XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana Bertoni)in vitroVÀ KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY CỎ NGỌT ex vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT Stevia rebaudiana Bertoni

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT

(Stevia rebaudiana Bertoni)in vitroVÀ KHẢO SÁT

SỰ SINH TRƯỞNG CỦA CÂY CỎ NGỌT ex vitro

Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NHƯ QUỲNH Niên khóa: 2010 – 2014

Tháng 12/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY CỎ NGỌT

(Stevia rebaudiana Bertoni)in vitroVÀ KHẢO SÁT

SỰSINH TRƯỞNG CỦA CÂY CỎ NGỌT ex vitro

KS TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 12/2013

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn đến:

Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiêm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng quý thầy cô tại trường đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn giúp đỡ tôi

Cô Trần Thị Lệ Minh cùng cô Tô Thị Nhã Trầm hết lòng giúp đỡ và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Cô chủ nhiệm Tôn Bảo Linh đã quan tâm giúp đỡ và tư vấn học tập cho tôi trong suốt thời gian học đại học

Toàn thể lớp DH10SH, các thành viên làm trong phòng nuôi cấy mô và các bạn làm đề tài trong bộ môn đã chia sẻ, hỗ trợ giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian học tập và làm đề tài

Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Tp Hồ Chí Minh, ngày 7 tháng 12 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Như Quỳnh

TÓM TẮT

Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) là một loài cây thân thảo có nguồn gốc từ Châu

Mỹ, hiện trồng ở nhiều nơi trên thế giới được dùng để làm chất tạo ngọt và làm thuốc Hoạt chất chính trong cỏ ngọt là một glycoside có tên là steviol, chất này có độ ngọt gấp 300 lần so với đường mía đặc biệt không sinh năng lượng nên được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh như đái tháo đường, cao huyết áp.Vì khả năng nảy mầm của hạt thấp nên phương pháp nuôi cấy mô được cho là thích hợp cho nhân giống cây cỏ ngọt

Trong nghiên cứu này, chồi cỏ ngọt in vitrosống và không bị nhiễm sau 3 tuần

nuôi cấy trên môi trường tạo chồi là môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l BA được cắt thành từng đốt dài khoảng 1 cm có mang 2 chồi ngủ cấy chuyền vào môi trường nhân chồi MS có sự kết hợp BA (0,0 - 3,0 mg/l) và Kn (0,1 mg/l) Sau 6 tuần nuôi cấy các chồi được tách ra từ cụm chồi và cấy chuyền tạo rễ trên môi trường MS½ có bổ sung NAA (0,0 - 1,0 mg/l).Khi cây đã phát triển hoàn chỉnh sau 3 tuần tạo rễ, cây cỏ ngọt được đưa ra vườn ươm trồng khảo sát giá thể với hỗn hợp giá thể theo các tỉ lệ khác nhau (đất sạch : phân trùn : mụn dừa : tro trấu)

Kết quả cho thấy ở thí nghiệm nhân chồi, cụm chồi cho số lượng chồi nhiều nhất trên môi trường MS + 2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l Kn với số lượng chồi trung bìnhcao nhất là 5,84 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 3,81 cm với số lá trung bình là 6,31 lá Qúa trình tạo rễ, rễ được cảm ứng hình thànhtốt nhất trên môi trường MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA với hệ rễ to khỏe thích hợp đưa ra vườn ươm số lượng

rễ trung bình là 8,27 rễ và chiều dài trung bình rễ là 1,58 cm Cây cỏ ngọt in vitro hoàn

chỉnh có lá mở to, rễ phát triển và chiều cao cây trung bình đưa ra vườn ươm phát triển tốt trên hỗn hợp giá thể bao gồm đất sạch : phân trùn : mụn dừa : tro trấu theo tỉ lệ 4 :

1 : 0 : 1 đạt tỉ lệ sống trung bình 73,33%

SUMMARY

Micropropagation of stevia(Stevia rebaudianaBertoni) and examinethe growth

ofsteviaexvitro

Stevia (Stevia rebaudiana) is a herbaceous species originating from the

America, which is grown in many places in the world and used as sweetener and medicine The active ingredient in the sweet grass is a steviol glycoside called, this substance is 300 times more sweetness than cane sugar is not particularly energy should be widely used to treat diseases such as diabetes, high blood pressure Sincegerminationofseedsislow andtissue culturemethodssuitable forthefreshgrass

In this study, fresh grass shoots after 3 weeks in vitro culture was cut into gas

bearing dormant buds subculture of shoots on MS medium is a combination

of BA (0.0 – 3.0 mg/l) and Kn (0.1 mg/l) After 6 weeks of culture, it were separated from the shoots and buds subculture rooted in medium MS½ supplemented with NAA (0.0 to 1.0 mg/l) When fully developed trees given nursery can cost survey with different rates (soil : earthworm distribution : rice husk ash : coco peat)

The results showed that the number of buds for most shoots in MS medium + 2.0 mg/l BA + 0.1 mg/l Kn number is 5.84 with buds/sample, shoot height was 3.81 cm with an average number of leaves is 6.31 Roots to create the best medium MS½ + 0.5 mg/l NAA with the most number of roots 8.27 and root length was

1.58 cm In vitro stevia nursery complete version of mixtures developed on substrates

land: distribution worms : rice husk ash : coco peat in proportion 4: 1 : 1 : 0 reached 73.33% survival rate

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i 

TÓM TẮT ii 

SUMMARY iii 

MỤC LỤC iv 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi 

DANH SÁCH CÁC BẢNG vii 

DANH SÁCH CÁC HÌNH viii 

Chương 1 MỞ ĐẦU 1 

1.1 Đặt vấn đề 1 

1.2 Yêu cầu của đề tài 2 

1.3 Nội dung nghiên cứu 2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt 3 

2.1.1 Vị trí phân loại 3 

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3 

2.1.3 Đặc điểm hình thái 3 

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng 4 

2.1.5 Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt 6 

2.1.6 Giá trị của cây cỏ ngọt 6 

2.2 Nhân giống vô tính 7 

2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro 7 

2.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô 7 

2.2.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong phát sinh hình thái 8 

2.2.4 Hiện tượng thủy tinh thể 10 

2.3 Vai trò của các loại giá thể 11 

2.3.1 Giá thể mụn dừa 11 

2.3.2 Giá thể tro trấu 11 

2.3.3 Phân trùn quế 12 

2.3.4 Giá thể đất sạch 12 

2.4 Những nghiên cứu trong nước và thế giới về cây cỏ ngọt 12 

2.4.1 Nghiên cứu trong nước 12 

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước 13 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 

3.1 Thời gian và địa điểm 14 

3.2 Vật liệu nghiên cứu 14 

3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 14 

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15 

3.4.1Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt in vitro 15 

3.4.2Khảo sát sự tạo rễ của cây cỏ ngọt in vitro 16 

3.4.3Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro 16 

3.5 Phương pháp xử lí số liệu 17 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 

4.1 Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt 18 

4.2 Khảo sát khả năng tạo rễ của cây cỏ ngọt in vitro 22 

4.3 Khảo sát ảnh hưởng giá thể đến sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro 26 

5.1Kết luận 33 

5.2 Đề nghị 34 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 

Naphthalene acetic acid 3-indol-acetic acid Indol-3-butyric acid 6-benzylaminopurine Môi trường Murashige và Skoog (1962) N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine Môi trường MS có thành phần đa lượng giảm 3/4 Môi trường MS có thành phần đa lượng giảm ½ 6-(3-methyl-2-butenylamino)purine

Tổ chức nông – lương Liên Hiệp Quốc Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ Coefficient of Variation - Độ biến thiên Cộng tác viên

Bảng 4.3 Tỉ lệ sống của cây cỏ ngọt in vitro sau 3 tuần……….28 Bảng 4.4 Chiều cao và số lá của cây cỏ ngọt in vitro sau 3 tuần 30

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cây cỏ ngọt ngoài vườn ươm BM công nghệ sinh học ĐH Nông Lâm 3

Hình 2.2 Các bộ phận của cây cỏ ngọt 4

Hình 4.1Chồi cỏ ngọt sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường cảm ứng nhân nhanh chồi 19

Hình 4.2 Chồi cỏ ngọt nhân nhanh sau 6 tuần trên các môi trường 20

Hình 4.3 Sự khác biệt về hình thái của chồi cỏ ngọt sau 6 tuần 21

Hình 4.4 Rễ cây cỏ ngọt in vitro sau 3 tuần nuôi cấy 24

Hình 4.5 Sự khác biệt hình thái cây cỏ ngọt sau 3 tuần tạo rễ 25

Hình 4.6 Cây cỏ ngọt ex vitro ngoài vườn ươm sau 3 tuần 27

Hình 4.7 Cây cỏ ngọt ex vitro sau 2 tuần ngoài vườn ươm 28

Hình 4.8Cỏ ngọt ex vitro trồng trên 2 giá thể khác nhau sau 2 tuần ngoài vườn ươm 29

Hình 4.9 Rễ cây cỏ ngọt ex vitro sau 2 tuần ngoài vườn ươm 30

Hình 4.10 Sự phát triển về chiều cao và số lá của cây cỏ ngọt ex vitro 31

Hình 4.11 Cỏ ngọt ex vitro 3 tuần trồng ngoài vườn ươm 32

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây cỏ ngọt có tên khoa học là Stevia rebaudiana Bertoni, thuộc họ cúc được

phát hiện và sử dụng cách đây hơn 1.500 năm ở Nam Mỹ, nhưng mãi đến thời gian gần đây mới được cả thế giới quan tâm vì sự kì diệu của nó Cây cỏ ngọt chứa hàm lượng stevioside cao, chất này có độ ngọt gấp 300 lần đường sucrose, không lên men, kháng khuẩn, có khả năng duy trì hàm lượng đường trong máu, cải thiện tiêu hóa, điều tiết hoạt động của hệ mạch (Rafiq và ctv, 2007) và đặc biệt không sinh năng lượng, vô hại với cơ thể nên có thể dùng trong chế độ ăn kiêng Ngoài ra, cỏ ngọt còn sử dụng cho người bị bệnh đái tháo đường, chống béo phì ở phụ nữ, chống ung thư Trong công nghiệp thực phẩm, chất stevioside là chất phụ gia để sản xuất bánh kẹo, nước giải khát Do đó, cỏ ngọt được xem là nguồn nguyên liệu quý giá trong tương lai

Cây cỏ ngọt được trồng phổ biến nhiều nơi trên thế giới và được nhập vào Việt Nam năm 1988 Ở nước ta hiện nay cỏ ngọt đang được khảo nghiệm ở nhiều vùng khác nhau như: Hà Giang, Cao Bằng, Lâm Đồng, Đăk Lăk Kết quả ban đầu thu được rất khả quan, lợi nhuận thu được từ cây cỏ ngọt đạt 380 - 400 triệu/ha/năm Trên thế giới, Nhật Bản là nước trồng và tiêu thụcỏ ngọtchiếm40%thị trường chất ngọt còn Trung Quốclà nước xuất khẩu cỏ ngọt lớn nhất thế giới Ngoài ra, ở Mỹ cỏ ngọt được

sử dụng chủ yếu để thay thếđường

Hiện nay, cỏ ngọt chủ yếu được nhân giống bằng hạt, giâm cành và chiết cành Tuy nhiên, việc nhân giống bằng hạt cũng như giâm cành và chiết cành còn nhiều nhược điểm với tỉ lệ nảy mầm thấp, bị phân ly tính trạng, khó giữ được các đặc tính quý giá, ưu việt của cây bố mẹ (Miyazaki và Wantenabe, 1974), hệ số nhân thấp và cây dễ bị nhiễm bệnh từ cây mẹ Vì thế, việc chọn ra nguồn giống tốt, có năng suất cao, ổn định và sạch bệnh còn nhiều hạn chế

Trong những năm trở lại đây phương pháp nhân giống in vitro được sử dụng

rộng rãi với nhiều ưu điểm như hệ số nhân giống cao, tiết kiệm thời gian, diện tích, tạo cây trồng sạch, sản xuất được cây số lượng lớn với độ đồng đều cao Vì vậy, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ rất tốt cho việc nhân giống nhanh và nghiên cứu tạo giống mới, có thể khắc phục được các nhược điểm của

phương pháp nhân giống truyền thống không phù hợp trong sản xuất và mang lại lợi

nhuận Do đó, đề tài “Xây dựng quy trình nhân giống cây cỏ ngọt(Stevia rebaudiana Bertoni) in vitro và khảo sát sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro” được thực hiện

1.2 Yêu cầu của đề tài

Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho khả năng nhân chồi và tạo rễ của cây cỏ ngọt

Tạo cây cỏ ngọt in vitro hoàn chỉnh nhằm cung cấp nguồn cây con khảo sát

giá thể ngoài vườn ươm

Xác định thành phần tỉ lệ giá thể thích hợp cho sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ngoài vườn ươm

Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống cây cỏ ngọt in vitro

1.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Kn đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt

in vitro nhằm mục đích tạo ra số lượng lớn chồi làm vật liệu cho quá trình tạo rễ

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự hình thành rễ của cây cỏ ngọt

in vitro để tạo cây con hoàn chỉnh làm nguồn vật liệu khảo sát giá thể ngoài vườn ươm

Khảo sát ảnh hưởng giá thể lên sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro nhằm xác định loại giá thể phù hợp cho sự thuần hóa cây cỏ ngọt in vitro ngoài vườn ươm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây cỏ ngọt

Tên thường gọi: cỏ ngọt, cỏ đường, cỏ mật

Tên khoa học: Stevia rebaudiana

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cỏ ngọt có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở Đông Bắc Panama Trung Mỹ Vào thế kỷ 16, các thủy thủ người Tây Ban Nha đã từng đề cập tới loại thảo mộc này nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises

Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi là Stevia rebaudiana Bertoni

Cỏ ngọt được trồng chủ yếu ở Paraguay, Brazil, Nhật Bản và Trung Quốc.Chúng được nhập vào Việt Nam trồng khảo nghiệm từ năm 1988 Hiện nay, cỏ ngọt đã thích ứng với những vùng khí hậu khác nhau của nước ta, cây sinh trưởng tốt tại Lâm Đồng, Đắk Lắk, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Yên Bái

Hình 2.1 Cây cỏ ngọt ngoài vườn ươmBộ

môn công nghệ sinh học ĐH Nông Lâm

dài 30 - 60 mm, rộng 15 - 30 mm, có 3 gân chính xuất phát từ cuống lá Mép lá có răng cưa ở nửa phần trên Cụm hoa hình đầu, mỗi tổng bao có chứa 5 hoa nhỏ, tràng hình ống, màu trắng ngà, có 5 cánh nhỏ Hoa dài 10 - 12 mm, có hai vòi nhụy dài thò

ra ngoài, hoa có mùi thơm nhẹ (hình dáng giống hoa cỏ Lào nhưng nhỏ hơn nhiều), mùa hoa từ tháng 10 năm trước đến tháng 2 năm sau (theo dương lịch) Toàn thân có

vị ngọt, nhiều nhất ở lá, lá già chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không rụng (vẫn còn vị ngọt) Cỏ ngọt sinh sản hữu tính (gieo hạt) và vô tính (giâm cành) là loại cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng cây không chịu được ngập úng

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng

Mùa vụ: cỏ ngọt sinh trưởng quanh năm, nhưng cho năng suất cao nhất từ tháng

4 đến tháng 11 dương lịch Trong điều kiện đất đai cho phép cây có thể được trồng từ tháng 2, tháng 3 nhưng thời gian đầu cây sinh trưởng kém và thu hoạch thấp

Hình 2.2Các bộ phận của cây cỏ ngọt

(http://luanvan.net.vn)

Làm đất: cỏ ngọt không kén đất để trồng nhưng cây cho năng suất cao nhất trên loại đất thịt pha cát, tơi xốp và thoát nước Cỏ ngọt cũng ưa loại đất chua, có pH từ

4 - 5, tuy nhiên cây cũng có thể trồng đất có pH từ 6 - 7 có khi pH lên tới 7,5 Tránh trồng cỏ ngọt trên những loại đất sét và đất mặn

Phân bón: cỏ ngọt là cây cho thu hoạch nhiều lứa trong năm vì vậy yêu cầu lượng dinh dưỡng lớn Sản phẩm thu hoạch là lá xanh nên bón phân nhiều sẽ cho năng suất cao Tuy nhiên cần bón cân đối giữa đạm, lân và kali, nếu bón nhiều đạm sẽ tăng

dư lượng nitrat trong lá, làm giảm chất lượng sản phẩm Một loại phân hữu cơ rất tốt

để cung cấp dinh dưỡng trước khi trồng cỏ ngọt là dạng compost, compost thường được sản xuất bằng cách ủ rác thải sinh hoạt

Mật độ khoảng cách trồng cỏ ngọt tùy theo điều kiện từng nơi để bố trí khoảng cách cây khác nhau cho phù hợp và thuận tiện cho việc chăm sóc Sau khi trồng cần tưới đủ ẩm, tránh để khô đất nhưng không tưới quá ẩm.Nếu có điều kiện sau khi trồng nên phủ rơm rạ hoặc nilon để giữ ẩm cho cây và hạn chế cỏ dại

Chăm sóc: cỏ ngọt yêu cầu đất tươi xốp, có độ thoáng cao do đó cần xới đất thường xuyên đặc biệt ở giai đoạn đầu sau khi trồng cây còn yếu, sinh trưởng chậm

Tưới tiêu: tùy theo độ ẩm mà có chế độ tưới tiêu thích hợp Tốt nhất ở giai đoạn cây con nên tưới phun sương, nhưng khi cây lớn thì nên tưới rãnh cây Khi mưa nhiều phải lập thức tháo nước cho cây tránh hiện tượng để cây bị chết éo.Cỏ ngọt ưa ẩm nhưng lại không chịu được úng, để có năng suất cao nhất nên giữ độ ẩm 70 - 80%

Ánh sáng: không được trồng cỏ ngọt trong bóng râm vì cây cỏ ngọt là cây ưa sáng mạnh, cần phải được trồng ở những nơi có đủ ánh sáng mặt trời

Nhiệt độ: cỏ ngọt là cây trồng nhiệt đới, sinh trưởng trong điều kiện mát mẻ Có thể sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ từ 15 - 300C, nhiệt độ thích hợp nhất là 22 ± 20C.Nhiệt độ tối thích hợp cho sự nảy mầm của hạt là 200C.Từ 15 -

300C cây sinh trưởng khoẻ cho năng suất thu hoạch cao Nhiệt độ> 350C cây sinh trưởng kém

Ẩm độ: Môi trường sống tự nhiên của cây cỏ ngọt thích hợp nhất là khí hậu cận nhiệt đới, ưa ẩm ướt, với lượng mưa trung bình hàng năm từ 1400- 1600mm Độ ẩm thích hợp nhất cho sinh trưởng, phát triển là 70 - 85% Cỏ ngọt thường mọc tự nhiên trên các đầm lầy

2.1.5 Các hợp chất có trong cây cỏ ngọt

Từ lá cỏ ngọt, người ta đã chiết xuất được trên 11 chất có hàm lượng và độ ngọt khác nhau trong đó steviosidelà chất làm ngọt tự nhiên chính được chiết xuất từ lá

Stevia rebaudiana Bertoni (Brahmachari và ctv, 2011) Các hợp chất có trong cây cỏ

ngọt chiếm thành phần như sau: stevioside(48,9%), rebaudiosideA(24,4%), rebaudioside C(9,8%), dulcoside A (5,6%)và các thành phần không xác định(11,3%) (Yasukawa và ctv, 2002)

Theo các nhà nghiên cứu, chất stevioside (là một glucoside) có vị ngọt gấp

250 - 300 lần đường sucrose, nhưng chất stevioside không sinh năng lượng (Chatsudthipong và Muanprasat, 2009).Trong cỏ ngọt khô (bao gồm cả cành và lá) chứa khoảng 1,5% chất ngọt stevioside Như vậy, 100g cỏ ngọt khô có lượng chất ngọt tương đương 400 - 450g đường kính

2.1.6 Giá trị của cây cỏ ngọt

Trong y học, cỏ ngọt được sử dụng như một loại trà an toàn cho bệnh nhân tiểu đường vì nó không ảnh hưởng đến lượng đường trong máu (Alan, 2002; Mogra và Dashore, 2009) Ngoài các đặc tính làm ngọt không chứa calo,cỏ ngọt còn có nhiều đặc tính quan trọng kháctrong việc điều trị các bệnh nhân ung thư (Yasukawa và ctv, 2002), lợi tiểu (Lailerdetal, 2004), béo phì, cao huyết áp (Dyrskog và ctv, 2004) Ngày nay, cỏ ngọt thường được dùng kết hợp với các loại thảo mộc khác trong các thang thuốc y học dân tộc

Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt an toàn khi sử dụng như một chất làm ngọt (Geuns, 2003)nó được dùng để pha chế làm tăng độ ngọt của các loại thực phẩm khác nhau Ngoài ra, người ta còn dùng để chế rượu màu, nước hoa quả, các loại bánh kẹo, món tráng miệng đông lạnh, ướp các loại hải sản sấy khô, chế biến dấm

Cỏ ngọt còn được dùng trong công nghệ chế biến mỹ phẩm như các loại sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da, vừa có tác dụng nuôi dưỡng tất cả các mô và giúp cơ thể tái tạo làn da mới trên toàn bộ bề mặt da, vừa chống nhiễm khuẩn lại trừ được nấm

Ngày 4 tháng 7 năm 2008 Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) phê chuẩn Cục quản lí dược và thực phẩm Mỹ FDA cho phép vào ngày 17 tháng 12 năm 2008 về việc sử dụng cây cỏ ngọt để chế xuất chất làm ngọt Đường chiết xuất từ cây cỏ ngọt đang trở thành mặt hàng thiết yếu và an toàn, cụ thể là các

hãng thực phẩm lớn trên thế giới như Cocacola, Pepsi, Cargill đang sử dụng đường cỏ ngọt thay đường mía (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Nhật Lệ, 2013)

2.2 Nhân giống vô tính

2.2.1 Khái niệm nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô trùng.Môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002)

Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như: lá, hoa, thân và rễ Phương pháp này có nhiều ưu điểm: tiết kiệm thời gian và diện tích, có thể nhân giống các loài mà phương pháp nhân giống tự nhiên không cho phép hay không thuận lợi, tạo cây sạch bệnh, dễ dàng chọn lọc cá thể, giảm chi phí sản xuất, sản xuất quanh năm, tạo ra các dòng đột biến, tạo ngân hàng gen (Pierik, 1975; Anonymous, 1980; Assche, 1983; Gebhard và ctv, 1983; Kunneman, 1984)

2.2.2 Các giai đoạn nuôi cấy mô

Nhân giống in vitro là quá trình phức tạp, phải qua nhiều giai đoạn (Trần Thị Dung, 2003), để đạt được thành công trong nhân giống in vitro phải trải qua 5 giai

đoạn

Giai đoạn 1: khử trùng mô mẫu cấy

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro.Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu ban đầu vô trùng để

đưa vào môi trường nuôi cấy.Vô trùng mẫu cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay từ lần đầu tiên.Tuy nhiên, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử sẽ đạt được kết quả tốt

Giai đoạn 2: tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách có định hướng của các mô cấy.Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỉ lệ các hợp chất auxin, cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu

Giai đoạn 3: nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân,

ta thường thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng

(auxin, cytokinin, gibberellin) các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc tạo cây thông qua phôi vô tính

Giai đoạn 4: tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2 - 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây con hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất auxin là nhóm chất hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Giai đoạn 5: đưa cây con ra đất

Giai đoạn đưa cây con hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của

quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị

dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, giá thể) phù hợp để cây con đạt tỉ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

2.2.3 Vai trò của chất điều hòa sinh trưởng trong phát sinh hình thái

Có bốn nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin và acid abcisic Cả auxin và cytokinin đều được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỉ lệ hormone sử dụng

để kích thích tạo chồi hay tạo rễ không giống nhau Tùy theo giống, loài thực vật mà nhu cầu về dạng, nồng độ của auxin và cytokinin khác nhau trong phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Vai trò của auxin

Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được sử dụng với cytokinin Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong các loại môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi

cấy, sự tác động qua lại giữa auxin nội sinh và auxin ngoại sinh (Nguyễn Đức Lượng

và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Các hormone của nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng sáng, tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn Tác động của auxin thường liên quan tới độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ Đối với nuôi cấy mô và tế bào thực vật thường

sử dụng nhóm auxin: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α – Naptalen Acetic Acid), 2,4 – D (Dichlorphenoxy Acetic Acid)

Các loại auxin IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường tạo rễ và phối hợp với cytokinin cho môi trường ra chồi NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong môi trường nuôi cấy

Trong sự phát sinh hình thái (trên sự tạo chồi và tạo rễ): Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin hoặc khi xử lí với auxin thì rễ được hình thành.Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản Auxin cảm ứng sự tạo rễ là do nó có cảm ứng sự tổng hợp polyamine (Friedman và ctv, 1985)

Trong sự tạo rễ thì nồng độ auxin cao cần để cảm ứng sự ra rễ nhưng để kéo dài

phác thể rễ (sơ khởi rễ) thì nồng độ auxin thấp là cần thiết.Vì vậy, trong điều kiện in vitro khởi đầu cho sự tạo rễ bất định thường với nồng độ auxin cao sau đó nồng độ

giảm để phát triển phác thể rễ xảy ra

 Vai trò của cytokinin

Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia

tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Các cytokinin thường được sử dụng nhất là BAP (6-Benzyl Amino Purine), Kn, zeatin,

BA (6-Benzyl Adenine) Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

BAP và Kn là các loại cytokinin tổng hợp kích thích mạnh mẽ sự phân chia tế bào, tăng kích thước của tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hóa mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non nhưng ức chế sự tạo rễ.Hầu hết các loại cytokinin được sử dụng trong nuôi cấy chồi ở các loài thực vật khác nhau BAP kích

thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea (Vieitez, 1980) còn Kn thì kích thích sự tạo

chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus và để tăng sinh chồi cần phải sử dụng

đến BAP (Martinelli, 1985) Sự kết hợp BAP và Kn sẽ kích thích sự tạo chồi dạng hoa

hồng ở Brassica campestris trong nuôi cấy chồi Ngoài ra trong nuôi cấy chồi Gynura sarmentosa, BAP, Kn và 2 - Pi đều kích thích sự tạo chồi khi sử dụng riêng lẻ nhưng

mỗi chất đều gây ra sự bất thường ở vài chồi Chồi được tạo ra khỏe mạnh và tăng trưởng nhanh hơn khi phối hợp cả 3 chất cùng lúc (Caiiloux, 1978) Ở một số loài thực vật, khi phối hợp một vài loại cytokinin với nhau thì sẽ làm tăng hiệu quả tăng sinh

chồi như Corylus avellana (Anderson, 1984; Cucumismelo Kathal và ctv, 1988)

Để kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn trong nuôi cấy chồi người ta bổ sung một hoặc một vài loại cytokinin vào trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn 2 Cách này có thể cảm ứng sự tăng trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy sau khoảng 4 - 6 tuần Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài và làm cho lá bị biến dạng hay làm cho chồi chứa nhiều nước

Cản sự tạo rễ: nồng độ cytokinin cao (0,5 - 10 mg/l) thường cản hoặc làm chậm

sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben-Jaacov và ctv, 1999) đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin (Humphries, 1960) Vì vậy mà người ta không sử dụng cytokinin trong môi trường kích thích sự ra rễ của chồi để tạo cây con (giai đoạn 3) Đôi khi người ta cũng cấy chuyền một hoặc vài lần qua môi trường không có cytokinin để làm giảm lượng cytokinin trong mô cấy

2.2.4 Hiện tượng thủy tinh thể

Thân, lá phồng to chứa nhiều nước, cây có dạng trong Đây là một dạng bệnh lí thường thấy khi cây được nuôi trong môi trường mà việc trao đổi khí giữa cây và môi trường bên ngoài bị dừng lại, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy (Trần Văn Minh, 1999)

Một số phương pháp hạn chế quá trình thủy tinh thể là giảm sự hút nước của

cây in vitro bằng cách tăng độ đường trong môi trường nuôi cấy hoặc dùng các chất có

áp suất thẩm thấu cao.Tránh gây tổn thương trên mẫu cấy hoặc tiếp xúc với mẫu cấy ít nhất; Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy; Giảm C2H2 trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt; Tăng cường ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy

2.3 Vai trò của các loại giá thể

2.3.1 Giá thể mụn dừa

Mụn xơ dừa là một sản phẩm phụ từ việc chế biến chỉ xơ dừa, nó chính là phần còn lại sau khi tước lấy chỉ xơ dừa, mụn xơ dừa có khả năng giữ một trữ lượng nước rất lớn Trong vỏ dừa, tính theo trọng lượng khô có 19% là lớp vỏ ngoài, 34% mụn dừa và 47% là xơ dừa

Mụn xơ dừa có đặc tính xốp, thoáng khí khả năng giữ ẩm cao, lưu giữ được chất dinh dưỡng cho đất, có khả năng giữ được nước gấp 8 lần khối lượng Khác với than bùn và một số vật liệu khác thường có khuynh hướng dẹp xuống khi bị ướt trong khi mụn dừa lại có tính đàn hồi cao, không dẹp xuống khi bị ướt cũng như co rút lại khi bị khô, nhờ đó mà giữ ẩm tốt, lượng nước thoát ra không nhiều, đồng thời lưu giữ được chất dinh dưỡng và phân bón

Thành phần hóa lí của mụn xơ dừa: pH5,5 - 6,5,tỷ lệ C : N80 : 1,độ xốp10 – 12%,chất hữu cơ94 – 98%, cellulose20 – 30%,lignin60 – 70%,tanin8,0 - 8,5% (Nguồn: Nguyễn Ngọc Phương, 2006)

2.3.2 Giá thể tro trấu

Trấu là lớp vỏ ngoài cùng của hạt lúa và được tách ra trong quá trình xay xát.Trong vỏ trấu chứa khoảng 75% chất hữu cơ dễ bay hơi sẽ cháy trong quá trình đốt và khoảng 25% còn lại chuyển thành tro (Energy Efficiency Guide for Industry in Asia) Sau khi đốt, tro trấu có chứa trên 80% là SiO2, đây là thành phần được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực

Vỏ trấu đốt thành tro tồn tại trong đất, nhờ đó đất tơi xốp, vừa tạo đổ ẩm vừa thoát nước cho cây, tạo môi trường phát triển thuận lợi cho các hệ sinh vật hoạt động giúp cải tạo đất bạc màu và có nhiều dưỡng chất cho cây trồng phát triển tốt hơn

Chi phí sản xuất tro trấu thấp, giá thành mua tro trấu rẻ góp phần giảm chi phí đầu vào Do đó, tro trấu mang lại lợi nhuận thực tế cao hơn so với sử dụng các loại giá thể khác Tro trấu được dùng làm giá thể để sản xuất rau sạch, rau an toàn không cần đất, để sản xuất cây giống rau, hoa hoặc để trồng cây cảnh

Thành phần hóa học của tro trấu: SiO 2 (90,75%)K 2 O (1,34%) Na 2 O(0,67%) CaO

http://thuycong.ac.vn)

2.3.3 Phân trùn quế

Phân trùn là một loại phân hữu cơ 100% được tạo thành từ các chất thải hữu cơ sau khi qua ống tiêu hóa của con trùn quế Nguồn nguyên liệu làm thức ăn cho trùn quế rất đa dạng (phân gia súc, xác bã thực vật, rác thải gia đình) Chất lượng của phân trùn tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu thức ăn cho trùn Phân trùn chứa một lượng vi sinh vật có hoạt tính cao như vi khuẩn, nấm mốc đặc biệt là hệ vi khuẩn cố định đạm

tự do (Azotobacter), vi khuẩn phân giải lân, phân giải cellulose và chất xúc tác sinh

học

Phân trùn có thể được sử dụng như thành phần của đất để ươm cây trồng Có tác dụng kích thích sự nảy nầm và giúp cây con khỏe mạnh Phân trùn cũng có thể xem như phân bón hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và cải tạo đất.Phân trùn giàu những chất dinh dưỡng hòa tan trong nước và chứa hơn 50% chất mùn được tìm thấy trong lớp đất mặt có thể được cây trồng sử dụng ngay Ngoài ra, phân trùn còn cung cấp các chất khoáng cần thiết cho sự phát triển của cây trồng như N, P, K và khoáng vi lượng

2.3.4 Giá thể đất sạch

Đất sạch là một loại đất trồng được sản xuất từ mụn dừa, qua quá trình xử lí công nghiệp kết hợp vi sinh tạo thành một loại chất trồng hữu cơ Thành phần phối trộn tạo nên đất sạch là khác nhau như tro trấu, xơ dừa, phân bò hoai mục, phân trùn quế, đất màu tự nhiên, than bùn tùy theo tỉ lệ của nhà sản xuất.Đất sạch có các đặc tính

ưu việt: tơi xốp, thoáng khí, dễ thấm nước, giữ ẩm cao, không mang mầm bệnh, chứa nhiều vi sinh vật có lợi cho đất, sau 6 tháng sử dụng đất trở nên mùn, đặc biệt đất sạch

có tính giữ ẩm cao hơn 9 lần so với đất thông thường

2.4 Những nghiên cứu trong nước và thế giới về cây cỏ ngọt

2.4.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, từ những thập niên 90 đã có những nghiên cứu về cây cỏ ngọt Trong cùng một giống thu hoạch ở các thời vụ khác nhau sẽ cho hàm lượng chất stevioside khác nhau Năm 1995, giống cỏ ngọt St-88 được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống quốc gia (Trần Đình Phong, 1996; Mai Thị Phương Anh,1992; Liakhovkin, 1993)

Nghiên cứu về khả năng nhân giống cây cỏ ngọt cho thấy hạt cỏ ngọt có khả năng nảy mầm tốt nếu để giống ở vùng cao và lạnh Nhân giống cỏ ngọt bằng phương

pháp vô tính cho thấy trong môi trường MS thạch lỏng cây con sinh trưởng nhanh, tỉ lệ sống cao, tạo nhiều chồi và rễ (Nguyễn Thị Hằng và Mai Thị Phương Anh, 1992)

Năm 2011, Lê Thục Anh phối hợp với Công ty cổ phần Stevia Venturues cùng nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội

2.4.2 Nghiên cứu ngoài nước

Theo thống kê trên thế giới có khoảng 300 sáng chế nghiên cứu về cây cỏ ngọt

và chất tạo ngọt trong cây này Ovodio Rebaudi (1900) đã cô lập thành công hai loại hợp chất từ cây cỏ ngọt: chất có vị ngọt và chất có vị đắng (hậu ngọt) Tiếp đó, Reseback (1908) và Dieterich (1909) đã chiết xuất được glucoside từ lá cỏ ngọt nhưng tới năm 1931 thì Bridel và Lavieille mới xác định và tinh chế được stevioside (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2013)

Năm 1986, Miyagawa và cộng tác viên đã thực hiện nghiên cứu và rút ra được kết luận: chồi non cỏ ngọt được tái sinh trên môi trường GamborgB5có chứaBAPvà NAA Sau đó, rễ được tạo thànhphát triển thànhcây controng vòng 2hoặc3 tuần trên môi trườngGamborgB5có chứa0,02 mg/lBAPvà2% sucrose Tiếp theo đó, theo nghiên cứu Ferreira và Handro (1988) đã ghi nhận mô sẹo từ lá cỏ ngọt được tạo thành tốt trên môi trường có chứa 2,0 mg/lBA trong điều kiện ánh sáng và 2,0 mg/l BA + 2,0 mg/l NAAtrong điều kiện tối Chồi được tái sinh từ mô sẹo trên môi trường có bổ sung 0,1 mg/lBA cho kết quả tốt.Trong khi đó, kết quả nghiên cứu môi trường MS có bổ sung kết hợp BAP (2,0-3,0 mg/l) và NAA (2,0 mg/l) cho thấy môi trường có chứa 2,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA là tốt nhất cho cảm ứng mô sẹo Rễ cỏ ngọt tạo ra tốt hơn trên môi trường MS¼bổ sung 0,1mg/l IBA (Patel và Shah, 2009).Năm 2010, Pratibha Gupta và cộng tác viên đã nghiên cứu thành công quá trình tạo ra mô sẹo của cây cỏ ngọt Nghiên cứu đã cho thấy việc tạo thành mô sẹo từ đốt thân hiệu quả nhất trong môi trường MS có chứa 5 mg/l Kn Sau đó, năm 2011 Mohamed và cộng tác viên đã vi nhân giống cây cỏ ngọt thành công từ các đốt thân của cây Sự tạo thành chồi non được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS có chứa 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l

Kn Sự kéo dài chồi hiệu quả sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có sự kết hợp giữa 0,5 mg/l BA và 1,0 mg/l Kn

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 12/2013 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Bộ môn Công nghệ Sinh học - trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu thí nghiệm được tiến hành trên giống cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana) in vtro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo chồi

3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Thiết bị và dụng cụ: máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy, nồi hấp, dàn sáng, dao, kéo, pence, đèn cồn, chai thủy tinh, đĩa petri, tủ lạnh

Hóa chất: chất điều hòa sinh trưởng (BA, Kn, NAA), các chất pha môi trường

MS (các chất trong môi trường MS được nêu ở phần phụ lục 1)

Hình 3.1 Chồi cỏ ngọt in vitro trên môi

trường tạo chồi 3 tuần cấy

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Môi trường MS cơ bản bổ sung 8 g/l agar, 30 g/l đường, pH 5,7 - 5,8 trước khi hấp khử trùng được dùng làm môi trường nuôi cấy cơ bản cho các thí nghiệm nuôi cấy

cây cỏ ngọt in vitro Môi trường được đặt trong chai thủy tinh 500 ml, mỗi chai chứa

50 ml Hấp khử trùng trong autoclaver ở 121oC trong 20 phút

Các thí nghiệm nuôi cấy in vitrocây cỏ ngọt được tiến hành trong điều kiện:

nhiệt độ25± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ, cường độ chiếu sáng

40 - 45 µmol/m2/s, độ ẩm tương đối 70- 75% Các điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm, cường

độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng sẽ được giữ ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm

3.4.1 Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt in vitro

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ BA và Kn thích hợp cho sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt, tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm tạo rễ nhằm tạo ra cây cỏ

ngọt in vitro hoàn chỉnh

Phương pháp tiến hành: mẫu thân của cây cỏ ngọt in vitro sống và không bị

nhiễm sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường tạo chồi (MS + 0,2 mg/l BA) được cắt thành từng đốt nhỏ dài khoảng 1 cm, mỗi đoạn thân mang hai chồi ngủ được cấy chuyền vào môi trường MS có bổ sung BA với nồng độ 0,0- 3,0 mg/l và Kn có nồng

độ 0,1 mg/l

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bao gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần (3 chai/nghiệm thức/lần lặp lại), mẫu được cấy với số lượng

3 mẫu/chai Tổng số mẫu sử dụng cho thí nghiệm 189 mẫu (27 mẫu/nghiệm thức)

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường lên sự nhân nhanh chồi của cây cỏ ngọt in vitro

Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) Kn (mg/l)

Chỉ tiêu theo dõi của cây sau 6 tuần nuôi cấy

- Số chồi hình thành / mẫu = tổng số chồi hình thành / tổng số mẫu cấy

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch tới đỉnh cao nhất của cụm chồi

- Số lá / chồi (lá): đếm số lá của cây trên mặt thạch

3.4.2 Khảo sát sự tạo rễ của cây cỏ ngọt in vitro

Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ thích hợp của NAA lên khả năng tạo rễ

cây cỏ ngọt in vitro Tạo cây con hoàn chỉnh làm nguồn vật liệu khảo sát ảnh hưởng

giá thể đến sự sinh trưởng của cây ngoài vườn ươm

Phương pháp tiến hành: Chọn các chồi đồng đều có chiều cao 3 - 4 cm và có

4 - 6 látừ thí nghiệm nhân chồi làm nguồn vật liệu cho thí nghiệm tạo rễ Các chồi này

được nuôi cấy trên môi trườngMS½ có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho sự tạo

rễ là NAA có nồng độ 0,0- 1,0 mg/l

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bao gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được

thực hiện với 3 lần lặp lại (5 chai/nghiệm thức/lần lặp lại), mẫu được cấy với số lượng

1 mẫu/chai Tổng số mẫu sử dụng trong thí nghiệm là 90 mẫu, 15 mẫu/nghiệm thức

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của chồi cây cỏ ngọt in vitro

Chỉ tiêu theo dõi của cây sau 3 tuần nuôi cấy

- Số rễ trung bình / chồi = tổng số rễ / tổng số cây

- Chiều dài rễ (cm) : đo từ gốc đến hết chiều dài rễ

- Số lá (lá): số lá nguyên trên mặt thạch

- Chiều cao cây (cm): đo từ mặt thạch đến ngọn cây

3.4.3 Khảo sát ảnhhưởng giá thể đến sự sinh trưởng của cây cỏ ngọt ex vitro

Mục đích thí nghiệm: Xác định tỉ lệ giá thể tối ưu cho sự thuần hóa cây cỏ ngọt

in vitro ngoài vườn ươm

Phương pháp tiến hành: Chọn các cây cỏ ngọt in vitro hoàn chỉnh có chiều cao

từ 5 - 6 cm, có rễ khỏe, có 4 - 6 lá mở to Các cây được trồng với các loại giá thể gồm

đất sạch, phân trùn, mụn dừa, tro trấu theo tỉ lệ khác nhau (bảng 3.3) Trồng trong điều kiện nhà lưới phủ 2 lớp lưới đen, nhiệt độ 18 - 30oC, ánh sáng tự nhiên, độ ẩm

50 - 60% Phun sương4 lần/ngày trong 3 ngày đầu, những ngày sau phun 2 lần/ngày

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bao gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm

5 chậu/lần lặp lại, thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, mỗi chậu 1 hom Tổng số

chậu là 75 chậu, 15 chậu/nghiệm thức

Bảng 3.3 Thành phần và tỉ lệ hỗn hợp giá thể cho từng nghiệm thức

Chỉ tiêu theo dõi sau 6 tuần trồng ngoài vườn ươm

- Tỉ lệ cây sống (%) = tổng số cây sống/tổng số cây ra vườn

- Số lá (lá): đếm số lá trên mặt đất

- Chiều cao cây (cm): đo từ mặt đất tới ngọn cây

3.5 Phương pháp xử lí số liệu

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố với 3 lần

lặp lại Số liệu thu thập được sẽ được xử lí trên máy tính bằng phần mềm xử lí thống

kê Excel và MSTATC Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức bằng phương pháp LSD

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát tác động của môi trường đến sự nhân nhanh chồi cây cỏ ngọt

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002) khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy thì BA có khả năng kích thích tạo nhiều chồi nhưng lại không có khả năng kích thích kéo dài chồi, BA có tác dụng phá vỡ miên trạng của chồi ngọn và kích thích sự hoạt động của các chồi bên Ngược lại,Kn mặc dù cho sự tăng sinh chồi ít hơn nhưng lại kích thích chồi phát triển mạnh hơn (Dương Tấn Nhựt, 2010) Do đó, thí nghiệm được tiến hành bằng cách kết hợp giữa hai chất điều hòa sinh trưởng thực vật

BA và Kn

Độ chêch lệch giữa các nồng độ BA cho thấy có sự khác biệt về khả năng nhân

chồi, chiều cao chồi và số lá không có sự khác biệt vượt trội

Bảng 4.1 Số chồi mới hình thành trên môi trường có bổ sung BA và Kn 6 tuần nuôi cấy

Nghiệm

thức

Môi trường

BA (mg/l)

Kn (mg/l)

Số chồi/mẫu(chồi)

Chiều cao chồi (cm)

Số lá (lá)

ĐC MS 0,0 0,1 1,82f±0,13 2,41d±0,08 4,29c±0,68 A1 MS 0,5 0,1 2,63e±0,28 2,52d±0,06 4,92bc±0,51 A2 MS 1,0 0,1 2,96de±0,23 3,13c±0,19 5,17b±0,26 A3 MS 1,5 0,1 4,22c±0,40 4,11a±0,12 6,76a±0,67 A4 MS 2,0 0,1 5,84a±0,26 3,81b±0,09 6,31a±0,18 A5 MS 2,5 0,1 4,74b±0,39 3,24c±0,23 5,26b±0,13 A6 MS 3,0 0,1 3,41d±0,23 3,06c±0,07 5,06b±0,23

số lượng chồi trung bình đạt cao nhất 5,84 chồi/mẫu ở nghiệm thức A4 (2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l Kn) Tiếp tục tăng nồng độ BA từ 2,0- 3,0 mg/l số lượng chồi trung bình giảm dầnxuống còn 3,41 chồi/mẫu ở nghiệm thức A6 (3,0 mg/l BA + 0,1 mg/l Kn)

Chất điều hòa sinh trưởng BA dùng bổ sung vào môi trường nuôi cấy chồi (Capote

de Sol và ctv, 2000) và môi trường kéo dài chồi (Wijtaksono và ctv, 1999) Như vậy, việc

bổ sung BA và Kn vào môi trường nuôi cấy làm tăng số lượng chồi của cây cỏ ngọt

Hình 4.1 Chồi cỏ ngọt sau 3 tuần nuôi cấy trên các môi trường cảm ứng

nhân nhanh chồi

Từ kết quả này cho thấy với nồng độ BA và Kn ở ngưỡng 2,0mg/l BA và 0,1mg/l Kn cho kết quả nhân chồi trung bình tốt (5,84 chồi/mẫu) Chất điều hòa sinh trưởng BA là loại cytokinin hiệu quả trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật, với hàm lượng cytokinin cao sẽ hoạt hóa sự hình thành chồi bất định (Vũ Văn Dụ, 1999) Nguyên nhân là do sự hiện diện của cytokinin trong môi trường nuôi cấy sẽ kết