XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY LAN MOKARA CHAO PRAYA SUNSET SẠCH BỆNH VIRUS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY LAN MOKARA CHAO PRAYA SUNSET SẠCH BỆNH VIRUS Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HOA THÙY Niên khóa: 2006 – 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY LAN MOKARA CHAO PRAYA SUNSET SẠCH BỆNH VIRUS Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS Nguyễn Xuân Dũng Nguyễn Thị Hoa Thùy KS Nguyễn Phúc Trường Tháng 7/2010    LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tơi nhận nhiều giúp đỡ, động viên, hướng dẫn tận tình thầy cơ, gia đình bạn bè Tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: ™ Các thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM thầy cô trường trực tiếp giảng dạy suốt thời gian qua ™ Trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM, đặc biệt phòng Cơng nghệ sinh học Thực vật tạo điều kiện tốt giúp tơi hồn thành khóa luận ™ ThS Nguyễn Xuân Dũng KS Nguyễn Phúc Trường tận tình hướng dẫn, động viên thời gian thực đề tài tốt nghiệp trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM ™ Anh Lâm Vỹ Nguyên (trước học lớp DH02SH) anh chị công tác Trung tâm Công nghệ sinh học Tp HCM ™ Ba mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện tốt động viên suốt trình học tập làm đề tài tốt nghiệp ™ Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP HCM tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập ™ Bạn Đỗ Phong Lưu tập thể lớp DH06SH nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình tơi làm đề tài i   TĨM TẮT Đề tài tiến hành từ ngày 01/02/2010 đến ngày 01/07/2010 Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp Hồ Chí Minh lan Mokara Chao Praya Sunset, dòng lan có nguồn gốc từ Thái Lan trồng vườn ươm Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp Hồ Chí Minh Mục đích nghiên cứu tạo lan Mokara Chao Praya Sunset in vitro bệnh virus từ nguồn giống ban đầu Vì lan bị nhiễm virus ảnh hưởng đến phẩm chất hoa làm cho khơng hoa, điều gây ảnh hưởng lớn cho người sản xuất tiêu dùng Quy trình tạo lan virus xây dựng thông qua bước sau: trước tiên, vận dụng kỹ thuật RT-PCR lọc mẫu virus lấy từ vườn, sau tiến hành q trình vơ mẫu nồng độ chất khử trùng khác (chất khử trùng sử dụng javen với nồng độ 20%; 25%; 33,33%) với thời gian khử trùng 30 phút, sau tiến hành thử nghiệm mơi trường tái sinh PLBs chồi lan in vitro từ nguồn giống phát hoa virus ban đầu (sử dụng môi trường MS có bổ sung nồng độ BA (2 mg/l; 2,5 mg/l mg/l) NAA (0,2 mg/l 0,5 mg/l)) để tìm mơi trường tối ưu, cuối sử dụng kỹ thuật RT-PCR để kiểm tra tình trạng virus chồi lan in vitro vừa tái sinh sau tuần nuôi cấy Kết cho thấy chọn lọc mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset virus từ vườn ươm để sử dụng làm nguồn giống ban đầu cho thí nghiệm Xác định nồng đô chất khử trùng javen: 20% với thời gian 30 phút cho tỉ lệ mẫu sống vô trùng cao Xác định môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 2,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA cho khả tái sinh PLBs cao Sau tuần nuôi cấy, PLBs chồi tái sinh từ nguồn mẫu virus ban đầu kiểm tra lại phương pháp RT-PCR để khẳng định hoàn toàn virus ii   SUMMARY The topic was conducted from 01/02/2010 to 01/07/2010 in Biotechnology Center of Ho Chi Minh City With the object of study is the Mokara Chao Praya Sunset, an Thailand  imported orchid, planted in the garden of the Biotechnology Center of Ho Chi Minh City   The aim of study is the producing of the in vitro virus-free Mokara Chao Praya Sunset orchid from the clean original source Because infected virus orchid will affect the quality of the flower or plant can not make flowers, which greatly influence the productions and consumptions The process of creating virus-free orchid was built through the following steps: the first, using RT-PCR technique to purge the virus-free samples, then sterilizing them with different disinfectants concentrations (disinfectants are used with three levels 20%, 25%, 33.33%) with disinfection time is 30 minutes Then they were cultured into different nutritious environments to regenerate PLBs and buds (using MS medium supplemented with BA concentrations (2 mg/l; 2,5 mg/l and mg/l) and NAA (0,2 mg/l and 0,5 mg/l) to find the optimal nutritious environment In the end, using RT-PCR technique to check the virus-free of the in vitro regenerated buds after weeks cultured.  The results show that selecting Mokara Chao Praya Sunset free-virus samples to use as a initial material for the study The concentration of javen 20% with time (30 minutes) brings the highest percentage of live samples MS culture medium supplemented with 2.5 mg/l BA and 0.5 mg/l NAA brings a best possible PLBs regeneration Using RT-PCR technique on the samples after weeks cultured brings the result of virus-free regenerated completed PLBs and buds iii   MỤC LỤC Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược giống lan Mokara 2.1.1 Phân loại 2.1.2 Nguồn gốc phân bố 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng phát triển Lan Mokara 2.1.5 Cách trồng chăm sóc lan Mokara 2.1.6 Sơ lược giống lan Mokara Chao Praya Sunset 2.2 Giới thiệu chung virus 2.2.1 Cách gọi tên 2.2.2 Thành phần cấu tạo 2.2.2.1 Vỏ protein (capsid) iv   2.2.2.2 Màng bao (envelop) 2.2.2.3 Cấu trúc gene 2.2.3 Phương thức sinh sản lan truyền 2.3 Sơ lược virus gây bệnh lan 2.3.1 Cymbidium mosaic virus (CyMV) 10 2.3.2 Odontoglossum ringspot virus (ORSV) 11 2.4 Sơ lược phương pháp RT-PCR 12 2.5 Sơ lược phương pháp nuôi cấy mô 15 2.5.1 Vài nét kỹ thuật nuôi cấy mô 15 2.5.2 Lịch sử phát triển thành tựu đạt nuôi cấy mô 15 2.5.3 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 16 2.5.4 Những thuận lợi khó khăn kỹ thuật nhân giống in vitro 17 2.6 Sơ lược nuôi cấy mô lan 17 2.7 Sơ lược kết sử dụng chất điều hòa sinh trưởng ni cấy mơ lan 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu 20 3.1.1 Mẫu thí nghiệm 20 3.1.2 Địa điểm thời gian thực 20 3.1.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 20 3.1.3.1 Thiết bị dụng cụ kỹ thuật RT-PCR 20 3.1.3.2 Thiết bị dụng cụ q trình ni cấy mơ 20 3.1.4 Các hóa chất sử dụng phòng thí nghiệm 21 3.1.4.1 Hóa chất dùng tách chiết RNA virus 21 3.1.4.2 Hóa chất dùng phản ứng RT-PCR 21 3.1.4.3 Hóa chất dùng điện di 21 v   3.1.4.4 Hóa chất dùng nhuộm gel 21 3.1.4.5 Hóa chất dùng trinh vô mẫu nuôi cấy 21 3.2 Phương pháp 22 3.2.1 Thanh lọc nguồn mẫu virus phương pháp RT-PCR 22 3.2.2 Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro 23 3.2.3 Khảo sát nồng độ BA NAA tối ưu cho tái sinh PLBs từ mẫu cấy 24 3.2.4 Kiểm tra nhiễm virus mẫu sau nuôi cấy 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Thanh lọc nguồn mẫu virus 25 4.2 Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro 25 4.3 Ảnh hưởng BA NAA lên tái sinh PLBs từ mô cấy 26 4.4 Kiểm tra nhiễm virus mẫu sau nuôi cấy 29 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC vi   DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid A.O.S American Orchid Spciety BA Benzyladenine cDNA complementary deoxynucleic acid cs cộng CyMV Cymbidium mosaic virus DNA deoxy nucleic acid dUTP Deoxy uridine Triphosphate NAA Naphthalene acetic acid ORSV Odontoglossum ringspot virus PCR Polymerase chain reaction PLB Protocorm-like body RNA ribose nucleic acid RT reverse transcription RT-PCR Reverse transcription-polymerase chain reaction TAE Tris-acetate-EDTA TDZ 5-Phenylcarbamoylamino-1,2,3-thiadiazole Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh TT CNSH Trung tâm công nghệ sinh học UNG Uracil-DNA glycosilase vii   DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng multiplex RT-PCR 22 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR 23 Bảng 3.3 Các nồng độ chất khử trùng 24 Bảng 3.4 Các môi trường bổ sung BA NAA 24 Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset sống vô trùng sau ngày 26 Bảng 4.2 Tình trạng mẫu sau tuần ni cấy 27 Bảng 4.3 Tình trạng mẫu sau tuần nuôi cấy 28 viii   3.1.4 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 3.1.4.1 Hóa chất dùng để ly trích virus - Dung dịch sucrose 3.1.4.2 Hóa chất dùng phản ứng RT-PCR - Bộ master mix iScript one step RT-PCR for Probe (Biorad) - Primer 3.1.4.3 Hóa chất dùng điện di - Agarose - Loading buffer - Dung dịch TAE - Thang DNA (1kb) 3.1.4.4 Hóa chất dùng để nhuộm gel - Ethidium bromide 20µl 3.1.4.5 Hóa chất dùng q trình vơ mẫu nuôi cấy - Dung dịch javen - Nước cất - Dung dịch Tween 20 - Xà phòng - Cồn 700, 900 - Mơi trường ni cấy - Chất điều hồ sinh trưởng BA, NAA 3.2 Phương pháp 3.2.1 Thanh lọc nguồn mẫu virus phương pháp RT-PCR Các lan Mokara Chao Praya Sunset giai đoạn cho phát hoa sử dụng cho mục đích lọc chọn nguồn mẫu virus Việc kiểm tra virus tiến hành theo quy trình Nguyễn Xuân Dũng cs (2009) ¾ Ly trích virus Q trình ly trích virus có mẫu lan thực theo phương pháp sucrose Mẫu (1 cm x cm) cho vào tube 1,5 ml có chứa sẵn 100 µl dung dịch sucrose Dùng chày nghiền mẫu nhiệt độ phòng, sau thêm vào 100µl dung dịch 22   sucrose, vortex nhẹ Đun mẫu 1000C 10 phút sau đặt vào đá lạnh phút Tiếp theo đem ly tâm 13.000 vòng phút Sau ly tâm, loại bỏ cặn bên dưới, hút lấy dịch đem bảo quản -200C để dùng cho phản ứng RT-PCR ¾ Thực phản ứng multiplex RT-PCR Phản ứng thực với master mix iScript one step RT-PCR for Probe (Biorad), thành phần phản ứng cụ thể liệt kê bảng 3.1 Bảng 3.1 Các thành phần phản ứng multiplex RT-PCR Hóa chất Thể tích (µl) Enzyme Reverse 0,5 Buffer 2X 12,5 Mồi xuôi cho CyMV 0,5 Mồi ngược cho CyMV 0,5 Mồi xuôi cho ORSV 0,5 Mồi ngược cho ORSV 0,5 RNA mẫu 1,0 Nước cất 9,0 Tổng thể tích 25 µl Phản ứng tiến hành chu kỳ, chu kỳ q trình tổng hợp cDNA, chu kỳ trình khuếch đại cDNA vừa tổng hợp chu kỳ (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR Chu kỳ 50 C/10 phút Chu kỳ 95 C/5 phút 23 Chu kỳ (lặp lại 35 lần) Chu kỳ 950C/15 giây 530C/30 giây 720C/60 giây 720C/15 phút   Kết phản ứng phân tích phương pháp điện di gel agarose 1,5% với hiệu điện 100 volt vòng 40 phút Sau nhuộm với Ethidiumbromide 15 phút Cuối quan sát xuất băng DNA gel máy Geldoc Từ kết PCR, chọn không bị nhiễm virus, phục vụ cho việc nhân giống in vitro Thí nghiệm thực 60 mẫu lan lấy từ vườn hoàn toàn ngẫu nhiên, tiến hành kiểm tra lần lặp lại Quan sát ghi nhận mẫu hoàn toàn virus 3.2.2 Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro Phát hoa lấy từ kiểm tra virus sử dụng cho việc khử trùng Các bước thực sau: ¾ Rửa phát hoa vòi nước Gỡ bỏ lớp vỏ bao quanh mắt ngủ (nhẹ nhành, không làm tổn thương mắt ngủ) Cắt phát hoa thành đoạn ngắn (4 cm) cho vào erlen tiến hành lắc mẫu với xà phòng phút Sau rửa xà phòng nước cất, lắc mẫu với cồn 700 30 giây Tiếp theo, tiến hành khử trùng với dung dịch javen Việc khử trùng thực với nồng độ chất khử trùng khác (cho bảng 3.3) 30 phút Cuối rửa lại mẫu nước cất vô trùng (3 lần) trước cấy vào mơi trường ni cấy ¾ Sau khử trùng tiến hành cắt bỏ phần mô chết hai đầu mẫu cấy cấy vào môi trường MS Mẫu nuôi cấy đặt điều kiện: chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C, ẩm độ 55 ± 5% Bảng 3.3 Các nồng độ chất khử trùng Nghiệm thức Nồng độ javen (%) 20 25 33,33 24   ¾ Mỗi nghiệm thức có 50 mẫu, mẫu lấy hồn tồn ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần Ghi nhận tỷ lệ mẫu sống, vô trùng nồng độ khử trùng khác sau ngày nuôi cấy 3.2.3 Khảo sát nồng độ BA NAA tối ưu cho tái sinh PLBs từ mẫu cấy Các mẫu phát hoa sống, vơ trùng q trình khử trùng cấy chuyển sang mơi trường MS có bổ sung BA (2 mg/l; 2,5 mg/l mg/l) kết hợp với NAA (0,2 mg/l 0,5 mg/l) (bảng 3.4) Bảng 3.4 Các môi trường bổ sung BA NAA BA (mg/l) 2,5 0,2 2/0,2 2,5/0,2 3/0,2 0,5 2/0,5 2,5/0,5 3/0,5 NAA (mg/l) ¾ Mẫu cấy đặt điều kiện ni cấy: chiếu sáng 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2500 ± 500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C, ẩm độ 55 ± 5% Thí nghiệm gồm nghiệm thức mơi trường trên, lặp lại lần Theo dõi ghi nhận tái sinh PLBs môi trường 3.2.4 Kiểm tra nhiễm virus mẫu sau nuôi cấy Các cụm chồi (phát triển từ PLBs) sử dụng cho việc kiểm tra virus phương pháp RT-PCR Quy trình phản ứng thực tương tự phần lọc nguồn mẫu virus Ghi nhận tỷ lệ mẫu virus sau trình kiểm tra 25   Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thanh lọc nguồn mẫu virus phương pháp RT-PCR Kết lọc mẫu thể hình 4.1 Các mẫu virus hồn tồn khơng có xuất sản phẩm khuếch đại bảng điện di so với hai băng sản phẩm có kích thước 257 bp (cho CyMV) 398 bp (cho ORSV) mẫu chứng dương Hình 4.1 Kết phát virus mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset phương pháp PCR (1Ỉ10) Mẫu; (11) Đối chứng dương (+); (12) Đối chứng âm (-); (13) thang DNA 1kb Nguồn mẫu bệnh điều kiện tiên để tạo giống in vitro virus Do đó, kết góp phần quan trọng không cho việc nhân giống bệnh virus lan Mokara mà ứng dụng cho số đối tượng trồng khác 4.2 Khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu ban đầu cho nhân giống in vitro Kết khử trùng mẫu cho thấy tỉ lệ mẫu sống vô trùng gia tăng tỉ lệ nghịch với nồng độ dung dịch javen Trong đó, javen nồng độ 20% cho tỉ lệ mẫu sống vô trùng cao (92,14%) (Bảng 4.1) 26   Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset sống vô trùng sau ngày nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ javen (%) Trung bình mẫu Tỷ lệ mẫu sống sống sạch/50 (%) mẫu Tình trạng mẫu 20 46,07 ± 0,47 92,14 Mẫu xanh 25 31,97 ± 3,18 63,94 Mẫu xanh 33,33 26,91 ± 2,61 53,82 Mẫu bị vàng Nồng độ chất khử trùng cao, khả khử trùng mạnh Tuy nhiên, nồng độ cao ảnh hưởng đến khả sống sót mẫu cấy Trong trường hợp tỉ lệ mẫu vô trùng cao tỉ lệ mẫu chết lại nhiều Do làm giảm tỉ lệ mẫu sống vô trùng Qua kết khảo sát thấy dung dịch javen nồng độ 20% với thời gian khử trùng 30 phút phù hợp cho việc khử trùng mẫu lan Mokara Chao Praya Sunset 4.3 Ảnh hưởng BA NAA tái sinh PLBs từ mô cấy BA NAA có ảnh hưởng rõ rệt lên q trình sinh trưởng mẫu phát hoa sau khử trùng Ở mơi trường MS có bổ sung NAA 0,2 mg/l kết hợp với BA nồng độ mg/l; 2,5 mg/l mg/l , có mơi trường chứa BA 2,5 mg/l có tạo thành PLBs sau tuần nuôi cấy Trong trường hợp lại, hồn tồn khơng có tạo thành PLBs, cá biệt, môi trường chứa BA mg/l, mẫu bị chết hồn tồn sau tuần ni cấy (Bảng 4.2, hình 4.2) Tương tự, mơi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l kết hợp với BA nồng độ mg/l; 2,5 mg/l; mg/l, có mơi trường chứa BA 2,5 mg/l có tạo thành PLBs sau tuần ni cấy Ở mơi trường chứa BA mg/l mẫu chết hồn tồn sau tuần ni cấy; mơi trường chứa BA mg/l khơng có tạo thành PLBs Khi xem xét nồng độ BA 2,5 mg/l môi trường chứa NAA 0,5 mg/l cho tạo thành PLBs tốt môi trường chứa NAA 0,2 mg/l Như vậy, môi trường MS bổ sung BA 2,5 mg/l NAA 0,5 mg/l phù hợp cho tái sinh PLBs nghiên cứu 27   Bảng 4.2: Tình trạng mẫu sau tuần nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) Tình trạng mẫu 0,2 tuần đầu mẫu ngả sang vàng, đến tuần thứ mẫu hóa nâu, đen chết 2,5 0,2 Phần agar xanh,phần bên hóa nâu đen, có hình thành PLBs nhỏ môi trường 2,5:0,5 3 0,2 Mẫu xanh khơng hình thành PLBs 0,5 Mẫu vàng sau hóa nâu, đen, chết 2,5 0,5 Mẫu xanh, phát triển PLBs tốt, có mẫu hình thành chồi từ mắt ngủ 0,5 Mẫu xanh khơng hình thành PLBs A B C D E F Hình 4.2 Khả tái sinh tạo PLBs mẫu cấy môi trường khảo sát (A) MS 2:0,2; (B) MS 2,5:0,2; (C) MS 3:0,2; (D) MS 2:0,5; (E) MS 2,5:0,5; (F) MS 3:0,5 Tiếp tục theo dõi đến tuần nuôi cấy, kết xảy tương tự trường hợp sau tuần nuôi cấy Sự khác biệt PLBs tạo thành 28   môi trường BA 2,5 mg/l kết hợp với NAA 0,2 mg/l 0,5 mg/l tiếp tục phát triển thành thể chồi (bảng 4.3, hình 4.3) Bảng 4.3 Tình trạng mẫu (sống sau tuần) theo dõi tiếp đến tuần thứ Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) 0,2 Chết Tình trạng mẫu 2,5 0,2 Mẫu xanh, khỏe, có hình thành chồi nhỏ môi trường 2,5:0,5 3 0,2 0,5 Mẫu vàng nâu, khơng hình thành PLBs chồi Chết 2,5 0,5 0,5 Mẫu xanh, khỏe, chồi phát triển tốt, số lượng nhiều lớn hai mơi trường 2,5:0,2 Mẫu xanh, khơng hình thành PLBs chồi B C E F Hình 4.3 Khả tạo chồi từ PLBs mẫu cấy môi trường khảo sát (B) MS 2,5:0,2; (C) MS 3:0,2; (E) MS 2,5:0,5; (F) MS 3:0,5 BA NAA giữ vai trò quan trọng tái sinh PLBs chồi nhiều giống lan Một số nghiên cứu cho thấy kết hợp BA nồng độ 2,5 – mg/l NAA nồng độ 0,5 – mg/l cho khả tạo chồi PLBs cao (Herman, 29   2000; Nasiruddin cộng sự, 2003; Talukder cộng sự, 2003) Ở đề tài nghiên cứu cho kết tương tự: Sự kết hợp BA 2,5 mg/l NAA 0,5 mg/l cho khả tái sinh PLBs tốt 4.4 Kiểm tra lại nhiễm virus mẫu sau nuôi cấy Kết kiểm tra mẫu sau q trình ni cấy cho thấy 100% mẫu kiểm tra hồn tồn khơng có diện virus Điều giúp khẳng định cách chắn q trình ni cấy chúng tơi tạo mẫu virus Hình 4.4 Kết phát virus mẫu lan Mokara Chao f Praya Sunset phương pháp PCR (1Ỉ10) Mẫu; (11) Đối chứng dương (+); (12) Đối chứng âm (-); (13) thang DNA 1kb Mặc dù nguồn mẫu ban đầu dùng cho q trình ni cấy đảm bảo virus, nhiên tái nhiễm trình ni cấy mơ điều hồn tồn xảy Vì việc kiểm tra lặp lại sau trình ni cấy khâu quan trọng định thành cơng quy trình nhân giống bệnh virus 30   Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận ¾ Thanh lọc nguồn mẫu virus (CyMV ORSV) phương pháp RTPCR ¾ Dung dịch javen 20%, thời gian khử trùng 30 phút thích hợp cho việc khử trùng mẫu phát hoa lan Mokara Chao Praya Sunset ¾ Mơi trường MS bổ sung 2,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA thích hợp cho tái sinh PLBs từ mẫu phát hoa ni cấy ¾ Bước đầu xây dựng thành cơng quy trình nhân giống lan Mokara Chao Praya Sunset bệnh virus 5.2 Đề nghị ¾ Sử dụng hệ thống ngập chìm tạm thời (hệ thống TIS) để nhân nhanh cụm chồi lan Mokara Chao Praya Sunset quy mơ cơng nghiệp ¾ Áp dụng quy trình xây dựng thành công để nhân giống bệnh số giống lan có giá trị khác 31   TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Minh Chơn 2004 Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật Nhà xuất đại học Cần Thơ Trần Thị Dung 2003 Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến Phạm Văn Ty 2007 Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Phú Dũng 2005 Xây dựng quy trình phát virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu (Mealybug wilt) dứa Cayenne phương pháp RT-PCR Luận văn kỹ sư Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP HCM Nguyễn Xuân Dũng, Nguyễn Quốc Toàn, Đặng Quỳnh Chi Nguyễn Quốc Bình 2009 Phát Cymbidium mosaic virus Odontigossum ringspot Multiplex RT-PCR Real-time RT-PCR Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hồ Huỳnh Thùy Dương 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Nguyễn Hữu Định 2005 Nghiên cứu nhân giống nêu (Piper nigrum) phương pháp nuôi cấy mô Luận văn kỹ sư Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP HCM Trần Quang Hồng 2005 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến q trình ni cấy in vitro hai giống lan Dendrobium Cymbidium Luận văn kỹ sư Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm Tp HCM Lê Văn Hồng 2007 Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật Nhà xuất khoa học kỹ thuật 10 Dương Công Kiên 2003 Nuôi cấy mô thực vật Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 11 Cung Hồng Phi Phượng 2006 Ứng dụng hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời nhân giống lan hồ điệp lai Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Bá Tiếp 2007 Tìm hiểu virus chế gây bệnh Đại học Nông Nghiệp Hà Nội 13 Phạm Hùng Vân 2009 PCR real-time PCR vấn đề ứng dụng thường gặp Nhà xuất Y học 14 Vũ Văn Vụ, Vũ Tâm Hồng Minh Tấn 2000 Sinh lí học thực vật Nhà xuất giáo dục Tài liệu tiếng Anh 15 Chang C and Chang W.C 1998 Plant regeneration from callus culture of Cymbidium ensifolium var misericors Plant Cell Reports 17: 251-255 16 Flynn P 1996 Virus Diseases of Orchids Horticulture and Home Pest New IC-475 - April 12, 1996 17 Gautheret J.R 1939 Sur la possibilite de reaslier la culture in definie des tissue de tubercules de carotte C R Acad Sci (Paris) 18 Huan L.V.T and Tanaka 2004 Callus induction from protocorm-like body segments and plant regeneration in Cymbidium (Orchidaceae) The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 79: 406-410 32   19 Haberlandt G 1902 Kultureversuche mit isolierten Pflanzenzellen Sitzungsber Akad Wiss Wien Math Nat Classe 111 20 Hudson C.C., Liu M., Chiang G.G., Otterness D.M., Loomis D.C., Kaper F., Giaccia A.J & Abraham R.T 2002 Mol Cell Biol 22: 7004−7014 21 Krikorian A.D and Berquam D.L 1969 Plant cell and tissue culture; the role of Haberlandt Bot Rev 22 Marais F 2002 Virus Diseases Orchid Society of Northern Transvaal Http://www.ont.co.za/virus_diseases.htm 23 McMillan J.R and Vendrame W.A 2005 Color break in orchid flowers Proc Fla State Hort Soc, 118, p 287-288 24 Moran J and Knoxfield 1999 Virus diseases of orchids Http://www.dpi.vic.gov.au/DPI/nreninf.nsf/childdocs 25 Morel G.M And Martin C 1955 Guerison de plantes atteintes de maladies a virus; par culture de meristemes apicaux Rep XIVth Int Hort Congr Netherlands P 303-310 26 Morel G.M 1960 Producing virus-free Cymbidiums Amer Orchid Soc Bull 29: 496-497 27 Nasiruddin, K.M., Begum R and Yesmin S 2003 Protocorm like bodies and plantlet regeneration from Dendrobium formosum leaf callus Journal of Plant Science 2: 955-957 28 Navalinskiene M., Raugalas J., Samuitiene M 2005 Viral diseases of flower plants 16 Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.) Biologija Nr 2: 29-34 29 Nayak N.R., Chand P.K., Rath S.P., and Patnaik S.N 1998 Influence of some plant growth regulators on the growth and organogenesis of Cymbidium aloifolium (L) Sw Seed derived rhizomes in vitro In vitro Cellular and Dev Biol Plant 34: 185 - 188 30 Park S.Y., Hosakatte N and Kee-Yoeup Paek 2002 Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk-derived leaves In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 38: 168-172 31 Prescott L.M., et al 2005 Microbiology 7th Ed McGraw-Hill 32 Reinert J., 1958 Morphogenese und ibre Kontrolle an Gewebekuturen aus Carrotten Naturwissenschaften 45: 344-345 33 Ryu K.H and Park 1995 The complete nucleotide sequence and genome organisation of odontoglossum ringspot tobamovirus RNA Arch Virol 140: 1577-1587 34 Seoh ML., Wong SM and Zhang L 1998 Simultaneous TD:RT-PCR detection of Cymbidium mosaic potexvirus and Odontoglossum ringspot tobamovirus with a single pair of primers Journal of Virological Methods 72: 197-204 35 Sheelavantmath S.S., Murthy H.N., Pyati, A.N., Kumar H.G.A and Ravishankar B.V 2000 In vitro propagation of the endangered orchid Geodorum densiflorum through rhizome section culture Plant Cell Tissue Organ Culture 60: 151-154 33   36 Steward F.C 1958 Growth and development of cultivated cells III Interpretations of the growth from free cell to carrot plant Am J Bot 45: 709713 37 Talukder, S.K., Nasiruddin, K.M., Yesmin S., Hassan L and Begum R 2003 Shoot proliferation of Dendrobium orchid with BAP and NAA Journal of Biological Science 3: 1058-1062 38 University of Illinois Extention 1990 Common virus diseases of orchids Report on plant diseases Department of crop sciences University of Illinois at Urbana Champaign Http://www.aces.uiuc.edu/vista/pdf_pubs/614.pdf 39 Vij S.P., Abhilasha D and Dhiman A 1994 Regenerative competence of Bletilla striata pesudobulb segments: a study in vitro Journal of Orchid Society 11: 93-97 40 Zettler F.W., Ko N.J., Wisler G.C., Elliot M.S., Wong S.M 1990 Viruses of orchids and their control Plant Dis 74: 621-626 41 White P.R 1934 Potentially unlimited growth of excised tomato root tips in a liquid medium Plant Physiol 42 White P.R 1939 Potentially unlimited growth of excised plant callus in an artificial medium Am J Bot 43 Wong S.M., Mahtani P.H., Lee K.C., Yu H.H., Tan Y., Neo K.K., Chan Y., Wu M and Chng C.G 1997 Cymbidium mosaic potexvirus RNA: complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis Arch Virol 142: 383-391 34   PHỤ LỤC Thành phần môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962)   Các họ chi virus thực vật (Prescott L M cs., 2005)   ... Praya Sunset d) Hoa: có cánh với màu vàng chanh, cánh hoa có chấm phối cánh hoa đẹp Hoa mọc thành phát hoa, mọc từ nách thân, đợt hoa cho từ đến phát hoa, phát hoa có từ 8- 16 hoa Phát hoa có kết... hình trụ mọc cách hai bên thân Phát hoa mọc từ nách thân, phát hoa dài mang nhiều hoa thường khơng phân nhánh Hoa cỡ trung bình đến lớn, cánh đài hoa lớn Hoa có nhiều màu sắc phong phú: trắng,... lượng N-P-K tương đương Thời gian sau tháng trở số giống hoa bắt đầu cho hoa, cần phun bổ sung phân bón để kích thích hoa, hoa đẹp, phát hoa dài Về đất trồng, nên chọn đất phù sa ven sơng, có tỷ