XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: ĐỖ PHONG LƯU Niên khóa: 2006 – 2010 Tháng 7/ 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHỤC HỒI GIỐNG LAN Mokara DÒNG ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực ThS Nguyễn Xuân Dũng Đỗ Phong Lưu KS Nguyễn Phúc Trường Tháng 7/ 2010   LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: ¾ Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập ¾ Các thầy Bộ môn Công nghệ Sinh học thầy cô trực tiếp giảng dạy suốt bốn năm qua ¾ Trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP HCM, đặc biệt phòng Cơng nghệ Sinh học Thực vật tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành khóa luận ¾ ThS Nguyễn Xn Dũng CN Nguyễn Phúc Trường tận tình hướng dẫn động viên thời gian thực đề tài tốt nghiệp ¾ Anh Lâm Vỹ Nguyên chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM giúp đỡ em nhiều suốt trình em thực đề tài tốt nghiệp ¾ Bạn Nguyễn Thị Hoa Thùy toàn thể lớp DH06SH thân yêu hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài ¾ Thành kính ghi ơn ba mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Tháng 07 năm 2010 Đỗ Phong Lưu   i   TÓM TẮT Đề tài thực Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp.HCM lan Mokara dòng Đỏ quặt in vitro Ngọn khảm vàng lan Mokara dòng Đỏ quặt in vitro virus tạo từ chồi nhiễm virus phương pháp xử lý nhiệt kết hợp ni cấy đỉnh sinh trưởng Đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,5 - mm, sau tách nuôi cấy môi trường Knudson C điều kiện nuôi cấy lỏng lắc Việc tái sinh chồi thực môi trường MS với nồng độ BA NAA tương ứng với tỉ lệ 2,5 : 0,5 (µg/l) Kiểm tra bệnh cụm chồi tái sinh sau 70 ngày nuôi cấy Những kết thu được: Bước đầu xác định mức độ ảnh hưởng trình xử lý nhiệt đến chồi lan Mokara dòng Đỏ quặt (Mokara cv Do La Quat) thông qua việc xử lý nhiệt 370C bể điều nhiệt cụm chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro tháng tuổi, cao từ 2- 3cm Các chồi lan Mokara dòng Đỏ quặt in vitro có xử lý nhiệt khơng xử lý nhiệt tiến hành cô lập đỉnh sinh trưởng Các đỉnh sinh trưởng lập thành cơng kích thước 0,5 - 1mm Tiến hành khảo sát tìm mơi trường ni cấy thích hợp cho phát triển đỉnh sinh trưởng cô lập từ chồi lan Mokara dòng Đỏ quặt (Mokara cv Do La Quat) Qua q trình ni cấy tạo lan Mokara dòng Đỏ quặt in vitro bệnh virus từ nguồn mẫu nhiễm bệnh cách kiểm tra đánh giá bệnh (loại trừ virus) chồi/ cụm chồi tái sinh   ii   SUMMARY "THE CONSTRUCTING OF THE PROCESS TO EXCLUDE CyMV FROM THE VIRUS INFECTED MOKARA cv DO LA QUAT BY THE MERISTEM CULTURED TECHNIQUE" Topic was conducted from 01/02/2010 to 01/07/2010 in the Biotechnology Center of Ho Chi Minh City with Mokara cv Do La Quat in vitro orchid The virusfree shoot tip was made from the infected shoots of the in vitro orchid plant by heating treatment method combined meristem culture The meristem in size from 0.5 to mm, after separated, were cultured on Knudson C medium in the liquid shake cultured conditions The regenerated shoots were cultured on MS medium with BA 2,5 mg/l and NAA 0,5 mg/l The last step, checking the virus-free of the in vitro regenerated shoots after 70 days culture The results: Determine the influence of heat treatment process to Mokara cv Do La Quat in vitro buds The meristem was isolated successfully from Mokara cv Do La Quat in vitro buds Finding the appropriate culture medium for the development of meristem separated from Mokara cv Do La Quat in vitro buds Checking and estimating the virus- free status (excluding virus) of regenerated shoots Producing the virus- free Mokara cv Do La Quat orchidaceous in vitro strain from the infected virus sources   iii   MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình sơ đồ vii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Cơ sở tiến hành ý nghĩa nghiên cứu 1.2 Yêu cầu Nội dung thực Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược lan Mokara 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc 2.1.3 Sự phân bố 2.1.4 Đặc điểm hình thái sinh trưởng 2.2 Đặc điểm thực vật học sinh thái lan Mokara 2.2.1 Đặc điểm thực vật học 2.2.2 Đặc điểm sinh thái 2.3 Một số bệnh thường gặp lan Mokara 2.4 Sơ lược virus thực vật   iv   2.4.1 Hình thái virus thực vật 2.4.2 Cấu tạo 2.4.2 Sự di chuyển virus 2.5 Sơ lược virus gây bệnh lan 2.6 Cymbidium mosaic virus (CyMV) 10 2.6.1 Nguồn gốc cấu tạo 10 2.6.2 Triệu chứng Cymbidium mosaic virus (CyMV) lan 11 2.7 Giới thiệu sơ lược RT-PCR 12 2.7.1 Định nghĩa 12 2.7.2 Nguyên tắc phương pháp RT-PCR 12 2.7.3 Thành phần phản ứng RT-PCR 13 2.8 Phương pháp tạo virus 14 2.8.1 Cơ sở phương pháp tạo virus 14 2.8.2 Các phương pháp tạo virus 14 2.9 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 14 2.9.1 Đỉnh sinh trưởng 14 2.9.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 15 2.9.3 Lịch sử phát triển thành tựu đạt nuôi cấy ĐST 16 2.9.4 Một số lưu ý q trình ni cấy ĐST 17 2.9.5 Các bước nuôi cấy ĐST lan Mokara in vitro 19 2.9.6 Ảnh hưởng ánh sáng, nhiệt độ ẩm độ q trình ni cấy ĐST 19 2.9.7 Ưu -Nhược điểm phương pháp nuôi cấy ĐST 20   v   2.9.8 Xử lý nhiệt 20 Chương 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Vật liệu 21 3.1.1 Vật liệu thí nghiệm 21 3.1.2 Hóa chất 21 3.1.3 Trang thiết bị thí nghiệm 21 3.1.4 Địa điểm thực 22 3.2 Phương pháp 22 3.2.1 Kiểm tra có mặt CyMV nguồn mẫu ban đầu 22 3.2.1.1 Ly trích virus 22 3.2.1.2 Thực phản ứng multiplex RT-PCR 23 3.2.2 Nuôi cấy nhân nhanh cụm chồi để tạo nguồn mẫu ban đầu 23 3.2.3 Xử lý nhiệt cụm chồi in vitro 24 3.2.4 Cô lập nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ chồi 24 3.2.5 Nuôi cấy tăng sinh protocorm 25 3.2.6 Kiểm tra bệnh mẫu cấy 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết kiểm tra có mặt CyMV nguồn mẫu ban đầu 26 4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 370C đến phát triển cụm chồi lan Mokara 26 4.3 Kết q trình lập nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 28 4.3.1 Cô lập 28 4.3.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 29 4.4 Kết nuôi cấy tăng sinh protocorm 32 4.5 Kết kiểm tra diện virus CyMV chồi tái sinh 32   vi   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận 34 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37   vii   DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT   ¾ cDNA : complementary deoxynucleic acid ¾ CyMV : Cymbidium mosaic virus ¾ DNA : Deoxyribonucleic acid ¾ ĐST : Đỉnh sinh trưởng ¾ ORSV : Odontoglossum ringspot virus ¾ PCR : Polymerase Chain Reaction ¾ PLB : Protocorm like body ¾ RNA : Ribonucleic acid ¾ RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ¾ TMV ¾ Tp HCM : Thành phố Hồ Chí Minh ¾ XLN : Tobacco mosaic virus : Xử lý nhiệt viii   B Hình 3.4 Đỉnh sinh trưởng sau tách nuôi cấy lỏng lắc 3.2.5 Nuôi cấy tăng sinh protocorm Các cụm protocorm tái sinh từ ĐST môi trường Knudson C chuyển sang nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung BA 2,5 mg/l NAA 0,5 mg/l Mẫu cấy đặt điều kiện chiếu sáng 16h/ngày, cường độ sáng 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C, ẩm độ 55 ± 5% Theo dõi tăng sinh protocorm sau 40 ngày nuôi cấy 3.2.6 Kiểm tra bệnh mẫu cấy Các cụm chồi tạo từ việc nuôi cấy tăng sinh protocorm sử dụng cho việc kiểm tra virus phương pháp RT-PCR Việc kiểm tra virus thực theo quy trình Nguyễn Xuân Dũng cs (2009) với bước tiến hành tương tự mục 3.2.1   25   Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết kiểm tra có mặt CyMV nguồn mẫu ban đầu Sau test ngẫu nhiên 10 lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro từ 10 bình ni cấy ta thu kết sau: 10 11 12 13 ORSV CyMV Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm RT - PCR kiểm tra nguồn mẫu ban đầu (1Ỉ10) Mẫu; (11) Đối chứng dương (+); (12) Đối chứng âm (-); (13) thang DNA 1kb Kết điện di sản phẩm RT - PCR 10 mẫu lan Mokara cv Do La Quat in vitro từ 10 bình ni cấy (Hình 4.1) cho thấy tất mẫu kiểm tra có nhiễm virus CyMV Từ giếng số đến giếng số 10 có xuất band kích thước 257 bp đặc trưng virus CyMV Vệt tráng mờ cuối giếng sản phẩm PCR mồi 4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 370C đến phát triển cụm chồi lan Mokara Việc XLN 370C không làm ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng phát triển cụm chồi thời gian 10 ngày đầu trình XLN Ở thời điểm 20 ngày sau xử lý, bắt đầu có suy giảm sinh trưởng phát triển xảy Các chồi bắt đầu có tượng héo úa, tỉ lệ chồi héo úa ghi nhận khoảng 22% tổng số chồi Tỉ lệ chồi héo tăng dần lên đến thời điểm 30 ngày sau xử lý 33,33%, đồng thời thời điểm tỉ lệ chồi chết xuất gia tăng nhanh Sau 40 ngày XLN 100% số chồi bị chết   26   Bảng 4.1 Ảnh hưởng trình xử lý nhiệt đến phát triển cụm chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro Số ngày quan sát( ngày) Tỉ lệ chồi chết( %) Tỉ lệ chồi héo( %) 10 0,00 ± 0,0 ± 0,0 20 0,67 ± 0,89 22 ± 2,67 30 50,33 ± 12,89 33,33 ± 5,77 40 86,00 ± 18,67 12,67 ± 16,89 Kết bảng 4.1 cho thấy ảnh hưởng rõ rệt thời gian XLN đế phát triển chồi lan Mokara cv Do La Quat in vitro.Việc XLN giúp hạn chế phát triển virus (Đỗ Năng Vịnh, 2001) nhiên làm ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển chồi Vì vấn đề quan trọng phải đảm bảo chồi sức sống sau xử lý, có loại trừ virus mà ĐST sau cô lập tái sinh ảnh hưởng trình xử lý hồn tồn khơng có giá trị mặt khoa học ứng dụng Ngược lại, XLN không đảm bảo việc hạn chế virus khơng hiệu Vì vậy, trường hợp này, thời điểm xử lý 30 ngày chọn làm thời điểm lấy mẫu để lập ĐST A C B D Hình 4.2 Ảnh hưởng trình XLN đến phát triển cụm chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro A, 10 ngày sau xử lý; B, 20 ngày sau xử lý; C, 30 ngày sau xử lý; D, 40 ngày sau xử lý   27   4.3 Kết q trình lập ni cấy đỉnh sinh trưởng 4.3.1 Cơ lập ĐST lập với kích thước 0,5 - 1mm cho hai trường hợp có khơng XLN Kích thước ĐST có ảnh hưởng lớn đến khả virus mẫu Mẫu nhỏ khả bệnh cao Đỉnh sinh trưởng lý tưởng nuôi cấy virus mang chóp đỉnh với tiền phát khởi lá, kích thước mm (Morel, 1960) Tuy nhiên, kích thước mẫu lớn đảm bảo bệnh virus (Đỗ Năng Vịnh, 2001) ĐST cô lập đề tài có kích thước 1mm (0,5- 1mm), kích thước phù hợp với nghiên cứu trước nên ĐST sau cô lập sử dụng làm vật liệu cho q trình ni cấy sau Hình 4.3 Cơ lập ĐST từ chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro A, chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro sau XLN 30 ngày; B, vùng chứa ĐST chồi sau tách bỏ hết lá; C, ĐST cô lập Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (TGTS) tỉ lệ tái sinh trung bình (%) ĐST lập từ chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro sau   28   4.3.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng a) Đỉnh sinh trưởng không qua xử lý nhiệt Khả tái sinh ĐST tăng theo nồng độ BA môi trường Knudson C cho kết tốt nồng độ BA mg/l Các ĐST ni cấy mơi trường Knudson C có bổ sung BA mg/l có thời gian tái sinh sớm số lượng PLBs tạo thành nhiều so với mơi trường lại ( Bảng 4.2) Hình 4.4; 4.5 Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ BA đến tái sinh ĐST cô lập từ chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro Mơi trường Thời gian tái sinh (ngày) Số PLBs tạo thành Knudsnon C + mg/l BA 24,3 ± 0,9 27 ± 3,36 Knudsnon C + 0,5 mg/l BA 19,83 ± 0,22 25 ± 8,64 Knudsnon C + mg/l BA 14,17 ± 0,77 60,56 ± 21,68 Knudsnon C + mg/l BA 12,83 ± 1,44 75,44 ± 10,32 Hình 4.4 ĐST thời điểm tái sinh nuôi cấy môi trường Knudson C bổ sung nồng độ BA khác A, BA mg/l; B, BA 0,5 mg/l; C, BA mg/l; D, BA mg/l   29   Hình 4.5 Sự phát triển ĐST mơi trường Knudson C bổ xung nồng độ BA khác sau 30 ngày nuôi cấy lỏng lắc E, BA mg/l; F, BA 0,5 mg/l; G, BA1 mg/l; H, BA mg/l BA có vai trò quan trọng phân chia tế bào phát sinh quan đặc biệt trình tạo chồi (Bùi Trang Việt, 2004) Nhiều nghiên cứu cho thấy BA có nồng độ từ 2- mg/l có vai trò tích cực tạo chồi PLBs từ mô cấy số giống lan (Nayak, 1998; Vij, 1994; Sheelavantmath, 2000; Lee, 1999) Kết nghiên cứu cho thấy BA có ảnh hưởng tích cực cho tái sinh PLBs từ ĐST lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro Và nghiên cứu này, môi trường Knudson C bổ sung mg/l BA thích hợp cho tái sinh PLBs từ ĐST lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro Tuy nhiên, nghiên cứu mở rộng với nồng độ BA cao mg/l thực cần thiết a) Đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt Dựa kết thu trường hợp ĐST không XLN, tiến hành nuôi cấy ĐST dã qua XLN mơi trường Knudson C có bổ sung nồng độ BA mg/l Kết cho thấy tái sinh xảy tương tự trường hợp nuôi cấy ĐST không xử lý nhiệt Tuy nhiên thời gian tái sinh ĐST chậm số PLBs tạo thành so với trường hợp khơng XLN (Bảng 4.3, Bảng 4.4, Hình 4.5)   30   Bảng 4.3 Ảnh hưởng trình XLN đến thời gian tái sinh ĐST Mơi trường Thời gian tái sinh (ngày) Knudsnon C + mg/l BA Khơng XLN 14,17 ± 0,77 Có XLN 19,0 ± 1,0 Knudsnon C + mg/l BA 12,83 ± 1,44 18,5 ± 1,5 Bảng 4.4 Ảnh hưởng trình XLN đến phát triển ĐST Mơi trường Số PLBs tạo thành Knudsnon C + mg/l BA Khơng XLN 60,56 ± 21,68 Có XLN 20,5 ± 3,5 Knudsnon C + mg/l BA 75,44 ± 10,32 26 ± 7,0 Hình 4.6 Sự phát triển ĐST qua XLN chưa qua XLN A, có XLN, ni môi trường Knudson C bổ sung BA mg/l; B, có XLN, ni mơi trường Knudson C bổ sung BA mg/l; C, không XLN, nuôi môi trường Knudson C bổ sung BA mg/l; D, không XLN, nuôi môi trường Knudson C bổ sung BA mg/l   31   4.3 Kết nuôi cấy tăng sinh protocorm Sau 40 ngày nuôi cấy tăng sinh protocorm tái sinh từ ĐST môi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA protocorm tái sinh từ ĐST không qua XLN protocorm tái sinh từ ĐST qua XLN có khác biệt rõ rệt phát triển Các protocorm tái sinh từ ĐST không qua XLN phát triển tốt tạo nhiều chồi xanh,sau 40 ngày nuôi cấy chồi tạo thành có kích thước từ 0,3 - 0,7 cm Trong protocorm tái sinh từ ĐST qua XLN có tượng chết số cụm PLBs khơng có tăng trưởng cụm PLBs sống sau 40 ngày ni cấy, phần lớn PLBs có màu vàng, số có màu vàng xanh PLBs có chồi xanh nhú (Hình 4.7) Hình 4.7 Sự phát triển protocorm tái sinh từ ĐST qua XLN khơng qua XLN A, khơng XLN; B, có XLN 4.4 Kết kiểm tra diện virus CyMV chồi tái sinh qua phương pháp nuôi cấy ĐST ni cấy ĐST có kết hợp XLN 30 ngày Sau kiểm tra mẫu lấy cụm chồi tái sinh từ ĐST chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro chưa qua XLN mẫu PLBs lấy từ cụm PLBs tái sinh từ ĐST chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro qua XLN thu kết sau A   32 B   Bảng 4.5 Kết kiểm tra virus Mẫu kiểm tra Số lượng mẫu Sạch virus Còn nhiễm Tỉ lệ (%) Có xử lý nhiệt 12 58,33 Không xử lý nhiệt 15 46,67 1000 bp 500 bp 200 bp Hình 4.8 Kết phát virus cụm PLBs lan Mokara cv Do La Quat in vitro qua XLN phương pháp PCR (1Ỉ10) Mẫu; (11) Đối chứng dương (+); (12) Đối chứng âm (-); (13) thang DNA 1kb 1000 bp 500 bp 200 bp ORSV CyMV Hình 4.9 Kết phát virus mẫu lan Mokara cv Do La Quat in vitro chưa qua XLN phương pháp PCR (1Ỉ10) Mẫu; (11) thang DNA 1kb; (12) Đối chứng âm (-); (13) Đối chứng dương (+) Kết kiểm tra bệnh cho thấy việc XLN cho tỉ lệ mẫu bệnh cao không xử lý (58,33 % so với 46,67 %) Kết hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu Kartha năm 1986, Brown cs năm 1988   33   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đưa số kết luận sau: ¾ Thời gian XLN có ảnh hưởng đáng kể đến sinh trưởng chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro ¾ Nồng độ BA mơi trường Knudson C có ảnh hưởng tích cực đến thời gian tái sinh số lượng PLBs tạo thành từ ĐST chồi lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt in vitro.Các mơi trường Knudson C bổ sung BA mg/l cho hiệu tốt q trình tái sinh ĐST ¾ Q trình XLN có ảnh hưởng trực tiếp đến yếu tố thời gian tái sinh ĐST, số lượng PLBs tạo thành khả tăng sinh protocorm tái sinh từ ĐST Trong điều kiên nuôi cấy, đối chứng ĐST không qua XLN có thời gian tái sinh ngắn hơn, tạo nhiều PLBs khả tăng sinh protocorm tái sinh từ ĐST tốt ¾ Thực tế cho thấy phương pháp nuôi cấy ĐST không qua xử lý nhiệt tạo chồi/cụm chồi virus hoàn tồn với tỉ lệ thành cơng khả quan (46,67 %), việc kết hợp xử lý nhiệt nuôi cấy cho tỉ lệ virus cao (58,33 %) sức sống protocorm tái sinh từ ĐST bị ảnh hưởng lớn cần cân nhắc lựa chọn phương pháp đối tượng lan nói chung lan Mokara nói riêng ¾ Để phục hồi giống lan Mokara dòng Đỏ quặt (Mokara cv Do La Quat) nhiễm Cymbidium mosaic virus (CyMV) kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cần tiến hành theo quy trình sau :   34     35   5.2 Đề nghị Để áp dụng đề tài vào thực tiễn, xin đề nghị số nghiên cứu để hoàn thiện phương pháp tạo virus này: ¾ Cần nghiên cứu liên quan kích thước mẫu ĐST ni cấy khả virus mẫu ¾ Cần mở rộng nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ BA > mg/l môi trường Knudson C lỏng đến tái sinh ĐST ¾ Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng mức nhiệt độ cao (380C – 400C) thời gian xử lý nhiệt khác lên sinh trưởng chồi tái sinh ¾ Nghiên cứu tối ưu hóa qui trình xử lý nhiệt nhằm làm tăng diện tích vùng “sạch virus” mơ phân sinh Từ tăng kích thước mẫu ĐST ni cấy, tăng khả tái sinh ĐST mà đảm bảo “sạch virus” ¾ Mở rộng nghiên cứu tái sinh ĐST số môi trường khác để tìm mơi trường tối ưu nhằm rút ngắn thời gian tái sinh, tăng tỉ lệ sống, nâng cao hệ số tăng trưởng ¾ Áp dụng kết đề tài nghiên cứu trước nuôi cấy mơ lan Mokara dòng Đỏ Lá Quặt để nhân nhanh chồi/ cụm chồi có kết kiểm tra CyMV (-) ¾ Khơng sử dụng chồi in vitro có kết kiểm tra CyMV (+) với mục đích kinh doanh hay sản xuất   36   TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Cung Hoàng Phi Phượng 2006 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy nghập chìm tạm thời nhân giống lan hồ điệp lai Trung tâm Công nghệ Sinh Học TP HCM Dương Công Kiên 2003 Nuôi cấy mô tập III NXB Đại học quốc gia TP HCM Dương Hoa Xô 2008 Nhân giống hoa lan cắt cành Mokara Trung tâm Công nghệ Sinh Học TP HCM Đỗ Năng Vịnh 2002 Công nghệ Sinh học trồng Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Hồ Huỳnh Thùy Dương,1998 Sinh học phận tử Nhà xuất giáo dục Lê Văn Hồng 2007 Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Bá Tiếp 2007 Tìm hiểu virus chế gây bệnh Đại học Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Minh Chơn 2004 Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nhà xuất đại học Cần Thơ Nguyễn Quốc Toàn 2009 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát virus gây bệnh cho lan Luận văn Cử nhân Công nghệ Sinh học Cao đẳng Công Nghệ Thực phẩm TP HCM 10 Phạm Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR vấn đề ứng dụng thường gặp Nhà xuất Y học 11 Trần Quang Hồng 2005 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến q trình ni cấy in vitro hai giống lan dendrobium cymbidium Luận văn kỹ sư Công nghệ Sinh học Bộ môn Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm TP HCM Tài liệu tiếng Anh 12 Biswas K M., Hossian M and Islam R 2007 Virus Free Plantlets Production of Strawbery Through Meristem Culture World Journal of Agricultural Sciences 3(6): 757- 763 13 Carrington J C., Jensen P E., and Schaad M C 1998 Genetic evi-dence for an essential role for potyvirus CI protein in cell-to-cell movement Plant J 14:393-400 14 Caspar D L D., Dulbecco R., Klug A., Lwoff A.,Stoker M G P., Tournier P and Wildy P 1962.Proposals ColdSpringHarb Symp Quant Biol 27:49–50 15 Citovsky V and Zambryski P 1991 How plant virus nucleic acids move through intercellular connections? BioEssays 16 Flynn P 1996 Virus Diseases of Orchids Horticulture and Home Pest New IC-475(8) - April 12, 1996 17 Gautheret J R 1939 Sur la possibilité de reaslier la culture in definie des tissue de tubercules de carotte C R Acad Sci (Paris)   37   18 Gupta D S., Ibaraki Y 2006, Plant Tissue Culture Engineering, Focus on Biotechnology, Springer 19 Haberlandt G 1902 Kultureversuche mit isolierten Pflanzenzellen Sitzungsber Akad Wiss Wien Math Nat Classe 111 20 Hollings M., Stone O M., and Brunt A A 1968 Cucumber mosaic virus Ann.Rep., Glasshouse Crops Res Inst 21 Kartha K K 1981 Tissue culture techniques for virus elimination and germplasm preservation K O Rachie and J M Lyman, eds The Rockefeller Poundation, New York 22 Lawson R H and Brannigan M 1986 Virus diseases of orchids In Handbook of Orchid Pests and Diseases American Orchid Society, West Palm Beach, Florida 23 Limaset P and Cornuet P 1949 Recherche de virus de la mosaique du tabac (Marmor tabaci Holmes) dans les méristèmes de plantes infectées C R Hebd Sci Acad Sci 24 Marais F 2002 Virus Diseases Orchid Society of Northern Transvaal Http://www.ont.co.za/virus_diseases.htm 25 Moran J and Knoxfield 1999 Virus diseases of orchids Http://www.dpi.vic.gov.au/DPI/nreninf.nsf/childdocs 26 Morel G.M and Martin C 1955 Guerison de plantes atteintes de maladies a virus; par culture de meristèmes apicaux Rep XIVth Int Hort Congr Netherlands P 303-310 27 Morel G.M 1960 Producing virus-free Cymbidiums Amer Orchid Soc Bull 29: 496-497 28 Navalinskiene M., Raugalas J., Samuitiene M 2005 Viral diseases of flower plants 16 Identification of virus affecting orchids Cymbidium Sw Biologija 2: 29-34 29 Pierik 1999 In vitro culture of higher plants.Kluwer Academic Publisher 30 Quak F 1977 Merisrem culture and virus- free plants J Reinert and Y P S Bajaj, eds Springer- Verlag, Berlin 31 Seoh M L., Wong S.-M., and Zhang L 1998 Simultaneous TD/RT-PCR detection of cymbidium mosaic potexvirus and odontoglossum ringspot tobamovirus with a single pair of primers J Virol Methods 72:197-204 32 Toussaint A., Dekegel D and Vanhcule, G 1984 Distributation of Odontoglossum ringspot virus in apical meristem of infected Cymbidium cultivar Physiological Plant Pathology 33 University of Illinois Extention 1990 Common virus diseases of orchids Report on plant diseases Department of crop sciences University of Illinois at Urbana Champaign Http://www.aces.uiuc.edu/vista/pdf_pubs/614.pdf 34 Viéietez A M., Ballester A., San-José M C and Viéietez E 1985: Anatomical and chemical studies of vitrified shoots chestnut regenerated in vitro Physiologia plantarum 35 Vieitez A M., Carmen San-Jose M and Vieitez E (1985) In vitro plantlet regeneration from juvenile and mature Ouercus robur L J Hort Sci   38   36 Vine S J and Jones O P 1969 The Culture of shoot tips of hop (Humulus lupulus) to eliminate viruses J Hort Sci 37 Walkey D G A 1978 In vitro methods for virus elimination Thorpe, ed Frontiers of plant tissue culture 1978, University of Calgary, Alberta, Canada 38 Walkey D G A 1980 Production of virus- free plant by tissue culture In: Tissue Culture Methods for Plant Pathologis D S Ingram and J.P Helgeson (eds.) Blackwell Scientific Publications, Oxford 39 White P.R 1939 Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial medium Am J Bot 40 Wong S M., Mahtani P H., Lee K C., Yu H H., Tan Y., Neo K K., Chan Y., Wu M and Chng C G 1997 Cymbidium mosaic potexvirus RNA: complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis Arch Virol 142: 383-391 41 Zettler F W., Ko N J., Wisler G C., Elliot M S., Wong S M 1990 Viruses of orchids and their control Plant Dis 74: 621-626     39 ... ĐỎ LÁ QUẶT (Mokara cv DO LA QUAT ) ĐÃ NHIỄM VIRUS Cymbidium mosaic (CyMV) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG Hướng dẫn khoa học: Sinh viên thực ThS Nguyễn Xuân Dũng Đỗ Phong Lưu KS Nguyễn... INFECTED MOKARA cv DO LA QUAT BY THE MERISTEM CULTURED TECHNIQUE" Topic was conducted from 01/02/2010 to 01/07/2010 in the Biotechnology Center of Ho Chi Minh City with Mokara cv Do La Quat in vitro... Determine the influence of heat treatment process to Mokara cv Do La Quat in vitro buds The meristem was isolated successfully from Mokara cv Do La Quat in vitro buds Finding the appropriate culture