XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NƯỚC JAVEL CHO QUÁ TRÌNH KHỬ MẪU PHÁT HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) Nội dung 2: ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG BAP, TDZ, NAA ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA LAN HỒ ĐIỆP LAI (Phalaenopsis sp.) IN VITRO

Đề tài nhằm theo dõi nồng độ javel thích hợp cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp, quá trình tạo protocorm và sự phát triển rễ của lan hồ điệp in vitro khi thay đổi nồng độ chất đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Nội dung 1:

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NƯỚC JAVEL CHO QUÁ TRÌNH KHỬ

MẪU PHÁT HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.)

Nội dung 2:

ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HOÀ SINH TRƯỞNG BAP, TDZ, NAA ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN

CỦA

LAN HỒ ĐIỆP LAI (Phalaenopsis sp.) IN VITRO

Họ và tên sinh viên: HOÀNG THỊ HIỀN Ngành: NÔNG HỌC

Niên khoá: 2005 - 2009

Tháng 9/2009

Nội dung 1:

XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NƯỚC JAVEL CHO QUÁ TRÌNH KHỬ

MẪU PHÁT HOA LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.)

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Nông Học

GVHD:ThS NGUYỄN CHÂU NIÊN CBHD:ThS NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN

KS DƯƠNG LAN OANH

Tháng 9 năm 2009

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô khoa Nông học trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin cảm ơn tất cả bạn bè, thân hữu đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Sau cùng, xin chúc quý thầy cô trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh lời chúc sức khoẻ và thành công trong công tác đào tạo

Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 8 năm 2009 Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Hiền

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình

sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro” được tiến hành tại

phòng di truyền và chọn giống - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, thời gian thực hiện từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên

Đề tài nhằm theo dõi nồng độ javel thích hợp cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ

điệp, quá trình tạo protocorm và sự phát triển rễ của lan hồ điệp in vitro khi thay đổi nồng

độ chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ, NAA trong môi trường nuôi cấy

Kết quả đạt được:

™ Phương pháp khử trùng mẫu cấy:

Khử trùng mẫu phát hoa lan hồ điệp bằng cách thay đổi nồng độ javel (20%, 40%, 60%, 80%) Khử trùng ở nồng độ 80% cho kết quả tốt nhất

™ Tạo protocorm trực tiếp từ mô lá:

Công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và TDZ thích hợp cho quá trình tạo protocorm: MS + đường (30 g/lít )+ PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) + TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít) + than hoạt tính (2 g/lít), pH = 5,8

MỤC LỤC

Trang tựa: i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC HÌNH vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 2

1.2.1 Mục tiêu 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô 3

2.1.1 Một số kết quả tiêu biểu trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật trên thế giới 3

2.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam 5

2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 6

2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 6

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 6

2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn 6

2.2.4 Nuôi cấy protoplast – lai protoplast 7

2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn 7

2.3 Quy trình nhân giống in vitro 7

2.3.1 Khử trùng mẫu cấy 7

2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 8

2.3.3 Nhân nhanh 8

2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh 8

2.3.5 Đưa cây ra đất 8

2.4 Những vấn đề còn tồn tại trong nhân giống cây trồng 9

2.4.1 Tính bất định về mặt di truyền 9

2.4.2 Sự hoại mẫu 9

2.4.3 Sử dụng thuốc kháng sinh 10

2.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy 10

2.4.5 Hiện tượng thủy tinh thể 10

2.5 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nông nghiệp 11

2.5.1 Vi nhân giống 11

2.5.2 Sản xuất và bảo quản cây sạch bệnh 12

2.5.3 Bảo quản và nhân giống in vitro 12

2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) 12

2.6.1 Auxin 12

2.6.2 Cytokinin 13

2.7 Sơ lược về lan hồ điệp 13

2.7.1 Vị trí phân loại 13

2.7.2 Nguồn gốc, xuất xứ 14

2.7.3 Mô tả hình thái 14

2.7.4 Trồng trọt và chăm sóc 17

2.7.5 Nhân giống truyền thống 20

2.8 Vi nhân giống Phalaenopsis 21

2.8.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh 21

2.8.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis 22

2.8.3 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis 23

2.8.4 Tăng trưởng PLB thành cây con 23

2.9 Giá trị kinh tế của lan hồ điệp 24

_Toc241549069Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 26

3.1 Thời gian và địa điểm 26

3.2 Phương tiện thí nghiệm 26

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 26

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 26

3.3 Tiến hành thí nghiệm 28

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy 28

3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp 29

3.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro 30

3.4 Xử lý số liệu 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy 32

4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp in vitro 35

4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro 43

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 50

PHỤ LỤC 53

PLB : Protocorm like body

IAA : Indol acetic acid

ĐHSTTV : Điều hòa sinh trưởng thực vật

PVP : Polyvinylpyrolidone

LLL : Lần lặp lại

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cây và hoa lan hồ điệp (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail) 14

Hình 2.2: Hoa lan hồ điệp 15

Hình 2.3: Trái lan hồ điệp 3 tháng tuổi (ảnh chụp tại Trại lan, Viện KHNN Miền Nam) 16

Hình 2.4: Keiki của lan hồ điệp (http://www.orchidshome.com) 16

Hình 2.6: Một số giống lan hồ điệp tại Việt Nam 25

Hình 3.1: Phát hoa lan hồ điệp, bộ phận lấy mẫu cấy 28

Hình 3.2: Mẫu lá lan hồ điệp ban đầu (a) và mẫu cấy (b) 29

Hình 4.1: Mẫu nảy chồi và hình thành hoa thứ cấp (20 NSC) 34

Hình 4.2: Protocorm được tạo ra trong điều kiện tối (80 NSC) 42

Hình 4.3: Protocorm tạo ra trong điều kiện sáng (80 NSC) 43

Hình 4.4: Cây lan hồ điệp ở giai đoạn 40 NSC 48

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo 7Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu 33Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ chết và tỷ lệ sống của mẫu 33Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ mẫu lá hình thành protocorm 35Bảng4.4:Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ đến phản ứng của mẫu.36Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ sống và tỷ lệ chết

của mẫu lá lan hồ điệp in vitro 37

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành

protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro 38

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới kích thước của protocorm 40

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan hồ điệp in

vitro 44

Bảng 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến số lá của lan hồ điệp in vitro 45 Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến kích thước lá và chiều cao của cây lan hồ điệp in

vitro 46

Hiện nay, thú chơi hoa kiểng không những là nhu cầu thiết yếu của đời sống xã hội, mà còn là một ngành kinh doanh mang lại hiệu quả kinh tế cao Nghề trồng lan hiện nay không còn là thú vui tiêu khiển mà đã trở thành hàng hoá Mặt hàng này không chỉ trao đổi trong nước mà đã thâm nhập ra thị trường thế giới, tạo ra nguồn hàng xuất khẩu có giá trị, đem lại nhiều ngoại tệ cho đất nước Những năm gần đây, ngành trồng lan ở Tp.Hồ Chí Minh có chiều hướng phát triển tốt Phong trào này lan rộng, không những ở các cơ quan nghiên cứu, cơ sở sản xuất mà còn ở các hộ gia đình Trong giai đoạn hiện nay, kỹ thuật nhân giống lan thông thường gần như không đủ đáp

ứng cho thị trường Do đó, nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày

càng có vai trò quan trọng

Hơn thế nữa, trên thị trường hoa - cây cảnh hiện nay, lan hồ điệp là loại lan có hoa đẹp, sang trọng, đa dạng, màu sắc phong phú, lâu tàn Chính vì thế, hoa lan hồ điệp mang ý nghĩa tinh thần và có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước ngoài Do khả năng tự sinh trong tự nhiên rất thấp, nên phương pháp gieo hạt trong

môi trường in vitro được sử dụng để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này Tuy

nhiên, những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, đặc điểm hoa không thuần nhất Người ta thường áp dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của cây để giữ nguyên những tính trạng quý về màu sắc, kích thước hoa, hình

dạng cánh, kiểu phân bố hoa trên trục phát hoa Từ nguồn nguyên liệu này, tùy theo mục đích mà áp dụng các phương pháp nhân nhanh khác nhau để cho ra số lượng lớn cây đồng nhất trong thời gian ngắn

Với lan hồ điệp, hiện nay bộ phận được sử dụng để vô mẫu phổ biến nhất là phát hoa Nguyên nhân là do khi cắt phát hoa thì cây vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường Ngoài ra trên phát hoa còn chứa nhiều mầm ngủ nên tạo được nguồn vật liệu nhân giống phong phú, mang lại giá trị kinh tế cao

Xuất phát từ những điều trên, đề tài nghiên cứu được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam gồm 2 nội dung: Xác định nồng độ nước javel và thời gian khử mẫu phát hoa của lan hồ điệp và theo dõi ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh

trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro

1.2 Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu

− Xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vào mẫu phát hoa cây lan hồ điệp

− Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự hình thành protocorm từ lá cây lan hồ điệp

− Xác định tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho quá trình sinh trưởng, phát triển lan hồ điệp

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô

2.1.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật trên thế giới

Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Shleiden và Schwam đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành Các tế bào phân hóa đều mang các thông tin di truyền ở trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể

Năm 1954, Skoog (Hoa Kỳ) tình cờ thấy, nếu thêm một chế phẩm đã để lâu của DNA lấy tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc

lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt

Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với việc phát hiện những vai trò của các vitamine và nước dừa là một bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là tiền đề kĩ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này

Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của

tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này được xác định trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy mô thực vật

Năm 1960, Berman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có tế bào dính cụm mà hầu hết là tế bào đơn Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong tạo cây hoàn chỉnh từ một

tế bào, chứng minh một cách rất tốt về tính toàn năng của tế bào thực vật

Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây làm hoàn chỉnh tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở thực vật bậc cao

Năm 1966, Guha và Mahes Wari công bố thành công cây đơn bội từ nuôi cấy

túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia) Đến nay việc tạo cây đơn bội thông qua

nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây (bắp, lúa, ) và đóng góp

vô cùng lớn vào việc tăng thêm kiến thức di truyền và thực tiễn chọn giống

Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nigata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một phần tế bào trong môi trường lỏng Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan từ bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả hơn

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng vấn đề biến tính của tế bào thực vật Ông cho rằng tế bào hạt giống thực vật có khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào trong tế bào DNA ngoại lai có thể gắn với DNA tế bào và có hoạt động biểu hiện tính

di truyền gây nên sự biến tính ở thực vật

Từ năm 1980 - 1992, hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật đã được công bố Nhờ có plasmid, phân tử DNA vòng thường có trong tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thực hiện thành công với nhiều họ thực vật Chỉ trong thời gian ngắn, các thành công này đã được các công ty cây trồng siêu quốc gia khai thác triệt để

Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống và phục tráng giống Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng

của các loại địa lan (Cybidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm Khi

chia cắt các protocorm và tiếp tục nuôi cấy thì thu được các protocorm mới Khi để trong điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con Hơn nữa các tế bào đỉnh sinh trưởng chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus

Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách cây nho và cây khoai tây, đem nuôi cấy và cấy chuyền nhiều lần trong ống nghiệm Tiếp sau đó, nuôi cấy mô được áp dụng quy mô sản xuất thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh

tế cao như chuối, cà phê, khoai tây, cây ăn quả có múi

Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô đang bước vào giai đoạn thứ 4 của quy trình phát triển Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

2.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật chỉ mới bắt đầu từ năm 1975 Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu Ý thức được triển vọng to lớn của ngành khoa học hiện đại này trong chọn giống và nhân giống cây trồng nông nghiệp, ở các cơ sở thuộc Trung Tâm Nghiên Cứu Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội, Tp.Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông Nghiệp

và Phát Triển Nông Thôn, Bộ Lâm Nghiệp, Bộ Y Tế, Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân đã chú ý xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu về ngành này

Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, năm 1993, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã đạt được một số thành tựu sau:

- Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L) bằng nuôi cấy mô thực vật (Trần

Văn Ngọc,Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển)

- Nhân giống vô tính cây cà phê (họ Rubiacea) (Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Uyển)

- Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống cây cỏ ngọt (họ Compositae) (Bùi Thị Tường Thu, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển)

- Nhân giống chuối (Mussa spp.) bằng phương pháp cấy mô (Đoàn Thị Ái

Thuyền, Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển)

- Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây kiwi (Actinidia chinensis Planch)

(Đoàn Thị Ái Thuyền)

- Nhân giống cây bắt ruồi (Nepenthes madagascariens) bằng phương pháp cấy

mô (Đoàn Thị Ái Thuyền)

- Nhân giống dứa Cayenene và Queen Long An bằng phương pháp nuôi cấy mô) (Nguyễn Đức Minh Hùng, Trần Văn Minh, Vũ Mỹ Liên, Thái Xuân Du)

- Nhân giống cây vani (Vanilla sp.) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên)

2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một trong những phương pháp để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên)

Sau khi vô trùng mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có chứa chất kích thích sinh trưởng thích hợp Từ đỉnh sinh trưởng sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân tạo lá để trở thành cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất để thích nghi dần

và phát triển bình thường

2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa Mô sẹo đã phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành một cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo

2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng, tế bào đơn được tách

ra và được trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo Khi trong môi trường thạch có tỉ lệ cytokinin/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.2.4 Nuôi cấy protoplast – lai protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đã tách lớp vỏ cellulose Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tạo lại màng tế bào, tiếp tục phân chia và tạo thành cây hoàn chỉnh

Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Sự dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài

2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn

Hạt phấn được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp để tạo thành mô sẹo

và tái sinh thành cây đơn bội

2.3 Quy trình nhân giống in vitro

2.3.1 Khử trùng mẫu cấy

Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như bảng 2.1:

Bảng 2.1: Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo

Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình

nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro

Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời kỳ sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

2.3.3 Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân,

ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường từ 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

2.3.5 Đưa cây ra đất

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá

trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong

thực tiễn sản xuất

Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống

hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng,

ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như ruộng sản xuất

2.4 Những vấn đề còn tồn tại trong nhân giống cây trồng

2.4.1 Tính bất định về mặt di truyền

Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn, nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng (Evans và Sharp, 1986, 1988; Larkin, 1987) nhưng rất ít những biến dị có ích được báo cáo

Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng,

số lượng, năng suất, và biến dị này không di truyền Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma như:

Kiểu di truyền: tần số biến dị bị ảnh hưởng bởi kiểu di truyền của các loại cây

trồng khác nhau

Thể bội: mức độ bội thể của cây trồng ảnh hưởng đến sự biến dị tự nhiên và tần

số biến dị Cây đa bội thể biến dị nhiều hơn cây nhị bội thể

Số lần cấy chuyền: số lần cấy chuyền càng nhiều thì cho tần số biến dị càng

cao Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988) Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị Tái sinh tế bào thông qua con đường phát sinh phôi cũng làm giảm sự biến dị,

nhưng không nhiều cây trồng có khả năng tái sinh qua quá trình phát sinh phôi

Loại mô: các bộ phận của cây trồng được sử dụng trong nuôi cấy mô có bộ máy

di truyền khác nhau Thông thường nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng hay chồi bên

không gây đột biến về năng suất

2.4.2 Sự hoại mẫu

Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro: (1) Bị vi sinh vật hủy hoại, có thể

khử trùng mẫu trước khi nuôi cấy vào môi trường (2) Bị virus hay thể giống như virus xâm nhiễm, không hoại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau Tuy nhiên có sự xâm nhiễm

của vi sinh vật như Agrobacterium, Baccilus, Corynebacterium, Erwinia,

Pseudomonas vào nhu mô dẫn truyền sẽ hại mẫu khi tế bào bắt đầu phân chia Để

giảm tác nhân gây nhiễm, mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh do ở đó sự sự biệt hóa tế bào nhu mô dân truyền chưa xảy ra quá trình biệt hóa

2.4.3 Sử dụng thuốc kháng sinh

Có nhiều loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô, nhằm hạn chế sự hoại mẫu của

vi sinh vật như: AmphotericinB, Nystatin, Kanamycin, Rifambicin Vancomycin, và penicilin khử được vi khuẩn gram (-) và gram (+), nấm mốc từng đơn chất hay phối hợp Nồng độ khử trùng 5 - 100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy như tế bào, tế bào trần hay mô Mô thực vật rất nhạy cảm đối với tác dụng thuốc kháng sinh và phản ứng khác nhau lên kiểu di truyền do đó phải rất cẩn thận khi sử dụng Sự hủy hoại của chất kháng sinh lên mô thực vật xảy ra ở plasmid hay mitochondria, xử lí càng lâu hay nồng độ càng cao dễ dàng dẫn đến sự thay đổi gen của tế bào chất hay DNA Chất kháng sinh được sử dụng ngăn chặn sự lây nhiễm hoại mẫu, nhưng sau đó mẫu được cấy sang môi trường không có chất kháng sinh

2.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy

Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu, sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay hydrophenol, có nhiều trong mô già hơn mô non Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thu hợp chất phenol ngăn chặn quá trình hóa nâu và đen Nhiều phương pháp làm giảm sự hóa nâu được đề nghị và được nhiều nhà khoa học đồng ý

- Sử dụng mẫu nhỏ của mô non

- Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng

- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy Nuôi cấy trong môi trường lỏng oxy thấp, không có đèn 1 - 2 tuần

- Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trường có nồng độ thấp sang môi trường có nồng độ cao hơn

2.4.5 Hiện tượng thủy tinh thể

Nhân giống vô tính in vitro chỉ có hiệu quả khi cây con chuyển ra đồng có tỷ lệ

sống cao Có một hiện tượng trong nuôi cấy mô làm cho tỷ lệ cây sống thấp khi chuyển cây ra khỏi bình nuôi cấy, cây non dễ dàng mất nước, đó là hiện tượng thủy tinh thể Đây

là một dạng bệnh sinh lý, được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: Translucency, Hyperhydration, Hyperhydric (Paek et al., 1991) Dạng này được nhận thấy khi nuôi cấy

trên môi trường lỏng hay môi trường có hàm lượng agar thấp, đặc biệt khi có sự trao đổi không khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây, hiện tượng này xảy ra ở nhiều loại cây trồng khác nhau

Đặc điểm cây thủy tinh thể: cây chứa nước trong suốt

Ngăn chặn hiện tượng thủy tinh thể: qua nghiên cứu quá trình xuất hiện và đặc điểm của những cây thủy tinh thể, có một số phương thức hạn chế sự xuất hiện như sau:

- Giảm sự tăng hấp thu nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao Nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi

- Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy

ít nhất ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng, nhưng các chất kích thích sinh trưởng khác không có tác dụng

- Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy

- Chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng tới cây thủy tinh

thể

- Giảm ethylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt (Paek và Han)

- Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ trong phòng cấy

Kết luận: phương thức hiệu quả nhất, ít nhất là giảm sự hóa thủy tinh của mô cấy

in vitro, làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách

tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường (yếu tố vật lý, nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí ) thích hợp

2.5 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nông nghiệp

Kỹ thuật nhân giống in vitro có nhiều ứng dụng trong cải thiện giống cây trồng:

- Tạo các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ

- Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn

- Tạo ra các cây con sạch bệnh

- Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất

- Việc trao đổi giống được dễ dàng

2.5.1 Vi nhân giống

Nhân giống vô tính in vitro được áp dụng phổ biến Kỹ thuật nhân nhanh in vitro khác với các kỹ thuật khác do sử dụng các kiểu nhân giống nhỏ in vitro, được nuôi cấy

trong điều kiện ổn định và môi trường nuôi cấy nhân tạo và có hệ số nhân hơn hẳn so với phương thức thông thường

Các ứng dụng nhân nhanh in vitro được kể như:

- Nhân nhanh các dòng lai mới trong thời gian ngắn với điều kiện đầu tư thấp

- Phục tráng các giống cây trồng bị bệnh

- Nhân nhanh các giống cây trồng có khả năng nhân tạo khó khăn

- Nhân nhanh số lượng trong thời gian ngắn và đảm bảo đặc tính di truyền bố mẹ

2.5.2 Sản xuất và bảo quản cây sạch bệnh

Công nghệ vi nhân giống có khả năng sản xuất hàng loạt cây sạch bệnh từ những cây bị bệnh virus mà bằng biện pháp hóa học không phòng chống được

2.5.3 Bảo quản và nhân giống in vitro

Phương thức duy nhất an toàn cho lai giống và tạo giống mới là phải có ngân hàng giống Giữ tập đoàn giống cho đến nay là một vấn đề nan giải cho những cây trồng

nhân vô tính hay đa bội Bảo quản in vitro trong thời gian dài bằng phương pháp sinh

trưởng chậm bước đầu đã giải quyết được một phần, nhưng những biến đổi di truyền có khả năng xảy ra qua thời gian nuôi cấy kéo dài, để hạn chế những biến dị này Withers

và Street (1977) đã đề nghị bảo quản giống bằng phương pháp lạnh sâu Cơ sở của phương pháp này là làm chậm hay ngăn chặn khả năng trao đổi chất của mô ở nhiệt độ -

196oC Có khoảng 40 loài đã được bảo quản theo phương pháp lạnh sâu như: nuôi cấy tế bào, mô sẹo, phôi, tế bào trần hay đỉnh sinh trưởng (Karth, 1987)

2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV)

Hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy mô là auxin

và cytokinin:

2.6.1 Auxin

Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh

Trong nuôi cấy mô thường sử dụng các chất như:

- Indol acetic acid (IAA)

- α - Naphthyl acetic acid (NAA)

- 2,4-Dichlorphenol acetic acid (2,4D)

- Indol butyric acid (IBA)

2.6.2 Cytokinin

Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào cấy mô và làm tăng tốc độ phân bào.khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy

Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá trình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin Trong một tỷ

lệ giữa cytokinin và auxin thì có kích thích tạo chồi hay tạo rễ, thông thường cytokinin cao hơn auxin thì kích thích tạo chồi còn ngược lại auxin cao hơn thì kích thích sự tạo

rễ Trong cơ thể thực vật cytokinin có tác dụng rất lớn là tăng cường sự tổng hợp ADN

và protein, kích thích quá trình trao đổi chất

Bao gồm các nhóm chất: 6-Benzylaaminopurin(BAP), 6-furpurin aminoopurin (kinetin), Zeatin, Thidiazuron(TDZ)

2.7 Sơ lược về lan hồ điệp

2.7.1 Vị trí phân loại

Giới (Kingdom): Plantae (thực vật)

Ngành (Division): Magnoliophyta (Ngọc lan)

Lớp (Class): Liliopsida (Hành)

Bộ(Order): Orchidales

Họ (Family): Orchidaceae

Họ phụ (Subfamily): Epidendroideae Tông (Tribe): Vandae

Tông phụ (subtribe): Aeridae Nhóm (Alliance): Phalaenopsis

Giống (Genus): Phalaenopsis

Loài (Species): Phalaenopsis sp

Tên tiếng việt: lan hồ điệp, tiểu hồ điệp

2.7.2 Nguồn gốc, xuất xứ

Lan hồ điệp được tìm thấy vào năm 1750, đầu tiên được Rumphius xác định dưới

tên Angraecum Đến năm 1753, Linne đồi lại là Epidendrum amabile Chi Phalaenopsis

do C L Blume phát hiện vào năm 1825 Phalaenopsis hay còn gọi là lan hồ điệp Tên

Phalaenopsis xuất hiện từ tiếng Hy Lạp: “Phalaina” (con bướm đêm) và “opsis”(trông

giống như), nghĩa là một loài hoa có hình dáng như bươm bướm

Hình 2.1: Cây và hoa lan hồ điệp (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail)

Năm 1887, loài hồ điệp lai đầu tiên được J Veitch đăng kí với tên P harriettiae,

từ việc kết hợp giữa P.amabilis và P.violacea Sau đó, có rất nhiều loài lan lai tạo ra làm tăng thêm sự đa dạng và huyền bí của Phalaenopsis

Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng, sống ở bán đảo Mã Lai,

Indonexia, Phillipine, các tỉnh phía đông Ấn Độ, và Châu Úc Chúng sống trên cây hoặc trên đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000m

Ở Việt Nam, chúng ta có thể bắt gặp một số loài lan hồ điệp trong các khu rừng

như P coenu (hồ điệp dẹp), P mannii ( hồ điệp ấn), P.parishii ( hồ điệp trung), P

pulcherrima (hồ điệp nhài)

2.7.3 Mô tả hình thái

2.7.3.1 Cơ quan sinh dưỡng

Lan hồ điệp thuộc nhóm lan đơn thân không có giả hành, gồm một trục chính tạo

ra bởi một đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục Các đốt thân rất ngắn và thường được bao bọc bởi hai hàng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân Hai hàng lá mọng nước hình elip xếp đối diện, tạo thành bẹ ôm lấy thân, lá dưới cùng héo rụng thì mới có lá khác mọc lên từ ngọn Trong giai đoạn tăng trưởng bình thường, do không có cơ quan dự trữ chuyên biệt nên chất dự trữ được chứa trực tiếp trong bộ lá mọng nước và chuyển dần lên phát hoa khi cây ra hoa, chính vì vậy mà mọi tổn thương trên bộ lá thường rất dễ gây ra thối

nhũn Thông thường một cây có từ 4 - 5 lá hoạt động, cá biệt ở một số loài có thể có ít

hơn (P borneo, P.violaceae) hoặc nhiều hơn

Mỗi trục lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho ra một trục phát hoa sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường hợp có sự cố về hoạt động của đỉnh sinh trưởng ngọn

Rễ bất định khí sinh rất nhiều, mọc từ gốc của thân xuyên qua bẹ lá Sự phân nhánh của rễ phụ thuộc vào giai đoạn tăng trưởng của cây Rễ mập với lớp mô xốp đặc trưng cho rễ khí sinh dày, làm nhiệm vụ hút hơi nước trong không khí, trong lớp xốp này có thể phân lập được nấm và nhiều loại vi khuẩn lam cộng sinh Mô rễ chứa diệp lục

có thể thực hiện quá trình quang hợp

2.7.3.2 Cơ quan sinh sản

− Hoa:

Phát hoa hình thành ở nách lá (thường là một phát hoa) Hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, đối xứng hai bên Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có màu sắc và hình dạng khác hẳn gọi là cánh môi Gốc cánh môi thường kéo dài ra chứa tuyến mật Nhị và nhụy dính liền thành một cột nhị nhụy

Hình 2.2: Hoa lan hồ điệp

Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn, có chuôi và gót dính ở phía dưới Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới Bộ nhụy gồm ba lá noãn dính nhau thành bầu

dưới, mang nhiều noãn, đính bên (Hoàng Thị Sản, 2003) Cả cành hoa nở liên tục hơn nửa năm Trung bình một phát hoa cho 7 – 15 hoa Mỗi hoa bền khoảng 2 tháng

− Quả:

Quả của lan hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nút dọc theo hai bên đường của giá noãn Quả lan chứa rất nhiều hạt, tùy vào giống, loài mà hạt có thể từ vài trăm đến vài ngàn hạt Hạt cần trải qua 130 – 150 ngày để hạt trưởng thành, hạt nở sau

90 ngày Hạt nhỏ được gió mang xa như hạt bụi, phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân hóa Theo Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào Trong thực nghiệm, người ta có thể đánh thức các “ phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường chứa sucrose

Hình 2.3: Trái lan hồ điệp 3 tháng tuổi (ảnh chụp tại Trại lan, Viện KHNN Miền Nam)

− Keiki:

Hình 2.4: Keiki của lan hồ điệp (http://www.orchidshome.com)

Keiki chỉ một cây con mọc từ một mắt trên cuống hoa Một số loài hoa nhỏ như

P lueddemanniana thường tạo Keiki trên cuống hoa Hiện tượng này được Williams mô

tả đầu tiên vào năm 1894 (Williams và Williams, 1894)

Keiki còn có thể được hình thành ở nhiều loài Phalaenopsis và một số loài thuộc các chi lai Các cây Phalaenopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo ra

keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ

2.7.4 Trồng trọt và chăm sóc

Việc trồng và chăm sóc lan hồ điệp gặp rất nhiều khó khăn, để có được những cây

khỏe mạnh, cho hoa đẹp cần phải tốn nhiều công sức và thời gian chăm sóc, vì vậy việc tìm hiểu điều kiện sống phù hợp của giống lan này là điều kiện cần thiết để có được những cây hoa chất lượng tốt

2.7.4.1 Nhiệt độ

Hồ điệp là một loài lan ở vùng nhiệt đới mà sự tăng trưởng của chúng chịu ảnh hưởng của hai mùa mưa nắng rõ rệt Tuy nhiên lan hồ điệp chỉ xuất hiện ở những vùng rừng ẩm hoặc ven suối Không có sự biến động đáng kể về nhiệt độ và ẩm độ giữa mùa mưa và mùa khô nơi hồ điệp sinh sống, vì thế cây hồ điệp không có mùa nghỉ mặc dù do

sự bất lợi về thời tiết trong mùa khô, cây hồ điệp tăng trưởng chậm hơn chút ít so với mùa mưa (trong điều kiện tự nhiên) Nhiệt độ thích hợp cho lan hồ điệp sinh trưởng và phát triển là 18oC vào ban đêm và 22oC - 25oC vào ban ngày Tuy nhiên hồ điệp là loài lan chịu nóng hơn đa số các loài khác, do đó nó cũng có thể tăng trưởng khá tốt ở bất cứ nơi nào nhiệt độ không quá 35oC vào ban ngày và 25oC vào ban đêm

2.7.4.2 Ánh sáng

Đây là loài lan có biên độ khá rộng về ánh sáng, ánh sáng hữu hiệu cho loài lan này là 30% Vì thế với giàn che có độ che sáng 70% là thích hợp Đây là loài lan duy nhất chịu được ánh sáng yếu, nhưng thực tế nhu cầu ánh sáng của chúng cao hơn nhiều,

vì thế không nên đặt lan hồ điệp vào nơi quá râm mát Ánh sáng rất cần thiết cho sự tăng trưởng và trổ hoa

Hồ điệp với bộ lá màu xanh đậm chưa phải là cây lí tưởng cho việc ra hoa, hơn nữa cây trồng trong điều kiện này có khẳ năng kháng bệnh kém Cây lan được đặt nơi có ánh sáng khuếch tán vừa phải với bộ lá có màu xanh, có ánh sáng nhẹ màu vàng là tốt nhất

Ở Việt Nam, nếu cây lan hồ điệp được trồng với 12 giờ chiếu sáng trong ngày, trong đó khoảng 1 - 2 giờ cây nhận được ánh sáng trực tiếp, cây sẽ phát triển tốt

2.7.4.3 Tưới nước

Hồ điệp là loại đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữa diện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho chúng lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm Trong mùa mưa mỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng, một lần lúc 3 giờ chiều Tưới như vậy sẽ đảm bảo cho cây khô ráo khi trời tối vì đọng nước ở nách lá suốt đêm có thể gây thối lá Tốt nhất nên tưới từ trên xuống và tưới nghiêng để nước không đọng trên hoa Vào mùa nắng nên tưới chúng 3 lần/ngày Nếu thời tiết trở nên quá lạnh thì phải đợi cho nước ấm hơn mới tưới cây để cây không bị rét vì nước quá lạnh sẽ làm rụng chồi

2.7.4.7 Giá thể

Đối với các cây trong chậu cao 13, 18, 25 cm thì sử dụng một lớp giá thể (vỏ cây, dớn) dày khoảng 13 cm trộn với 20% than hoạt tính loại tốt Trồng cây vào chậu, sau đó thêm lên bề mặt chậu hỗn hợp giá thể tương tự để giữ ẩm cho rễ Sử dụng hỗn hợp giá thể phù hợp, không quá khô cũng không quá ẩm ướt

2.7.4.8 Nơi trồng

Cây nên được trồng trong vườn ươm hoặc những nơi có điều kiện tương tự nhưng phải được thông khí từ hai phía Chúng ta còn có thể trồng cây bên ngoài nhà kính, trong các hành lang, sân nhà có rào, hướng nam, khi đó cây cần có ẩm độ phù hợp

và hứng được ánh sáng vừa đủ, nên để cây cạnh cửa sổ hướng nam, nhiều bóng râm là phù hợp

− Vào tháng 5 đến tháng 10, sử dụng dung dịch: 17,5N - 4,6P - 22,5K để cây phát triển cứng cáp

− Từ tháng 10 đến tháng 12 cần tưới 20,3N - 3,3P - 17K giúp cho tế bào phân chia nhanh Tuy nhiên, một số trường hợp cây sẽ bị mềm và yếu nếu sử dụng quá lâu Chú ý cắt bỏ rễ hư hỏng của cây và rửa với dung dịch mancozeb chuẩn trong 10 phút Sử dụng dao sạch khuẩn để phòng bệnh cho cây

Vào thời điểm có hoa cần chú ý tạo dáng cho cành hoa sớm để có được vòm hoa đẹp Khi cụm hoa bắt đầu rộ, chúng ta không nên di chuyển cây, thời gian này cần tăng cường ánh sáng và dinh dưỡng cho cây

2.7.5 Nhân giống truyền thống

2.7.5.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt

Trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện Cánh môi của hoa lan có hình dạng và cấu tạo đặc biệt thuận lợi cho côn trùng đậu vào, tiếp xúc với khối phấn và mang phấn đi Thông thường, để đạt tỷ lệ thụ phấn thành công cao, con người cần chủ động thụ phấn cho cây

Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã khám phá ra được nguyên nhân làm cho hạt lan có thể nảy mầm liên quan đến sự có mặt của nấm rễ Nếu không có nấm cộng sinh thì lan không thể nảy mầm Với vai trò là nguồn cung cấp đường cho hạt lan,

hệ thống rễ sợi của nấm xâm nhập vào trong phôi và cung cấp nguồn cacbon cho phôi phát triển

Năm 1922, Knudsun đã nghiên cứu thành công việc thay nấm bằng đường ở môi

trường thạch để gieo hạt Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và

việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn Khi qủa đã chín 2/3 có thể khử trùng quả bàng dung dịch thuốc tẩy và cồn Sau đó dùng một con dao tách vỏ và lấy hạt ra để lên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Sau khi hạt nảy mầm được 30 - 60 ngày chuyển cây con sang môi trường mới Rễ thường hình thành khi cây con có từ 2 - 3 lá Cấy chuyển cây con sau mỗi 30 - 60 ngày đồng thời giảm mật độ cây trong bình

Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây có thể ra hoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn tùy giống Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật ở các cây họ lan là biến dị xảy ra thường xuyên và dễ dàng, điều này đã giúp mang lại sự đa dạng cho các loài lan nhưng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân giống vì các cây con tạo thành từ hạt không đồng nhất về mặt di truyền

2.7.5.2 Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết

Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng Trong điều kiện ẩm độ tốt hoặc trồng trong các nhà kính mang tiểu khí hậu nhân tạo thì có thể

tách chiết quanh năm

Vào thời kỳ cuối mùa sinh trưởng của cây, cây được cắt rời thành từng đoạn lan

và vẫn giữ nguyên trong chậu Sau một thời gian, lấy cây đem cắt bỏ các rễ hư rồi rửa bằng dung dịch khử trùng để tiêu diệt hết mầm mống gây bệnh Sau đó đặt các đoạn lan

vừa tách chiết vào giữa chậu mới Để cây ở nơi có điều kiện ẩm độ và ánh sáng thích hợp với từng loại cụ thể để cây sinh trưởng và phát triển tốt

Những loài lan đơn thân như Phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng lâu

năm cây vẫn cao lên, có nhiều rễ gió Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3 rễ, bôi thuốc kích thích ra rễ, dùng giá thể thật thoáng với than gỗ to Phần bên gốc cây cắt sát

sẽ nảy ra 2 - 3 cây con ở nách lá gần chỗ cắt Có thể dùng dây kẽm siết chặt giữa thân cây, dưới chỗ cột sẽ mọc ra 2 - 3 cây con Khi hoa tàn thì cắt bỏ chừa 3 - 4 mắt phía trên

phát hoa, những mắt này sẽ mọc lên cây con Phalaenopsis trồng lâu năm có thể ra cây

con từ các nách lá ở gần dưới gốc

Việc nhân giống vô tính bằng phương pháp tách chiết truyền thống tạo được cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao

2.8 Vi nhân giống Phalaenopsis

Hầu hết các giống lan rất dễ xảy ra biến dị, vì vậy việc nuôi cấy hạt không thể tạo được cây con đồng nhất (Arditti, 1992) Vì vậy, để sản xuất cây con đồng loạt cần phải

áp dụng phương pháp nhân giống vô tính

Khó khăn lớn nhất trong nhân giống vô tính Phalaenopsis là nguồn mẫu rất hạn

chế do chúng là lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để nuôi cấy như nhiều loài lan khác sẽ

làm tổn thương cây mẹ (Intuwong và Sagawa, 1974) Hơn nữa, Phalaenopsis thường

tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt cắt ra môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu (Fast, 1979)

Một số phương pháp nhân giống vô tính Phalaenopsis thành công được trình bày

sau đây:

2.8.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh

Chồi đỉnh của cây Phalaenopsis khi bị tổn thương hoặc già cỗi có khả năng được

tạo ra được một hoặc nhiều chồi từ các chồi ngủ ở gốc Từ quan sát này, các nhà làm vườn đã mạnh dạn cắt phần phía dưới các rễ khí của cây và nuôi cấy riêng lẻ chúng để nhân thành các cây mới theo ý muốn

Phương pháp này được xem là phổ biến nhất Chồi có thể phát triển từ phần gốc khi được nuôi cấy ở 27oC (Trần Thanh Vân, 1974) Từ phương pháp này, một chồi ban đầu có thể tạo ra 3 - 4 chồi khác trong 10 tháng (Trần Thanh Vân, 1974) Các chồi sinh

dưỡng phát triển thành chồi ngủ trên trục cây Phalaenopsis, từ nách lá mỗi chồi sẽ tạo ra

2 chồi mới (Koch, 1974, Holters, 1983)

Phương pháp sử dụng chồi đỉnh được ứng dụng thành công cho nhiều loài lan

Tuy nhiên, đối với các loài lan đơn thân như Phalaenopsis, khi sử dụng phương pháp

nuôi cấy chồi đỉnh sẽ làm tổn thương cây mẹ, do đó, hiện nay phương pháp nhân giống

sử dụng phát hoa được sử dụng phổ biến hơn

2.8.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis

Gavino Rotor là người đầu tiên trong việc nhân giống vô tính in vitro lan hồ điệp

khi còn là nghiên cứu sinh Lawrence McDaniels Đại Học Cornell (Rotor, 1949) Ông đã

sử dụng phát hoa đã bỏ lá bắc mang 4 - 6 chồi, cắt phát hoa thành các đoạn mang một chồi nằm giữa cách hai đầu cắt 7 - 8 cm Sau đó khử trùng bề mặt và cắt vô trùng thành các đoạn mang chồi cách hai đầu 1- 2 cm

Cấy các đoạn phát hoa vào môi trường Knudson C làm rắn với agar, các đoạn phát hoa được cắm thẳng cho chồi hướng lên

Phương pháp của Rotor ít được chú ý đến do tỷ lệ nhiễm cao và hệ số nhân thấp Nhưng 10 năm sau đó những nhà nghiên cứu khác đã tạo ra nhiều quy trình mới dựa trên phương pháp này (Sagawa và Niimoto, 1960; Sagawa, 1961; Kotomori và Murashige, 1965; Scully, 1966)

Hình 2.5: Quy trình tái sinh cây con từ phát hoa lan hồ điệp

Phương pháp nhân giống từ phát hoa là phương pháp đặc trưng ở Phalaenopsis

Ưu điểm chính của phương pháp này là tạo ra cây con sạch bệnh và đồng nhất về di

truyền, điều mà gieo hạt truyền thống không thể đạt được Ngoài ra, việc nhân giống in

vitro từ phát hoa có ưu điểm lớn là không làm tổn thương cây mẹ, so với việc nhân

giống từ ngọn chồi hoặc lá trưởng thành từ cây mẹ Tuy nhiên, phương pháp này có khuyết điểm là hệ số nhân thấp Do vậy phương pháp nhân giống vô tính từ phát hoa

thường được sử dụng để tạo nguồn nguyên liệu mô in vitro cho các phương pháp hiệu quả hơn sau này Một số phương pháp mới như phát sinh PLB trực tiếp từ mô in vitro, tạo mô sẹo và phát sinh phôi vô tính đem lại hệ số nhân cao đều dựa vào nguồn mẫu in

vitro tạo thành nhờ nuôi cấy phát hoa (Tanaka và cộng sự, 1977; Park và cộng sự, 2000,

2002)

2.8.3 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis

M.Tanaka và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu việc nhân giống vô tính cây

Phalaenopsis từ mô lá tại trường đại học Osaka, Nhật Bản (Tanaka và cộng sự, 1975;

Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980, 1985) Nguyên liệu cho các thí nghiệm ban đầu của

nhóm là mô lá lấy từ cây trưởng thành và từ cây con in vitro tạo thành từ gieo hạt Tuy

nhiên các lá trưởng thành này không có khả năng tạo PLB, trong khi đó lá các cây con mới nảy mầm lai tạo được PLB Như vậy, khả năng tạo PLB giảm xuống khi tuổi cây giống tăng lên (Tanaka và cộng sự, 1975) Theo phương pháp này, PLB có thể tạo ra từ

nuôi cấy mẫu lá in vitro trên môi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB

(từ 1 đến 7 PLB) tại mặt cắt của mẫu lá Các PLB này có thể được biệt hóa tiếp tục trên môi trường lỏng Vacin – Went bổ sung 20% nước dừa và tiếp tục được tái sinh trên môi

trường gieo hạt Phalaenopsis Sau khi chuyển sang vườn ươm cây tiếp tục phát triển

bình thường và nở hoa Quy trình này tạo được số lượng lớn cây giống đồng nhất về mặt

di truyền

2.8.4 Tăng trưởng PLB thành cây con

Cho đến nay, chưa có nhiều công trình nghiên cứu nhằm tối ưu hóa giai đoạn tăng trưởng PLB thành cây con, chủ yếu chỉ theo dõi ảnh hưởng của các chất bổ sung lên tốc độ tăng trưởng chứng tỏ là quá trình sản xuất trong thực tế đã khá hoàn thiện về giai đoạn này

Nghiên cứu về việc sử dụng các chất chống nâu hóa trong giai đoạn này, cho thấy chồi con phát triển tối đa trong môi trường bổ sung 2 g/l than hoạt tính

Khảo sát của Rahman A và cộng sự chứng tỏ chồi non tăng trưởng mạnh trên môi trường bổ sung 50 ml/lít cao bắp, tốt hơn dịch khoai tây và đu đủ

Một vấn đề thực tế là quá trình tăng trưởng PLB của cây con thường xảy ra không ổn định, điều này thường gặp ở rất nhiều cơ sở sản xuất giống lan hồ điệp trong nước PLB có xu hướng tạo thành cụm chồi nhiều hơn là chồi, làm giảm tốc độ tăng trưởng riêng của chồi, buộc người sản xuất phải có thêm một đợt cấy chuyền không mong muốn Vần đề này có thể được giải quyết bằng cách bổ sung IAA thay cho NAA

ở cùng nồng độ

2.9 Giá trị kinh tế của lan hồ điệp

Hồ điệp không chỉ phổ biến ở Nam Mĩ, trong những năm gần đây, hồ điệp trở thành loại hoa trồng chậu có giá trị nhất trong ngành công nghiệp trồng hoa ở Hà Lan Chúng còn là những món quà xa xỉ ở các nước Châu Á đặc biệt là Nhật Bản Ngoài ra các loài hoa đẹp, xa xỉ cũng được nhập vào Mỹ để trang trí chậu hoặc dưới dạng quà tặng cao cấp

Lan hồ điệp, là một loài lan có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, cũng

là một loài cây rất thích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa Hơn nữa, trong vài thập kỉ gần đây nền công nghệ trồng lan phát triển giúp người trồng đã giảm giá thành đáng kể đối với loại lan này nên giá cả phù hợp với những người mê hoa hay người mới tập trồng Hồ điệp rất được ưa chuộng và được trồng ở nhiều nơi Trước đây, hồ điệp có giá khá cao, nên được xem là một loại hàng hoá cao cấp trên thị trường Trong 20 năm trở lại đây, công nghệ hiện đại và các nghiên cứu đã giúp cho loại sản phẩm này trở nên phổ biến với người tiêu dùng, đặc biệt là trong các ngày lễ Thêm vào đó, công nghệ lai giống và gieo hạt ngày càng tạo nên nhiều chủng loại giống mới, nổi bật về màu hoa, kích thước hoa…Điều này làm cho người tiêu dùng rất thích thú với thú chơi lan và tạo nên những cơn sốt hoa lan trên thị trường thế giới

Hồ điệp được trồng ở mọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và Mỹ Cây con được nuôi cấy mô ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan sau đó cây con lại được xuất khẩu cho các nước khác với cả Mỹ

để trồng ra hoa Hàng ngàn các giống được lai và tạo dòng rất có giá trị trên thị trường

Các nhà nhân giống đã gieo hạt được rất nhiều giống hồ điệp có chất lượng hoa và cây giống rất có giá trị như các tính trạng qui định màu sắc hoa, và cấu trúc hoa, nhiều nhánh, nhiều vòi hoa, và gần đây là các giống có hương thơm Cuộc chạy đua diễn ra hầu hết tại Đài Loan, điều này dẫn đến một hệ quả là các giống có giá trị hiện nay có thể không còn giá trị chỉ trong vài năm nữa

P fuscata P.venosa P.amboinensis

P.schilleriana P.equestris P.amabilis

P.harriettiae P.violacea P.deventerian

P harlequin P gibbosa P lobbii

Hình 2.6: Một số giống lan hồ điệp tại Việt Nam

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện từ tháng 2 - 2009 đến tháng 7 - 2009 tại phòng di truyền giống cây trồng - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, số 121 Nguyễn Bỉnh Khiêm, Quận 1, Tp.Hồ Chí Minh

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên giống lan hồ điệp lai Phalaenopsis sp tại Viện

Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

− Bàn để môi trường và mẫu cấy

− Các dụng cụ thao tác: dao, kéo, pen, đèn cồn, bình tia, bông gòn thấm nước

Ghi chú: tất cả phải được hấp vô trùng

Phòng nuôi cấy:

− Các kệ để bình hay ống nghiệm nuôi cấy

− Máy điều hòa nhiệt độ: nhiệt độ phòng cấy từ 24oC đến 25oC

− Phòng sáng được trang bị 2 máy lạnh Panasonic chỉnh nhiệt độ 25oC, chiếu sáng

bằng đèn Compact 3U theo quang kì 16 giờ sáng/8 giờ tối, cường độ ánh sáng là

2000 lux Ẩm độ không khí trong phòng biến động từ 50 - 70%

Môi trường nuôi cấy: môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường MS

(Murashige và Skoog, 1962)

Thành phần Nồng độ Các nguyên tố đa lượng

Các chất điều hòa sinh trưởng:

BAP (6-benzyladenine), NAA (∝ - naphthaleneacetic acid), TDZ (Thidiazuron)

Các chất khác: đường glucose, agar, nước dừa Môi trường nuôi cấy được điều

chỉnh bằng NaOH hoặc HCl để đạt pH = 5,8

3.3 Tiến hành thí nghiệm

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của

mẫu cấy

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vô trùng mẫu

cấy lan hồ điệp nhằm tạo nguồn mẫu sạch bệnh ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp

theo

Vật liệu thí nghiệm: các mắt ngủ được cắt từ phát hoa của lan hồ điệp

Hình 3.1: Phát hoa lan hồ điệp, bộ phận lấy mẫu cấy

Môi trường vào mẫu: MS + agar (8 g/lít) + đường (30 g/lít) + than hoạt tính (2

g/lít)+ nước dừa (10 ml/lít) + BAP (2 mg/lít), pH = 5,8

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu

tố , 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức cấy 20 mẫu

Quan sát và ghi nhận tỷ lệ mẫu sống: 10 ngày sau xử lý, 20 ngày sau xử lý, 30 ngày sau xử lý

Chỉ tiêu theo dõi:

Mục tiêu thí nghiệm: tìm nồng độ BA, TDZ và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho

quá trình tạo protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro

Vật liệu thí nghiệm: lá của lan hồ điệp lai được nuôi cấy in vitro

a) b)

Hình 3.2: Mẫu lá lan hồ điệp ban đầu (a) và mẫu cấy (b)

Các nghiệm thức:

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên hai yếu

tố gồm 22 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức cấy 30 mẫu Trong đó, yếu tố A :

điều kiện nuôi cấy; yếu tố B: nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

Môi trường nền (MTN): môi trường MS + đường (30 g/lít) + PVP (100 mg/lít),

NAA (1 mg/lít), agar (8 g/lít), than hoạt tính (2 g/lít), pH = 5,8

Quan sát và ghi nhận tỷ lệ tạo protocorm 80 ngày sau cấy

Chỉ tiêu theo dõi:

Tổng số mẫu tạo protocorm

− Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) = - x 100

− Đường kính khối protocorm

− Chiều cao khối protocorm

3.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát

triển của cây lan hồ điệp in vitro

Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA và BAP thích hợp cho cây lan hồ

15 15 4

3 3 5

6 6 6

9 9 7 TDZ (mg)

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4

nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại cấy 3 chai, mỗi chai cấy 5 mẫu

Môi trường nền: MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2

Chỉ tiêu theo dõi:

− Thời gian tạo rễ (NSC): tính từ ngày bắt đầu cấy đến ngày mẫu cấy ra rễ đầu

− Chiều cao chồi: đo từ gốc đến chữ v trên cùng

Các chỉ tiêu được tiến hành theo dõi ở 20 ngày sau cấy, 10 ngày theo dõi 1 lần

3.4 Xử lý số liệu

Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm

thống kê MSTATC