Xá định nồng đọ nước javel cho quá trình sinh trưởng

Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro

Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu pháthoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trìnhsinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro” được tiến hành tạiphòng di truyền và chọn giống - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, thời gianthực hiện từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toànĐề tài nhằm theo dõi nồng độ javel thích hợp cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồđiệp, quá trình tạo protocorm và sự phát triển rễ của lan hồ điệp in vitro khi thay đổi nồngđộ chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ, NAA trong môi trường nuôi cấy.đ Phương pháp khử trùng mẫu cấy:Khử trùng mẫu phát hoa lan hồ điệp bằng cách thay đổi nồng độ javel (20%, 40%,60%, 80%). Khử trùng ở nồng độ 80% cho kết quả tốt nhất.6 Tạo protocorm trực tiếp từ mô lá:Công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và TDZ thích hợp cho quá trình tạoprotocorm: MS + đường (30 g/lít )+ PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) +TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít) + than hoạt tính (2 g/lít), pH = 5,8.T Kích thích sự ra rễ của chồi:Sử dụng NAA để kích thích tạo rễ ở lan Hồ Điệp in vitro, các công thức môiS MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8g/lít) + BAP (ĐC) (0,05 mg/lít).g MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (0,5 mg/lít) (cho kết quả tốt nhất).g MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít)+ than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8g/lít )+ BAP (0,05 mg/lít ) + NAA (1 mg/lít). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (1,5 mg/lít).Trang tựa: iLỜI CẢM TẠ . iiTÓM TẮT iiiMỤC LỤC . ivDANH SÁCH CÁC HÌNH . viiDANH SÁCH CÁC BẢNG viiiChương 1 MỞ ĐẦU 11.1 Đặt vấn đề 11.2 Mục tiêu và yêu cầu . 21.2.1 Mục tiêu 21.2.2 Yêu cầu . 2Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .32.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô . 32.1.1 Một số kết quả tiêu biểu trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật trên thế giới . 32.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam 52.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 62.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng . 62.2.2 Nuôi cấy mô sẹo . 62.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn . 62.2.4 Nuôi cấy protoplast – lai protoplast 72.2.5 Nuôi cấy hạt phấn 72.3 Quy trình nhân giống in vitro 72.3.1 Khử trùng mẫu cấy . 7 2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy 82.3.3 Nhân nhanh 82.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh 82.3.5 Đưa cây ra đất 82.4 Những vấn đề còn tồn tại trong nhân giống cây trồng . 92.4.1 Tính bất định về mặt di truyền . 92.4.2 Sự hoại mẫu 92.4.3 Sử dụng thuốc kháng sinh 102.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy 102.4.5 Hiện tượng thủy tinh thể . 102.5 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nông nghiệp 112.5.1 Vi nhân giống 112.5.2 Sản xuất và bảo quản cây sạch bệnh 122.5.3 Bảo quản và nhân giống in vitro . 122.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) . 122.6.1 Auxin . 122.6.2 Cytokinin . 132.7 Sơ lược về lan hồ điệp . 132.7.1 Vị trí phân loại . 132.7.2 Nguồn gốc, xuất xứ 142.7.3 Mô tả hình thái . 142.7.4 Trồng trọt và chăm sóc 17 2.7.5 Nhân giống truyền thống . 202.8 Vi nhân giống Phalaenopsis . 212.8.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh . 212.8.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis 222.8.3 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis . 232.8.4 Tăng trưởng PLB thành cây con 232.9 Giá trị kinh tế của lan hồ điệp . 24_Toc241549069Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .263.1 Thời gian và địa điểm 263.2 Phương tiện thí nghiệm . 263.2.1 Đối tượng thí nghiệm . 263.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 263.3 Tiến hành thí nghiệm . 283.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫucấy 283.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạoprotocorm từ lá cây hồ điệp 293.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triểncủa cây lan hồ điệp in vitro . 303.4 Xử lý số liệu . 31Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 324.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy 324.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạoprotocorm từ lá cây hồ điệp in vitro . 354.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro 43Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 495.1 Kết luận 495.2 Đề nghị . 49TÀI LIỆU THAM KHẢO .50TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT .50PHỤ LỤC 53DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT: 6 – Benzylaminopurine: Thidiazuron: α - Napthylacetic acid: Đối chứng: Murashige and Skoog (1962): Môi trường nền: Ngày sau cấy: Nghiệm thức: Protocorm like body: Indol acetic acid: Điều hòa sinh trưởng thực vật: Polyvinylpyrolidone: Lần lặp lạiDANH SÁCH CÁC HÌNHHình 2.1: Cây và hoa lan hồ điệp (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail) . 14 Hình 2.2: Hoa lan hồ điệp . 15Hình 2.3: Trái lan hồ điệp 3 tháng tuổi (ảnh chụp tại Trại lan, Viện KHNN Miền Nam) 16Hình 2.4: Keiki của lan hồ điệp (http://www.orchidshome.com) 16Hình 2.6: Một số giống lan hồ điệp tại Việt Nam 25Hình 3.1: Phát hoa lan hồ điệp, bộ phận lấy mẫu cấy 28Hình 3.2: Mẫu lá lan hồ điệp ban đầu (a) và mẫu cấy (b) 29Hình 4.1: Mẫu nảy chồi và hình thành hoa thứ cấp (20 NSC) . 34Hình 4.2: Protocorm được tạo ra trong điều kiện tối (80 NSC) . 42Hình 4.3: Protocorm tạo ra trong điều kiện sáng (80 NSC) . 43Hình 4.4: Cây lan hồ điệp ở giai đoạn 40 NSC 48DANH SÁCH CÁC BẢNGBảng 2.1: Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo .7Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu .33Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ chết và tỷ lệ sống của mẫu .33Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ mẫu lá hìnhthành protocorm .35Bảng4.4:Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ đến phản ứng của mẫu.36Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu lá lan hồ điệp in vitro .37Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thànhprotocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro 38Bảng 4.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới kích thước của protocorm .40Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan hồ điệp invitro 44Bảng 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến số lá của lan hồ điệp in vitro .45Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến kích thước lá và chiều cao của cây lan hồ điệp invitro 46Trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng ngành nông nghiệp thành phố nóiriêng và của cả nước nói chung, hoa lan - cây cảnh là một lĩnh vực có rất nhiều tiềmnăng đem lại lợi ích kinh tế cho xã hội và phù hợp với hoàn cảnh của ngành nôngHiện nay, thú chơi hoa kiểng không những là nhu cầu thiết yếu của đời sống xãhội, mà còn là một ngành kinh doanh mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nghề trồng lanhiện nay không còn là thú vui tiêu khiển mà đã trở thành hàng hoá. Mặt hàng nàykhông chỉ trao đổi trong nước mà đã thâm nhập ra thị trường thế giới, tạo ra nguồnhàng xuất khẩu có giá trị, đem lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Những năm gần đây,ngành trồng lan ở Tp.Hồ Chí Minh có chiều hướng phát triển tốt. Phong trào này lanrộng, không những ở các cơ quan nghiên cứu, cơ sở sản xuất mà còn ở các hộ gia đình.Trong giai đoạn hiện nay, kỹ thuật nhân giống lan thông thường gần như không đủ đápứng cho thị trường. Do đó, nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngàyHơn thế nữa, trên thị trường hoa - cây cảnh hiện nay, lan hồ điệp là loại lan có hoa đẹp, sang trọng, đa dạng, màu sắc phong phú, lâu tàn. Chính vì thế, hoa lan hồđiệp mang ý nghĩa tinh thần và có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nướcngoài. Do khả năng tự sinh trong tự nhiên rất thấp, nên phương pháp gieo hạt trongmôi trường in vitro được sử dụng để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này. Tuynhiên, những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, đặcđiểm hoa không thuần nhất. Người ta thường áp dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng của cây để giữ nguyên những tính trạng quý về màu sắc, kích thước hoa, hìnhdạng cánh, kiểu phân bố hoa trên trục phát hoa. Từ nguồn nguyên liệu này, tùy theomục đích mà áp dụng các phương pháp nhân nhanh khác nhau để cho ra số lượng lớncây đồng nhất trong thời gian ngắn.Với lan hồ điệp, hiện nay bộ phận được sử dụng để vô mẫu phổ biến nhất làphát hoa. Nguyên nhân là do khi cắt phát hoa thì cây vẫn sinh trưởng và phát triển bìnhthường. Ngoài ra trên phát hoa còn chứa nhiều mầm ngủ nên tạo được nguồn vật liệunhân giống phong phú, mang lại giá trị kinh tế cao.Xuất phát từ những điều trên, đề tài nghiên cứu được tiến hành tại phòng ditruyền và chọn giống – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam gồm 2 nộidung: Xác định nồng độ nước javel và thời gian khử mẫu phát hoa của lan hồ điệp vàtheo dõi ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinhtrưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro.t Xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vào mẫu phát hoa cây lan hồ điệp.t Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự hình thànhprotocorm từ lá cây lan hồ điệp.p Xác định tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho quá trình sinh trưởng, phát triển Bố trí thí nghiệm với các mức nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (BAP, TDZ,NAA) khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi trực tiếptừ lá và quá trình tạo rễ của lan hồ điệp.TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô2.1.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật trên thế giớiNăm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Shleiden và Schwam đã đề xướngthuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tếbào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các thông tin di truyền ở trong tế bàođầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xâyNăm 1954, Skoog (Hoa Kỳ) tình cờ thấy, nếu thêm một chế phẩm đã để lâucủa DNA lấy tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốclá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt.Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với việc phát hiệnnhững vai trò của các vitamine và nước dừa là một bước tiến rất quan trọng trong giaiđoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là tiền đề kĩ thuật cho việcxây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổnđịnh dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này.Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng củatỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của môsẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ,ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo.Hiện tượng này được xác định trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thànhcông của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giaiđoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy mô thực vật.Năm 1960, Berman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu đượchuyền phù không có tế bào dính cụm mà hầu hết là tế bào đơn. Các tế bào đơn có thểgieo trên môi trường, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng với kỹ thuậtgieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong tạo cây hoàn chỉnh từ mộttế bào, chứng minh một cách rất tốt về tính toàn năng của tế bào thực vật.Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong côngnghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây làm hoàn chỉnh tế bào đã mở ra những triểnvọng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất mộtsản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ởNăm 1966, Guha và Mahes Wari công bố thành công cây đơn bội từ nuôi cấytúi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia). Đến nay việc tạo cây đơn bội thông quanuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây (bắp, lúa, .) và đóng gópvô cùng lớn vào việc tăng thêm kiến thức di truyền và thực tiễn chọn giống.Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970,khi các tác giả Nigata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho protoplast táchtừ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một phần tế bào trong môitrường lỏng. Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiệnnhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan từ bên ngoài, các nhànuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quảNăm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng vấn đề biến tính của tế bào thực [...]... TDZ (Thidiazuron) Các chất khác: đường glucose, agar, nước dừa Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh bằng NaOH hoặc HCl để đạt pH = 5,8 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vô trùng mẫu cấy lan hồ điệp nhằm tạo nguồn mẫu sạch bệnh ban đầu cho quá trình nhân giống tiếp Vật liệu thí nghiệm: các mắt ngủ... khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời kỳ sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…),... quả cao Thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ javel khác nhau trong thời gian 30 phút, kết quả khử trùng mẫu được thể hiện ở bảng 4.1: Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu Hóa chất Nồng độ khử trùng (%) Javel Từ kết quả thu được ở bảng 4.1 nhận thấy: Với các nồng độ javel khác nhau cho tỷ lệ nhiễm khác nhau, nồng độ javel càng thấp thì mức độ tạp nhiễm nấm... pháp lạnh sâu như: nuôi cấy tế bào, mô sẹo, phôi, tế bào trần hay đỉnh sinh trưởng (Karth, 1987) 2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) Hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong nuôi cấy mô là auxin Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh trưởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hóa các hợp... tưới nghiêng để nước không đọng trên hoa Vào mùa nắng nên tưới chúng 3 lần/ngày Nếu thời tiết trở nên quá lạnh thì phải đợi cho nước ấm hơn mới tưới cây để cây không bị rét vì nước quá Lan hồ điệp cần độ ẩm cao vào ban ngày, lá cần không khí ẩm khoảng 80% Không để nước nhiều trong chậu, cần để độ ẩm không khí cao Ở vùng khô hạn, chúng ta cần tăng độ ẩm bằng cách đặt cây phía trên một khay nước (không để... lá có hai chồi xếp chồng, chồi bên trên cho ra một trục phát hoa sau khi cảm ứng ra hoa, chồi bên dưới cho ra một cây con trong trường hợp có sự cố về hoạt Rễ bất định khí sinh rất nhiều, mọc từ gốc của thân xuyên qua bẹ lá Sự phân nhánh của rễ phụ thuộc vào giai đoạn tăng trưởng của cây Rễ mập với lớp mô xốp đặc trưng cho rễ khí sinh dày, làm nhiệm vụ hút hơi nước trong không khí, trong lớp xốp này... biệt khi có sự trao đổi không khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây, hiện tượng này xảy ra ở Đặc điểm cây thủy tinh thể: cây chứa nước trong suốt Ngăn chặn hiện tượng thủy tinh thể: qua nghiên cứu quá trình xuất hiện và đặc điểm của những cây thủy tinh thể, có một số phương thức hạn chế sự xuất hiện như sau: Giảm sự tăng hấp thu nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng... tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao... ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA và BAP thích hợp cho cây lan hồ Vật liệu thí nghiệm: mẫu nuôi cấy là cây lan Phalaenopsis in vitro, có 3 lá Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại cấy 3 chai, mỗi chai cấy 5 mẫu Môi trường nền: MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít)... phát triển và chết dần Vì vậy, đối với loại cây trồng khác nhau, việc xác định phương pháp khử trùng thích hợp có tính chất quyết định tới sự thành công của quá trình nuôi cấy mô tế bào Một số chất khử trùng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô như : HgCl2, javel, Ca(0Cl)2 đều mang lại hiệu quả cao Trong thí nghiệm này, nước javel được dùng làm chất khử trùng phát hoa của lan hồ điệp vì giá thành . cứu “Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu pháthoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trìnhsinh trưởng, . Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự hình thànhprotocorm từ lá cây lan hồ điệp.p Xác định tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho quá