Tổng Quan Về Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Tạo Hạt Nhân Tạo Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis Sp.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỔNG QUAN VỀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP (Phalaenopsis sp.) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 106111004 : QUÁCH VĂN HẢO Lớp: 07DSH1 TP Hồ Chí Minh, 2014 LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập trường, có khó khăn em gặp phải mà tự thân em thấy gần sụp đổ Khi đó, bên cạnh bao bọc gia đình có hướng dẫn giúp đỡ tận tình nhà trường, thầy giúp em vượt qua khó khăn để hồn thành khóa học ngày hơm Em xin chân thành biết ơn sâu sắc đến tất người cố gắng để đạt thành công sống Cảm ơn cha mẹ - người sinh thành, nuôi nấng hi sinh cho ăn học có vấp ngã cha mẹ bao dung trở che cho bước tiếp đường học vấn trường đời Cảm ơn ban lãnh đạo nhà trường tạo điều kiện giúp đỡ cho e có hội sửa sai hồn thành khóa học Cảm ơn thầy phòng tư vấn giải học vụ tận tình hướng dẫn giúp đỡ em thủ tục học vụ Cảm ơn ban lãnh đạo khoa, thầy cô khoa CNSH – TP – MT thầy cô môn liên quan khác nỗ lực giảng dạy giúp đỡ chúng em học tốt, tiếp thu kiến thức để trang bị cho thân đời làm việc Em cảm ơn nhiều giúp đỡ tận tình hai thư ký khoa : Yến Ly cô Vân hướng dẫn giúp đỡ em cách giải em gặp phải khó khăn việc học Cảm ơn Nguyễn Thị Thu Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em việc chọn đề tài làm đồ án tốt nghiệp Cảm ơn người bạn, người anh em giúp đỡ, động viên tiếp thêm sức mạnh tinh thần để em tự tin thân sống để tiếp tục học tập TP.HCM, ngày 28 tháng 07 năm 2014 Sinh viên Quách Văn Hảo Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Đối tượng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu 5 Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu ĐATN (Đồ án tốt nghiệp) PHẦN II: NỘI DUNG CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Tổng quan lan Hồ Điệp 1.1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm hình thái - sinh lý 1.1.1.3 Các điều kiện thích hợp cho lan Hồ Điệp 10 1.1.2 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp giới Việt Nam 11 1.1.2.1 Tình hình sản xuất hoa Lan giới 11 1.1.2.2 Tình hình sản xuất hoa Lan Việt Nam 12 1.2 Tổng quan vấn đề nghiên cứu 13 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu hạt nhân tạo 13 i Đồ án tốt nghiệp 1.2.1.1 Trên giới 13 1.2.1.2 Trong nước 14 1.2.2 Tình hình nghiên cứu hạt nhân tạo 14 1.2.3 Tổng quan quy trình tạo hạt nhân tạo 16 1.2.3.1 Các nguồn mẫu làm hạt nhân tạo 16 1.2.3.2 Vật liệu làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo 18 1.2.4 Ưu nhược điểm hạt nhân tạo 19 1.2.5 Ứng dụng hạt nhân tạo 20 1.2.6 Giới thiệu số công nghệ vi nhân giống khác 20 1.2.6.1 Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng 21 1.2.6.2 Công nghệ nuôi cấy lỏng lắc 21 1.2.6.3 Hệ thống bình ni cấy Bioreactor 22 1.2.6.4 Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System) 23 CHƯƠNG 2: QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 25 2.1 Kỹ thuật phát sinh phôi soma, PLB chuẩn bị mẫu cho tạo hạt nhân tạo 25 2.1.1 Kỹ thuật phát sinh phôi soma 25 2.1.1.1 Phát sinh tăng sinh mô sẹo 25 2.1.1.2 Phát sinh phôi soma 27 2.1.2 Kỹ thuật phát sinh PLB 28 2.2 Quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30 2.2.1 Sơ đồ quy trình 30 2.2.2 Thuyết minh quy trình 31 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tạo hạt nhân tạo 35 CHƯƠNG 3: CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUY TRÌNH TẠO HẠT NHÂN TẠO LAN HỒ ĐIỆP 36 3.1 Các kết nghiên cứu tạo mô sẹo tạo phơi vơ tính 36 3.2 Các kết nghiên cứu tạo PLB 42 3.3 Các kết nghiên cứu tạo chồi 42 ii Đồ án tốt nghiệp 3.4 Các kết nghiên cứu tạo hạt nhân tạo 44 PHẦN III: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 47 Kết luận quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 47 Những nhân tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxyacetic BAP (BA): 6-benzylaminopurine benzyladenine ĐHST: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật GA3: Giberellin Kinetin: 6-furfurylaminopurine N-(2-furanylmethyl)-1H-purine-6-amine MS: (Murashige Skoog, 1962) NAA: α-Naphthaleneacetic acid NSC: Thời gian hình thành mơ sẹo, tính từ ngày cấy chuyền đến có 50% mẫu cấy xuất mô sẹo PLB: Protocorm like body TDZ: (Thidiazuron [1-phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea]) VW: (Vacin Went, 1949) Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine 6-(4-hydro-3- methylbut-2-enyl)-aminopurine 2-methyl-4(-1H-purine-6-ylamino)-2-buten-1ol) iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thành phần khoáng môi trường MS 29 Bảng 2.2: Thành phần khống mơi trường VW 29 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: Một số hình ảnh lồi hoa lan Hồ Điệp Hình 1.1: Một số loài hoa lan Hồ Điệp Hình 1.2: Cấu tạo hạt nhân tạo 16 Hình 1.3: Phơi hình cầu, hình tim, hình thủy lơi 17 Hình 1.4: Hình dạng PLB quan sát kính hiển vi soi 18 Hình 1.5: Cơng thức hóa học alginate 19 Hình 1.6: Hệ thống vi nhân giống quang tự dưỡng 21 Hình 1.7: Hệ thống Bioreactor 23 Hình 2.1: Quy trình nhân giống lan Hồ Điệp nuôi cấy phát hoa 25 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp 30 Hình 2.3: Mơ sẹo lan Hồ Điệp 31 Hình 2.4: Phơi vơ tình hình thành từ mô sẹo lan Hồ Điệp 32 Hình 2.5: PLB lan Hồ Điệp 32 Hình 2.6: Mẫu alginate hút đồng thời vào pipette 33 Hình 2.7: Cho alginate nhỏ giọt thêm mẫu vào 34 Hình 2.8: Hạt nhân tạo 34 Hình 3.1: Màu sắc mơ sẹo mơi trường có 2,4-D BA 37 Hình 3.2: Mơ sẹo lan Hồ Điệp mơi trường TDZ 2mg/l 38 Hình 3.3: Phơi lan Hồ Điệp hình thành mơi trường đặc ½VW 39 Hình 3.4: Chồi hình thành từ PLB lan Hồ Điệp 43 Hình 3.5: Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo 43 Hình 3.6: Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp nồng độ alginate 44 Hình 3.7: Hạt nhân tạo nảy mầm 45 vi Đồ án tốt nghiệp PHẦN I: MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Từ lâu hoa Lan tôn vinh “Mỹ Nữ Sơn Lâm” loài hoa Hoa Lan đẹp trang nhã màu sắc, kiểu dáng, sức sống độ bền hoa Có lẽ mà hoa Lan trở thành biểu tượng cao quý, lịch lãm, phong lưu đẹp khiết Trong dân gian lưu truyền nhiều câu chuyện có liên quan đến loài hoa Người ca ngợi hoa Lan đức Khổng Phu Tử (Trung Quốc - 551 B.C), ví hoa Lan lồi hoa qn tử… Tương truyền nước ta có kể rằng: vua Trần Nhân Tông rời kinh thành Yên Tử, Quảng Ninh đêm ngủ mộng ngài thấy có người đến yết kiến dâng tặng giò hoa đẹp Sáng nghi nghi hoặc nhà vua sâu vào núi bắt gặp khe sâu có lồi hoa lạ, đẹp vơ khiết Đời sau người ta gọi loài hoa lan Trần Mộng (giấc mộng vua Trần) để điển tích rũ bụi trần bước vào cõi khiết ngài Khi đời sống kinh tế người dân dần nâng cao, việc chăm sóc cho đời sống tinh thần quan tâm Đối với gia đình, cá nhân nơi thị chật hẹp mong muốn đưa chút màu xanh, chút khơng khí thiên nhiên việc trưng bày trang trí vào khơng gian sống lựa chọn trồng hoa Lan quan tâm Ngày nay, thấy hoa Lan khắp nơi dễ bị choáng ngợp trước vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa mn màu mn vẻ loài hoa Lan như: Hồ Điệp, Mokara, Vanda, Cymbidium, Oncidium, Địa Lan, Vũ nữ… Ở Việt Nam nghề trồng Lan phát triển chậm so với nước khác nhiều Việc trồng Lan lâu chủ yếu tự phát nên diện tích trồng nhỏ trình độ tay nghề người nơng dân chưa đồng đều, người trồng Lan chưa chủ động nguồn giống việc trồng Lan gặp nhiều khó khăn đặc biệt trồng lan Hồ Điệp Loại Lan trồng khó phải đầu tư lớn, từ việc Đồ án tốt nghiệp cung cấp dưỡng chất giữ ẩm thiết bị nhà ươm, chăm sóc… phải nhập ngoại chịu thuế cao Đặc biệt, lan Hồ Điệp cần hai năm cho thu hoạch Trước xu hướng phát triển thị trường nước trồng Lan sản phẩm hoa Lan sản xuất ngày nhiều dẫn đến bão hòa thị trường lợi nhuận thu không tương xứng với công sức bỏ Trước tình hình đó, năm gần đây, với phát triển công nghệ sinh học, ngành vi nhân giống đặc biệt đối tượng hoa Lan bước phát triển Nhiều đơn vị nhà nước tư nhân mạnh dạn đầu tư để sản xuất giống phục vụ cho nơng dân Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp nhằm tạo nguồn hoa ổn định Từ nuôi cấy mơ, nguồn gene từ dòng Lan sưu tập lưu giữ lại để nâng cao chất lượng giống đồng thời tổ chức nhân nhanh để cung cấp giống cho nhu cầu thị trường nước Quy trình ni cấy in vitro từ đỉnh sinh trưởng hay điểm sinh trưởng tạo đồng tính trạng, có tăng trưởng chất lượng hoa đồng Tuy có số thành tựu đáng kể thực tế nhiều hạn chế khơng thể thực quy mô lớn, việc vận chuyển tới tay người nơng dân nơi gieo trồng nhiều khó khăn Các nghiên cứu “Kỹ thuật phát sinh phôi soma tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)” khắc phục số hạn chế ni cấy in vitro nói Đề tài “Tổng quan yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.)” với mong muốn hoàn thiện cho quy trình tạo hạt nhân tạo, góp phần vào công nghiệp sản xuất hoa lan Hồ Điệp Đối tượng nghiên cứu Hoa Lan quà tạo hóa, khơng lồi hoa đẹp có giá trị mặt tinh thần mà có giá trị kinh tế cao có thị trường tiêu thụ mạnh nước xuất Trong lan Hồ Điệp ưa chuộng trồng phổ biến đặc điểm màu sắc hoa, cấu trúc hoa, nhánh hoa, vòi hoa gần giống có hương thơm Đặc biệt, hoa lan Hồ Điệp có độ bền cao nên thu hoạch dạng cắt cành, việc đóng góp Đồ án tốt nghiệp ➢ Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng TDZ điều kiện môi trường đặc, lỏng lắc đến khả hình thành phơi soma từ mơ sẹo lan Hồ Điệp in vitro (45NSC) (Liêu Hồng Phú, 2005) TDZ chất kích thích sinh trưởng đặc biệt thuộc nhóm cytokinin Ngồi tính chất tạo chồi cytokinin có khả tăng sinh mơ sẹo auxin TDZ dùng thay cho auxin tổ hợp auxin cytokinin hình thành phơi nhiều lồi khác Q trình trải qua bước: Bước 1: Tăng sinh mô sẹo ✓ Nuôi cấy môi trường đặc Sau 30 - 45 ngày, mô sẹo nuôi cấy môi trường đặc phát triển tốt, sinh khối tăng nhanh phát triển mô sẹo nghiệm thức ✓ Nuôi cấy mơi trường lỏng lắc (100 vòng/phút) Khi nuôi cấy môi trường lỏng lắc, lượng sinh khối tạo so với ni cấy mơi trường đặc, phần lớn có màu tối Trong đó, mơi trường VW bổ sung mg/l TDZ có lượng sinh khối cao màu sáng mơi trường lại, đặc biệt xuất số mơ sẹo có màu xanh Mơi trường đặc Mơi trường lỏng lắc Hình 3.2: Mơ sẹo lan Hồ Điệp môi trường TDZ mg/l 38 Đồ án tốt nghiệp Bước 2: Phát sinh phôi soma Mô sẹo từ bình ni cấy tăng sinh tách thành cụm nhỏ cấy chuyền sang môi trường đặc ½VW Sự phát sinh phơi vơ tính có khác biệt đáng kể mẫu cấy chuyền từ bình ni cấy tăng sinh Mơ sẹo từ bình ni cấy đặc ban đầu tiếp tục gia tăng sinh khối, có số phơi vơ tính xuất Mơ sẹo từ bình ni cấy lỏng lắc có kết cấu tạo lượng phơi vơ tính nhiều Số phơi hình thành từ mẫu cấy cảm ứng môi trường lỏng lắc với nồng độ TDZ mg/l nhiều (39,67 phôi) Vậy việc thêm vào môi trường ni cấy TDZ nồng độ mg/l thích hợp cho việc cảm ứng tạo phơi vơ tính lan Hồ Điệp Thêm vào đó, giai đoạn ni cấy mô sẹo điều kiện lỏng lắc cần thiết cho việc cảm ứng tạo phơi, phơi vơ tính hình thành nhiều dễ nhận biết Mơi trường nuôi cấy đặc ban đầu tạo phôi vơ tính, nhiên tỉ lệ phơi vơ tính tạo thành không cao nên phương pháp không cho kết tốt A: Từ mô sẹo nuôi môi trường đặc bổ sung mg/l TDZ B: Từ mô sẹo nuôi môi trường lỏng lắc bổ sung mg/l TDZ Hình 3.3: Phơi lan Hồ Điệp hình thành mơi trường đặc ½VW 39 Đồ án tốt nghiệp ➢ Phương pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng, Hồng Ngọc Trâm, 2005) Phơi vơ tính hình thành ni cấy mô sẹo môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l + BA mg/l + đường 30 g/l sau 11 tuần nuôi cấy ➢ Tạo phôi thông qua nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen Wei Chin Chang, Đài Loan) Jen-Tsung Chen Wei-Chin Chang hai nhà nghiên cứu Lan tiếng Châu Á Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp mơi trường ½MS khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Sau 45 ngày nuôi cấy (45NSC), 28,1% mẫu ni cấy hình thành phơi, trung bình mẫu hình thành phôi Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp môi trường MS bổ sung TDZ (Thidiazuron) (0,45M; 4,54M; 13.62M), hai ơng thấy TDZ có ảnh hưởng trực tiếp đến hình thành phơi vơ tính Trong đó, mơi trường bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu Protocorm hình thành phơi (45NSC) Trung bình 13.5 phơi/mẫu cấy… Ngược lại, bổ sung thêm NAA (nồng độ 0,54M 57,37M) ức chế tạo phôi ➢ Ảnh hưởng nước dừa sucroza lên tăng sinh mơ sẹo hình thành phơi vơ tính lan Hồ Điệp [Phalaenopsis Amabilis (L.) Blume] (Dương Tấn Nhựt csv, 2009) Môi trường nuôi cấy bản: môi trường MS có bổ sung mg/l BA, kết hợp với 0,5 mg/l NAA, g/l than hoạt tính ✓ Sự tăng sinh mơ sẹo lan Hồ Điệp • Ảnh hưởng nước dừa lên tăng sinh mô sẹo lan Hồ Điệp Trong nước dừa có chứa chất dinh dưỡng như: acid amin, acid hữu cơ, glucoza, fructoza, sucroza số chất điều hòa sinh trưởng biết đến nhiều Zeatin Nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy mô sẹo nồng độ 20% (v/v), giúp tăng sinh mô sẹo hiệu nhất: từ 70 mg mô sẹo ban đầu tạo 1286 mg sau tuần nuôi cấy 40 Đồ án tốt nghiệp Khi không bổ sung nước dừa vào môi trường, mô sẹo lan Hồ Điệp tăng sinh chậm, số hóa nâu chết • Ảnh hưởng sucroza lên tăng sinh biệt hóa mơ sẹo lan Hồ Điệp Trong nuôi cấy mô thực vật, bổ sung nguồn cacbon dạng đường vào môi trường, giúp mô tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia tăng sinh khối mà không cần quang hợp Trên mơi trường có bổ sung 30 g/l sucroza, mơ sẹo có khả tăng sinh tốt nhất: từ 70 mg mô sẹo ban đầu thu 1455 mg sau tuần nuôi cấy Trọng lượng tươi mô sẹo tiếp tục tăng sau 11 tuần, mô sẹo mơi trường tơi xốp có màu vàng sáng, xuất nhiều cụm lông Trên môi trường bổ sung 60 g/l sucroza, mô sẹo tăng sinh yếu, nhiều mô sẹo thâm tím hóa đen chết Ngun nhân nồng độ sucroza cao làm tăng áp suất thẩm thấu mơi trường ✓ Sự phát sinh phơi vơ tính mơ sẹo lan Hồ Điệp • Ảnh hưởng nước dừa lên phát sinh phơi vơ tính mơ sẹo lan Hồ Điệp Nguồn đạm có ảnh hưởng đặc biệt đến phát sinh phôi, nồng độ đạm mơi trường giảm, phơi vơ tính hình thành Nguồn đạm thường sử dụng nước dừa nước dừa giàu acid amin Trên môi trường bổ sung 40% (v/v) nước dừa, mô sẹo tăng sinh chậm không chuyển thành phôi sau 15 tuần nuôi cấy Trên môi trường không bổ sung nước dừa, phơi hình thành sau 11 tuần ni cấy Còn với mơi trường bổ sung 20% (v/v) nước dừa phải 15 tuần phơi hình thành • Ảnh hưởng sucroza lên phát sinh phơi vơ tính mô sẹo lan Hồ Điệp Trên môi trường không bổ sung sucroza tồn mơ sẹo chuyển thành màu xanh hình thành PLB sau tuần ni cấy 41 Đồ án tốt nghiệp Trên môi trường chứa 30 g/l sucroza 60 g/l sucroza, mơ sẹo có màu vàng sáng khơng phát sinh hình thái Phải 11 tuần ni cấy số mơ sẹo phía ngồi khối mô sẹo môi trường chứa 30 g/l sucroza chuyển màu xanh Trong nhiều trường hợp, sucroza có tác dụng ức chế tổng hợp diệp lục tố mô nuôi cấy 3.2 Các kết nghiên cứu tạo PLB ➢ Tái sinh PLB từ mắt ngủ phát hoa lan Hồ Điệp (Nguyễn Thanh Phong, 2010) Sự tái sinh PLB đòi hỏi mơi trường ni cấy phải có cytokinin auxin Mơi trường MS bổ sung Kinetin 2,2 mg/l, IAA mg/l Các cấu trúc tương tự PLB hình thành từ mắt ngủ đoạn phát hoa vòng 50 ngày ni cấy ➢ Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB lan hồ điệp Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) (Trần Xuân Ngọc Huy, 2010) Trên mơi trường ½MS bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l NAA cho kết tăng trọng lượng PLB cao Mơi trường ½MS bổ sung mg/l BA 0,3 mg/l NAA cho kết tạo số lượng PLB nhiều 3.3 Các kết nghiên cứu tạo chồi ➢ Xác định mơi trường thích hợp tạo chồi từ PLB lan Hồ Điệp in vitro (Lê Tấn Thành csv, 2013) Môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp cho giống lan Hồ Điệp mơi trường ½MS có bổ sung 1,5 mg/l kinetin Môi trường cho tỉ lệ tạo chồi cao, chất lượng chồi tốt Như vậy, cytokinin có vai trò quan trọng hình thành phát triển chồi lan Hồ Điệp 42 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4: Chồi hình thành từ PLB lan Hồ Điệp ➢ Tái sinh chồi từ mô sẹo: Theo Thomas Davey (1975) (trích dẫn Trần Văn Minh, 2003) hình thành chồi từ mơ sẹo kích thích bởi: · Các chất điều hòa sinh trưởng đưa vào mơi trường · Chất sản sinh nuôi cấy mơ sẹo · Các chất có chứa sẵn mẫu ni cấy Khả hình thành chồi từ mơ sẹo phụ thuộc vào số lần cấy chuyền mà chất có mẫu khơng có khả tổng hợp thời gian dài (Gautheret, 1959) hình thành tế bào xốp (Trần Văn Minh, 2003) Hình 3.5: Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ mô sẹo 43 Đồ án tốt nghiệp 3.4 Các kết nghiên cứu tạo hạt nhân tạo ➢ Khảo sát nồng độ sodium alginate đến hình thành hạt nhân tạo (Nguyễn Hồng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Ở nồng độ 20 g/l vỏ hạt nhân tạo mềm, dễ vỡ, khơng hình thành vỏ hạt rõ ràng Ở nồng độ 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l vỏ hạt nhân tạo cứng bọc tồn phơi Trong đó, nồng độ 30 g/l làm cho hạt nhân tạo tròn đẹp A: Nồng độ alginate 20 g/l B: Nồng độ alginate 30 g/l C: Nồng độ alginate 40 g/l D: Nồng độ alginate 50 g/l Hình 3.6: Hạt nhân tạo lan Hồ Điệp nồng độ alginate Ở nồng độ alginate 20 g/l 30 g/l, tỉ lệ hạt nhân tạo sống sót nảy mầm cao so với 40 g/l 50 g/l Vậy nên sử dụng nồng độ alginate 30 g/l để tạo hạt nhân tạo, để hạt vừa có hình thái đẹp vừa có tỉ lệ sống sót nảy mầm cao 44 Đồ án tốt nghiệp ➢ Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Hạt nhân tạo có vỏ bọc mơi trường MS, ½MS có tỉ lệ sống sót cao mơi trường ¼MS 1/8MS Ở mơi trường ½MS tỉ lệ nảy mầm hạt nhân tạo cao (>71%), thích hợp cho việc tạo hạt nhân tạo Vậy nên bổ sung môi trường dinh dưỡng ½MS tiến hành tạo hạt nhân tạo để nâng cao tỉ lệ sống tỉ lệ nảy mầm hạt Hình 3.7: Hạt nhân tạo nảy mầm ➢ Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Trong môi trường lỏng (nước cất nước đường), vỏ hạt bị thẩm thấu mềm vỡ ra, không bao phôi Trong môi trường khô, vỏ hạt bị khô bám chặt vào phôi Trong môi trường agar agar có đường, hạt bị chuyển sang màu vàng nâu đen Trong môi trường MS, hạt giữ nguyên hình thái ban đầu, màu sắc hình dạng không đổi Hạt nhân tạo sau bảo quản tuần đem cấy nảy mầm môi trường MS 45 Đồ án tốt nghiệp Kết cho thấy hạt nhân tạo bảo quản môi trường MS có tỉ lệ nảy mầm cao Vậy mơi trường MS môi trường tốt cho việc bảo quản hạt nhân tạo Hạt nhân tạo giữ hình dạng, màu sắc ban đầu tỉ lệ nảy mầm hạt cao ➢ Khảo sát môi trường bảo quản hạt nhân tạo lan Phalaenopsis Amabilis (Dương Tấn Nhựt, 2007) Hạt nhân tạo từ PLB chứa 30 g/l sodium alginate vỏ hạt môi trường SA (3 g/l Hyponex, ml/l vitamin MS, 30 g/l khoai tây nấu chín) với hàm lượng khống đa lượng, vi lượng giảm ½ có bổ sung đường Hạt bảo quản điều kiện phòng thời gian tháng, hạt có tỉ lệ sống sót 100% Hạt nhân tạo từ mô sẹo chứa 30 g/l sodium alginate vỏ hạt môi trường SA với hàm lượng khống đa lượng, vi lượng giảm ½ không bổ sung đường Hạt dược bảo quản điều kiện phòng thời gian tháng có tỉ lệ sống sót 100% Thời gian bảo quản hạt nhân tạo lâu có ý nghĩa quan trọng nhân giống bảo quản hạt nhân tạo giảm chi phí nhân cơng ➢ Khảo sát nảy mầm hạt nhân tạo giá thể khác (Nguyễn Hoàng Quân, 2007; Lê Tấn Thành csv, 2013) Trên giá thể bơng gòn hạt nhân tạo có tỉ lệ nảy mầm cao (88,63) so với cầu giấy (68,64) môi trường MS đặc (53,65) 46 Đồ án tốt nghiệp PHẦN III: KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ Kết luận quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp ✓ Nguồn mẫu làm hạt nhân tạo Theo Dương Tấn Nhựt csv (2007), với nguồn mẫu (mơ sẹo, phơi vơ tính, PLB) phơi vơ tính nguồn mẫu lý tưởng cho tạo hạt nhân tạo đối tượng lan Hồ Điệp Mẫu mơ sẹo: Mơ sẹo tạo từ nuôi cấy nguồn mẫu ban đầu từ PLB lan Hồ Điệp Sử dụng mô sẹo có kích thước đủ lớn, riêng rẽ khơng bị dính chùm, có màu vàng xanh rắn Việc sử dụng mơ sẹo làm mẫu có hạn chế như: kích thước q nhỏ, khả dính cụm mơ sẹo cao dẫn đến có nhiều nảy mầm hạt Mẫu phơi vơ tính: Phơi vơ tính tạo từ mơ sẹo lan Hồ Điệp Sử dụng phơi hình tim phơi hình thủy lơi để làm hạt nhân tạo Mẫu PLB: Các PLB tạo từ nuôi cấy nguồn mẫu ban đầu (đỉnh sinh trưởng, non in vitro… phương pháp vết thương) PLB tái sinh từ mô sẹo Tuy nhiên, PLB có nguồn gốc từ mơ sẹo tốt Sử dụng PLB giai đoạn (giai đoạn chuẩn bị phát sinh chồi) để làm hạt nhân tạo ✓ Môi trường tạo vỏ hạt nhân tạo Môi trường sử dụng phổ biến dung dịch sodium alginate Hạt nhân tạo có hình dạng đẹp, tỉ lệ sống sót nảy mầm cao nồng độ alginate 30 g/l bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng ½MS ✓ Môi trường bảo quản hạt nhân tạo Môi trường bảo quản hạt nhân tạo tốt môi trng MS so vi cỏc mụi trng ẵMS, ẳMS, 1/8MS nước cất (Nguyễn Hoàng Quân, 2007) Theo Dương Tấn Nhựt (2007), hạt nhân tạo từ PLB bảo quản mơi trường SA với hàm lượng khống đa lượng, vi lượng giảm ½, có bổ sung đường điều kiện phòng thời gian tháng, hạt có tỉ lệ sống sót 100% Hạt nhân tạo từ mơ sẹo bảo quản môi trường SA với hàm lượng khoáng đa lượng, vi 47 Đồ án tốt nghiệp lượng giảm ½, khơng có đường điều kiện phòng thời gian tháng, hạt có tỉ lệ sống sót 100% ✓ Giá thể cho hạt nhân tạo nảy mầm Trên giá thể bơng gòn hạt nhân tạo có tỉ lệ nảy mầm cao (88,63) so với cầu giấy (68,64) môi trường MS đặc (53,65) Những nhân tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Nguồn mẫu để làm hạt nhân tạo (mơ sẹo, phơi vơ tính, PLB) chất lượng tốt, đồng yếu tố định chất lượng hạt nhân tạo tạo có chất lượng cao Nồng độ chất làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo sodium alginate ảnh hưởng trực tiếp đến khả tạo vỏ bọc, tỉ lệ sống sót nảy mầm hạt nhân tạo Nồng độ thích hợp khảo sát nồng độ alginate 30 g/l cho hạt nhân tạo vừa có hình thái đẹp vừa có tỉ lệ sống sót nảy mầm cao Do phơi vơ tính khơng có lớp nội nhũ phơi hữu tính nên việc bổ sung mơi trường dinh dưỡng vào dung dịch chất tạo vỏ hạt nhân tạo giúp nâng cao tỉ lệ sống sót tỉ lệ nảy mầm cho hạt nhân tạo Môi trường tạo vỏ có bổ sung mơi trường dinh dưỡng ½MS mơi trường thích hợp để tạo hạt nhân tạo có tỉ lệ sống sót tỉ lệ nảy mầm cao Chất điều hòa sinh trưởng giúp kích thích sinh trưởng nảy mầm phơi, than hoạt tính giúp tăng khả hơ hấp giữ lại chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường dùng làm vỏ bọc cho hạt nhân tạo Kiến nghị Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ nhiều nguồn mẫu khác như: thân, lá, rễ… lan Hồ Điệp môi trường, nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhằm tạo số lượng mô sẹo lớn, chất lượng tốt thời gian ngắn Nuôi cấy tăng sinh mô sẹo môi trường khác với chất kích thích sinh trưởng khác với nồng độ khác để tìm phương pháp 48 Đồ án tốt nghiệp tốt cho mục đích như: tạo nhiều mơ sẹo, mơ sẹo tạo có khả cảm biến tạo phơi soma cho kết tốt Thử nghiệm nuôi cấy mô sẹo môi trường khác với nồng độ TDZ khác bổ sung thêm NAA (như thực chuối, hoa lily…) để tìm phương pháp cảm ứng tạo phơi soma hiệu Thử nghiệm nuôi cấy phát sinh phôi soma từ hệ thống bình ni cấy Bioreactor với cơng nghệ đại tự động hóa cho suất cao Nghiên cứu tìm mơi trường thích hợp cho hạt nhân tạo nảy mầm Đặc biệt, nghiên cứu tạo hạt nhân tạo có khả nảy mầm tốt gieo trực tiếp đất trồng Tiếp tục mở rộng hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro, phát sinh phơi soma tạo hạt nhân tạo cho giống Lan hay loại khác có giá trị kinh tế cao 49 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Xuân Ngọc Huy (2010) Nhân nhanh PLB Mãn Thiên Hồng (Doritaenopsis sp.) số hệ thống nuôi cấy khác nhau, Đồ án tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM Lê Văn Hướng (2005) Tạo phôi từ vài quan Phalaenopsis sp nuôi cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, tp.HCM Đào Thị Lý (2009) Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khống đa lượng đến hình thành phát triển chồi lan Hổ Điệp (Phalaenopsis Yubidan) lan Dendrobium Sonia hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời TIS (Temporary Immersion System), Đồ án tốt nghiệp, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM Dương Tấn Nhựt csv (2007) Tái sinh bảo quản hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis Amabilis), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (1), 85 - 95 Dương Tấn Nhựt csv (2009) Ảnh hưởng nước dừa sucroza lên tăng sinh mơ sẹo hình thành phơi vơ tính lồi lan Hồ Điệp [Phalaenopsis Amabilis (L.) Blume], tạp chí Sinh Học, 31 (1), 77 - 84 Liêu Hồng Phú (2005) Nghiên cứu kỹ thuật phát sinh phôi soma tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, tp.HCM Nguyễn Hồng Qn (2007) Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo từ phơi lan Vanda., Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, tp.HCM Lê Tấn Thành, Huỳnh Minh Trí, Phan Hồng Thảo, Trần Quang Khương, Phạm Minh Tấn, Trần Phan Nhân (2013) Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Đồ án thực vật, Đại Học Công Nghệ, tp.HCM Ưng Thị Mỹ Tiên (2011) Nhân giống lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp kỹ thuật ni cấy ngập chìm tạm thời (TIS - Temporary Immersion System), Khóa luận tốt nghiệp, Đại Học Cơng Nghệ, tp.HCM 50 Đồ án tốt nghiệp TIẾNG NƯỚC NGOÀI 10 Broly H (1982) Contribution a la multiplication clonale des Orchidées: Phalaenopsis, Paphiopedilum et Cymbidium, Thèse Docteur Inggenieur en Biologie et Physiologie végétale, Université de sciences et techniques de Lille 11 De Vries J.T (1953) On the flowering of Phalaenopsis schilleranna, Rchb Ann Bogor, 1, 61 - 67 12 Grossmann K (1991) Induction of leaf abscission in cotton is a common effect of urea and adenin type cytokinins, Plant Physiol, 95, 234 - 237 13 Hare, P.D.; Staden, J (1994) Inhibitory effect of TDZ on the activity of cytokinin oxidase isolated from soybean callus, Plant cell Physiol, 35, 1121 1125 14 Hackett W.P et al (1973) Adventitious bud formation on Phalaenopsis nodes as a propagation method, Univ Calif Ext Serv Floer Rep March, - 15 Young So Park, H N Murthy & Paek Kee Yoeup (2000) Mass Multiplication of protocorm - like bodies using Bioreactor system and subsequent plant regeneration in Phalaenopsis, Chungbuk National University, Korea INTERNET 16 Nguyễn Phan Thị Hoàng Kim, Nguyễn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Điểm Phương pháp tạo hạt nhân tạo, 7/2014, http://vi.scribd.com/doc/167336662/hat-nhan-tao-hc 17 Nguyễn Hiền Nhơn Nghiên cứu xác định mơi trường thích hợp nhân PLB tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất giống, 7/2014, http://doc.edu.vn/tai-lieu/do-an-nghien-cuu-xac-dinh-moi-truong-thich-hopnhan-plb-va-tao-choi-tu-plb-giong-lan-phalaenopsis-amabilis-yubidan-phuc52384/ 18 TS Dương Tấn Nhựt Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật việc nhân nhanh lan Hài lan Hồ Điệp, Phân viện sinh học Đà Lạt, 7/2014, 51 Đồ án tốt nghiệp http://www.lamdong.gov.vn/viVN/a/book/Pages/books/TonghopHoiThaoNam2004/ung%20dung%20cn%20 ncm%20te%20bao%20thuc%20vat%20torng%20viec%20nhan%20nhanh%20 lan%20hai%20va%20hai%20hodiep.htm 19 Nguyễn Thanh Phong Rút ngắn thời gian vi nhân giống lan Hồ Điệp, Trung tâm công nghệ sinh học TP HCM, 7/2014, http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=3&id=95 20 Nguyễn Thị Tân, Nông Kim Ngọc, Phạm Thị Lan Hương, Nông Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Văn Du Nhân giống vơ tính in vitro, 7/2014, http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-nhan-giong-vo-tinh-invitro-slide-10059/ 21 Truy cập tháng 7/2014, http://tailieu.vn/doc/chuong-iii-cong-nghe-phoi-vo-tinh-hat-nhan-tao573763.html 22 Truy cập tháng 7/2014, http://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_%28sinh_h%E1%BB%8Dc%29 23 Truy cập tháng 7/2014, http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BB%83_lo%E1%BA%A1i:Chi_Lan_h %E1%BB%93_%C4%91i%E1%BB%87p 24 Truy cập tháng 7/2014, http://www.orchidweb.com/phalaenopsiscare.html 52 ... Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Tổng quan yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo hạt nhân tạo Nhằm tạo nguồn giống... yếu tố cần thiết ảnh hưởng đến q trình phát sinh phơi soma, trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Từ tìm phương pháp tốt nhất, tối ưu cho việc tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Tạo số lượng lớn hạt nhân. .. trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Chương 3: Các kết nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến quy trình tạo hạt nhân tạo lan Hồ Điệp Các kết nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến trình phát sinh