PLoS ONE doi:10.1371 11 Colin Tidy 2012 Hepatitis C ADVERTISEMENT.2252 Version: 26 12 Gonzalez Martro, V AJ Buckton, V Saludes, G Fernandez, L Matas, R Planas, V Ausina 2008 Evaluation of a new assay in comparison with 38     reverse hybridization and sequencing methods for hepatitis C virus genotyping targeting both 5′ noncoding and nonstructural 5b genomic regions J.Clin.Microbiol 192 -197 13 Hajime Tokita, Hiroaki Okamoto, Hisao Iizuka, Junichi Kishimoto, Fumio Tsuda, Yuzo Miyakawa and Makoto Mayumi 1998 The entire nucleotide sequences of three hepatitis C virus isolates in genetic groups 7–9 and comparison with those in the other eight genetic groups Journal of General Virology 1847–1857 Printed in Great Britain 14 RC Cheung , SM Matsui , and HB Greenberg 1994 Rapid and sensitive method for detection of hepatitis C virus RNA by using silica particles J Clin Microbiol 2593–2597 15 Jannick Verbeeck, Mark J Stanley, Jen Shieh, Linda Celis, Els Huyck, Elke Wollants, Judy Morimoto, Alice Farrior, Erwin Sablon, Margaret JankowskiHennig, Carl Schaper, Pamela Johnson Marc Van Ranst, Marianne Văn Brussel 2008 Evaluation of Versant Hepatitis C Virus Genotype Assay (LiPA) 2.0 J Clin Microbiol 1901–1906 16 Laperche S, Lunel F, Izopet J, Alain S, Dény P, Duverlie G, Gaudy C, Pawlotsky JM, Plantier JC, Pozzetto B, Thibault V, Tosetti F, Lefrère JJ 2005 Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5′ Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter Study J Clin Microbiol 733–73925 17 L Krekulová, V.Rehák, L.W.Riley 2006 Structure and Functions of Hepatitis C virus Proteins: 15 Year After Folia Microbio 665-680 18 Leonardo Foti Cesar A B Duarte, Sueli M Nakatani, Irina N Riediger, Celina O Poersch, Daniela P Pavoni, Marco A Krieger 2010 A Novel Hepatitis C Virus Genotyping Method Based on Liquid Microarray PloS ONE số e12822 19 Lindenbach et al., 2006 Cell culture-grown hepatitis C virus is infectious in vivo and can be recultured in vitro Proc Natl Acad Sci 3805-9 20 Mónica Anzola and Juan José Burgos 2003 Hepatitis C virus (HCV): model structure and genome organization Molecular Medicine Accession information: Vol 5; 19 21 Michael O Baclig1, Veronica F Chan, John Donnie A Ramos, Juliet GopezCervantes, Filipinas F.Natividad 2010 Correlation of the 5’untranslated region (5’UTR) and non-structural 5B (NS5B) nucleotide sequences in hepatitis C virus subtyping Int J Mol Epidemiol Genet 236-244 22 Nizar N Zein 2000 Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes Clin Microbiol 223–23 23 Nakatani SM, Santos CA, Riediger IN, Krieger MA, Duarte CAB, et al 2010 Development of Hepatitis C Virus Genotyping by Real-Time PCR Based on the NS5B Region PLoS ONE e10150.doi:10.1371 24 P Halfon, P Trimoulet, M Bourliere, H Khiri, V de Lédinghen, P Couzigou, J M Feryn1, P Alcaraz, C Renou, H J A Fleury, and D Ouzan 39     2001 Hepatitis C Virus Genotyping Based on 5′ Noncoding Sequence Analysis (Trugene) J Clin Microbiol vol 39 no 1771-1773 25 Philippe Halfon , Marc Bourlière , Guillaume Peñaranda , Hacène Khiri , and Denis Ouzan 2006 Real-Time PCR Assays for Hepatitis C Virus (HCV) RNA Quantitation Are Adequate for Clinical Management of Patients with Chronic HCV Infection J Clin Microbiol 2507–2511 26 Syria Laperche, Jean-Jacques Lefrère 2005 Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5’ Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter Study Journal of Clinical Microbiology 733-739 27 S Laperche, P Gallian, F Bouchardeau, X de Lamballerie, P de Micco 2006 Analysis of the 5′ Noncoding Region versus the NS5b Region in Genotyping Hepatitis C Virus Isolates from Blood Donors in France antaloube J Clin Microbiol vol 2051-2056 28 Sueli M Nakatani, Carlos A Santos, Irina N Riediger, Marco A Krieger, Cesar AB Duarte, Maria Carmo Debur, Flair J Carrilho4and Suzane K Ono 2011 Comparative performance evaluation of hepatitis C virus genotyping based on the 5' untranslated region versus partial sequencing of the NS5B region of brazilian patients with chronic hepatitis C Virology Journal 459 29 Stephen L Chen and Timothy R Morgan 2006 The Natural History of Hepatitis C Virus (HCV) Infection Int J Med Sci 47–52 30 Tanimoto.T, Nguyen.H.C, Ishizaki.A, Chung.P.T, Hoang.T.T, Nguyen.V.T, Kageyama.S, Oka.S, Pham.V.T and Ichimura.H 2010 Multiple routes of hepatitis C virus transmission among injection drug users in Hai Phong, Northern Vietnam J Med Virol 1355-1363 31 Ulrich PP, Romeo JM, Daniel LJ, Vyas GN 2010 An improved method for the detection of hepatitis C virus RNA in plasma utilizing heminested primers and internal control RNA PCR Methods Appl 241-9 USA 32 Santos C.A, Nakatani S.M, Riadiger I.N, Krieger M.A, Duarte C.A.B, Debur M.D.C, Carilho F.J and One S.K 2011 Comparative performance evalution of Hepatiris C virus genotyping based on the 5’ untranslated region versus partial sequencing of the NS5B region of Brazilian patient with chronic hepatitis C Virology Journal - 459 Tài liệu internet 33 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1629 34 http://www.amvibiotech.com/tin-tuc-chuyen-de/vn/83/417/.html 35 http://www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 36 www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1392686/ 37 http://www.sinhhocvietnam.com 40     PHỤ LỤC Tên mẫu Số lượng Thời gian Địa điểm M1 25/02/2013 trung tâm MEDIC M2 04/03/2013 trung tâm MEDIC M3 12/03/2013 trung tâm MEDIC M4 20/03/2013 trung tâm MEDIC M5 25/03/2013 trung tâm MEDIC M6 09/04/2013 trung tâm MEDIC Bảng Thu nhận mẫu Các bước thực nghiên cứu Bước 1: Xác định mục tiêu: lấy mẫu Bước : Ly trích mẫu Bước 3: Chọn marker phân tử: gen/ protein đặc trưng cho loài, genotype, serotype Bước 4: khuếch đại đoạn gen mục tiêu, gởi giải trình tự với 2, 3, mồi Bước 5: Đọc trình tự hiệu chỉnh trình tự Bước 6: Lựa chọn trình tự tham chiếu từ Genbank, dựa vào báo công bố Bước 7: Sắp gióng cột trình tự phân mềm Seaview bao gồm trình tự: trình tự tham chiếu serotype công bố genbank (chỉ lấy đoạn trình tự khuếch đại lí thuyết - nằm mồi) Bước 8: Kiểm tra lại mẫu (trình tự tham chiếu trình tự giải được): Bước 9: Dựng phả hệ phần mềm Mega 5.2 Bước 10: đánh giá kết     Bảng Kết BLAST mẫu NCBI Kết blast mẫu M1 Kết blast mẫu M2 Kết blast mẫu M3 Kết blast mẫu M4 Kết blast mẫu M5 Kết blast mẫu M6     Bảng Kết đánh giá độ đặc hiệu cặp mồi khuếch đại phần trình tự vùng gen NS5B Primer Kết Blast với trình tự genotype (NC_004102 ) NS5B2F NS5B2R NSNOF NSNOR NS5BF2 NS5BR2 Primer NS5B2F NS5B2R NSNOF NSNOR NS5BF2 NS5BR2   Kết Blast với trình tự genotype (NC_009823)   Primer Kết Blast với trình tự genotype (NC_009827) NS5B2F NS5B2 R NSNOF NSNOR NS5BF2 NS5BR Hình 1. Kết đánh giá cặp mồi NS5BF NS5BR AnnHyb (trình tự gen tham chiếu H77 mã số truy cập NC_004102)     Bảng Các trình tự thu thập sở liệu sinh học Các trình tự thu thập sở liệu sinh học Sube type Ms Kích Quốc thước gia 1a AJ851 228 9481 bp 1a AJ278 830 9610 bp 1a D1074 EF032 886 EF407 422 9502 bp 9328 bp 9333 bp 1a EF407 445 9358 bp 1a AF011 753 9599 bp 1a EF621 489 9599 bp 1a EF407 412 9352 bp 1b AJ000 009 9379 bp Equatori Bracho, M.A (2006) A new subtype of hepatitis C virus al genotype 1: complete genome and phylogenetic relationships Guinea of an Equatorial Guinea isolate J Gen Virol 87 (PT 6), 1697-1702 Anh Kumar Tuthill (2000) Sequence, expression and reconstitution of an HCV genome from a British isolate derived from a single blood donation J Viral Hepat (6), 459-465 Nhật Okamoto, H (1990) The 5'-terminal sequence of the Bản hepatitis C virus genome Jpn J Exp Med 60 (3), 167-177 Brazil Kuntzen, T (2007) Viral sequence evolution in acute hepatitis C virus infection J Virol 81 (21), 11658-11668 Mỹ Donlin, M.J (2007) Pretreatment sequence diversity differences in the full-length hepatitis C virus open reading frame correlate with early response to therapy J Virol 81 (15), 8211-8224 Mỹ Donlin, M.J (2007) Pretreatment sequence diversity differences in the full-length hepatitis C virus open reading frame correlate with early response to therapy J Virol 81 (15), 8211-8224 Mỹ Yanagi, M (1997) Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a Proc Natl Acad Sci U.S.A 94 (16), 8738-8743 Mỹ Sakai, A (2007) In vivo study of the HC-TN strain of hepatitis C virus recovered from a patient with fulminant hepatitis: RNA transcripts of a molecular clone (pHC-TN) are infectious in chimpanzees but not in Huh7.5 cells J Virol 81 (13), 7208-7219 Mỹ Donlin, M.J (2007) Pretreatment sequence diversity differences in the full-length hepatitis C virus open reading frame correlate with early response to therapy J Virol 81 (15), 8211-8224 AUSTR Trowbridge, R (1998) Molecular cloning of an Australian ALIA isolate of hepatitis C virus Arch Virol 143 (3), 501-511 1b D1093 9456 bp Trung Quốc 1a 1a   Nguồn Wang, Y (1993) Prevalence, genotypes, and an isolate (HCC2) of hepatitis C virus in Chinese patients with liver disease J Med Virol 40 (3), 254-260   1b AB016 9538 785 bp 1b EF407 501 9401 bp 1b AJ238 799 9605 bp 1b AJ132 997 9533 bp 1b D9020 9413 bp 1b D5048 9410 bp 1b AB426 9559 117 bp 1b AF139 594 1b AB191 9587 333 bp 1b AY587 9357 845 bp 1c D1485 2a AB047 9683 645 bp 2a AF169 003   9616 bp 9487 bp 9693 bp Nhật Bản Zhang, J (1999) A single nucleotide insertion in the 5'untranslated region of hepatitis C virus leads to enhanced cap-independent translation Virology 261 (2), 263-270 Mỹ Donlin, M.J (2007) Pretreatment sequence diversity differences in the full-length hepatitis C virus open reading frame correlate with early response to therapy J Virol 81 (15), 8211-8224 Đức Lohmann, V (1999) Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line Science 285 (5424), 110113 Đức Rispeter, K (1997) Cloning and characterization of a complete open reading frame of The hepatitis C virus genome in only two cDNA fragments J Gen Virol 78 (PT 11), 2751-2759 NHật Kato, N (1990) A structural protein encoded by the 5' region of the hepatitis C virus genome efficiently detects viral infection Jpn J Cancer Res 81 (11), 1092-1094 NHật Enomoto, N (1995) Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis C virus 1b Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substitutions in the NS5A region J Clin Invest 96 (1), 224230 NHật Kimura, T (2008) Establishment of an infectious genotype 1b hepatitis C virus clone in human hepatocyte chimeric mice J Gen Virol 89 (PT 9), 2108-2113 NHật Beard, M.R (1999) An infectious molecular clone of a Japanese genotype 1b hepatitis C virus Hepatology 30 (1), 316-324 NHật Ikeda, M (2005) Efficient replication of a full-length hepatitis C virus genome, strain O, in cell culture, and development of a luciferase reporter System Biochem Biophys Res Commun 329 (4), 1350-1359 Thụy Kalinina, O (2004) Full-length open reading frame of a Điển recombinant hepatitis C virus strain from St Petersburg: proposed mechanism for its formation J Gen Virol 85 (PT 7), 1853-1857 Indonesi Okamoto, H (1994) The entire nucleotide sequence and a classification of a hepatitis C virus isolate of a novel genotype from an Indonesian patient with chronic liver disease J Gen Virol 75 (PT 3), 629-635 Nhật Kato, T (2001) Sequence analysis of hepatitis C virus Bản isolated from a fulminant hepatitis patient J Med Virol 64 (3), 334-339 Nhật Kurihara, C (2001) Molecular characterization of hepatitis C Bản virus genotype 2a from the entire sequences of four isolates J Med Virol 64 (4), 466-475   2a AF169 002 9661 bp 2a AF169 005 9700 bp 2b D1098 9511 bp 2b AB030 9654 907 bp 2b AY232 9406 749 bp 2c D5040 9513 bp 2j HM77 7358 9112 bp 2k AB031 9488 663 bp 2m JF7351 9618 11 bp 3a D2891 9454 bp 3b D4937 9444 bp 3k D6382 9450 bp 4a Y1160 9355 bp 4a DQ418 9292 782 bp   Nhật Bản Kurihara,C (2001) Molecular characterization of hepatitis C virus genotype 2a from the entire sequences of four isolates J Med Virol 64 (4), 466-475 Nhật Kurihara, C (2001) Molecular characterization of hepatitis C Bản virus genotype 2a from the entire sequences of four isolates J Med Virol 64 (4), 466-475 Nhật Okamoto, H (1992) Full-length sequence of a hepatitis C Bản virus genome having poor homology to reported isolates: comparative study of four distinct genotypes Virology 188 (1), 331-341 Nhật Murakami, K (2001) Down-regulation of translation driven Bản by hepatitis C virus internal ribosomal entry site by the 3' untranslated region of RNA Arch Virol 146 (4), 729-741 Nhật Tanabe, Y (2005) Characteristic sequence changes of Bản hepatitis C virus genotype 2b associated with sustained biochemical response to IFN therapy J Viral Hepat 12 (3), 251-261 Nhật Nakao, H (1996) Full-length genomic sequences of a Bản hepatitis C virus genotype 2c isolate (BEBE1) and the 2cspecific PCR primers Arch Virol 141 (3-4), 701-704 Sulbaran, M.Z (2010) Genetic history of hepatitis C virus in Venezuela: high diversity and long time of evolution of HCV genotype PLoS ONE (12), E14315 Nga Samokhvalov, E.I (2000) Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis C virus variant (isolate name VAT96) representing a new subtype within the genotype (arbitrarily 2k) Virus Genes 20 (2), 183-187 Canada Li, C (2012) Full-length sequences of 11 hepatitis C virus genotype isolates representing five subtypes and six unclassified lineages withunique geographical distributions and genetic variation patterns J Gen Virol 93 (PT 6), 11731184 Nhật Yamada, N (1994) Full-length sequence of the genome of Bản hepatitis C virus type 3a: comparative study with different genotypes J Gen Virol 75 (PT 11), 3279-3284 Nhật Chayama, K (1994) Nucleotide sequence of hepatitis C Bản virus (type 3b) isolated from a Japanese patient with chronic hepatitis C J Gen Virol 75 (PT 12), 3623-3628 Indonesi Tokita, H (1996) Hepatitis C virus variants from Jakarta, a Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups J Gen Virol 77 (PT 2), 293-301 Ai Cập Chamberlain, R.W (1997) Complete nucleotide sequence of a type hepatitis C virus variant, the predominant genotype in the Middle East J Gen Virol 78 (PT 6), 1341-1347 Msỹ Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337   4a DQ418 9253 783 bp Mỹ Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337 4a DQ418 9298 784 bp Mỹ Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337 4a DQ418 788 DQ418 787 DQ418 789 DQ418 786 Y1318 9306 bp 9307 bp 9295 bp 9273 bp 9343 bp Mỹ 5a AF064 490 9408 bp DQ278 9448 892 bp 6c EF424 629 9459 bp 6d D8426 9615 bp 6e DQ314 9468 805 bp 6f DQ835 9454 760 bp 6f DQ835 9454 764 bp 4a 4a 4d 5a   Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337 Mỹ Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337 Mỹ Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337 Mỹ Timm, J (2007) Characterization of full-length hepatitis C virus genotype sequences J Viral Hepat 14 (5), 330-337 Nam Phi Chamberlain, R.W (1997) The complete coding sequence of hepatitis C virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa Biochem Biophys Res Commun 236 (1), 4449 Nam Phi Bukh, J (1998) Experimental infection of chimpanzees with hepatitis C virus of genotype 5a: genetic analysis of the virus and generation of a standardized challenge pool J Infect Dis 178 (4), 1193-1197 Trung Lu, L (2005) Hepatitis C virus genotype distribution in Quốc China: predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype variants J Med Virol 75 (4), 538-549 Thái lan Lu, L (2007) Complete genomes of hepatitis C virus (HCV) subtypes 6c, 6l, 6o, 6p and 6q: completion of a full panel of genomes for HCV genotype J Gen Virol 88 (PT 5), 1519-1525 Việt Tokita, H (1998) The entire nucleotide sequences of three Nam hepatitis C virus isolates in genetic groups 7-9 and comparison with those in the other eight genetic groups J Gen Virol 79 (PT 8), 1847-1857 Trung Li, C (2006) Complete genomic sequences for hepatitis C Quốc virus subtypes 6e and 6g isolated from Chinese patients with injection drug use and HIV-1co-infection J Med Virol 78 (8), 1061-1069 Thái lan Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Thái lan Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518   6g DQ314 9462 806 bp 6g D6382 9461 bp 6h D8426 9621 bp 6i DQ835 9458 762 bp 6i DQ835 9447 770 bp 6j DQ835 9442 761 bp 6j DQ835 9454 769 bp 6k DQ278 9430 893 bp 6k DQ278 9440 891 bp 6k D8426 9601 bp 6l EF424 628 9453 bp 6m DQ835 9444 767 bp   Trung Quốc Li, C (2006) Complete genomic sequences for hepatitis C virus subtypes 6e and 6g isolated from Chinese patients with injection drug use and HIV-1co-infection J Med Virol 78 (8), 1061-1069 Indonesi Tokita, H (1996) Hepatitis C virus variants from Jakarta, a Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups J Gen Virol 77 (PT 2), 293-301 Việt Tokita, H (1998) The entire nucleotide sequences of three nam hepatitis C virus isolates in genetic groups 7-9 and comparison with those in the other eight genetic groups J Gen Virol 79 (PT 8), 1847-1857 Thái Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus Lan subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Thái Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus Lan subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Thái Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus Lan subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Thái Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus Lan subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Trung Lu, L (2005) Hepatitis C virus genotype distribution in Quốc China: predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype variants J Med Virol 75 (4), 538-549 Trung Lu, L (2005) Hepatitis C virus genotype distribution in Quốc China: predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype variants J Med Virol 75 (4), 538-549 Việt Tokita, H (1998) The entire nucleotide sequences of three Nam hepatitis C virus isolates in genetic groups 7-9 and comparison with those in the other eight genetic groups J Gen Virol 79 (PT 8), 1847-1857 Mỹ Lu, L (2007) Complete genomes of hepatitis C virus (HCV) subtypes 6c, 6l, 6o, 6p and 6q: completion of a full panel of genomes for HCV genotype J Gen Virol 88 (PT 5), 1519-1525 Thái Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus Lan subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5),   6m DQ835 9449 765 bp Thái Lan 6m DQ835 9449 766 bp Thái Lan 6m DQ835 9450 763 bp Thái Lan 6n DQ278 9441 894 bp Trung Quốc 6n DQ835 9447 768 bp Thái Lan 6o EF424 627 9450 bp Canada 6p EF424 626 9453 bp Canada 6q EF424 625 9463 bp Canada 6t EF632 069 9460 bp Việt Nam 6t EF632 070 9445 bp Việt Nam 6t EF632 071 9406 bp Việt Nam   1505-1518 Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Lu,L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Lu, L (2005) Hepatitis C virus genotype distribution in China: predominance of closely related subtype 1b isolates and existence of new genotype variants J Med Virol 75 (4), 538-549 Lu, L (2007) Complete genomes for hepatitis C virus subtypes 6f, 6i, 6j and 6m: viral genetic diversity among Thai blood donors and infected spouses J Gen Virol 88 (PT 5), 1505-1518 Lu, L (2007) Complete genomes of hepatitis C virus (HCV) subtypes 6c, 6l, 6o, 6p and 6q: completion of a full panel of genomes for HCV genotype J Gen Virol 88 (PT 5), 1519-1525 Lu, L (2007) Complete genomes of hepatitis C virus (HCV) subtypes 6c, 6l, 6o, 6p and 6q: completion of a full panel of genomes for HCV genotype J Gen Virol 88 (PT 5), 1519-1525 Lu, L (2007) Complete genomes of hepatitis C virus (HCV) subtypes 6c, 6l, 6o, 6p and 6q: completion of a full panel of genomes for HCV genotype J Gen Virol 88 (PT 5), 1519-1525 Lu, L (2008) Complete genomes of three subtype 6t isolates and analysis of many novel hepatitis C virus variants within genotype J Gen Virol 89 (PT 2), 444-452 Lu, L (2008) Complete genomes of three subtype 6t isolates and analysis of many novel hepatitis C virus variants within genotype J Gen Virol 89 (PT 2), 444-452 Lu, L (2008) Complete genomes of three subtype 6t isolates and analysis of many novel hepatitis C virus variants within genotype J Gen Virol 89 (PT 2), 444-452     ... 2.8.1 Phương pháp giải trình tự Phương pháp giải trình tự vùng NS5B xem phương pháp chuẩn để xác định genotype subtype virus HCV Hai phương pháp thực là: phương pháp hóa học Maxam-Gilbert phương pháp. .. cứu cho định genotype giải trình tự vùng 5’-NC khơng cho kết xác mà phải giải trình tự vùng NS5B gen HCV Một số y văn giới chứng minh định genotype HCV vùng NS5B phân biệt subtype tốt dựa vùng 5’NC,... nhiều phương pháp xác định genotype HCV phương pháp định genotype HCV kỹ thuật giải trình tự Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai vạch Bayer dựa đoạn nucleotide đặc hiệu vùng 5’-NC Đây hai phương pháp