1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trà hoa vàng (Camellia spp.), thuộc họ chè (Theaceae), là loài thực vật quý hiếm có giá trị làm cảnh và có giá trị chữa bệnh. Cho đến nay trà hoa vàng chỉ đƣợc tìm thấy ở một số vùng thuộc Trung Quốc, Việt Nam và đã đƣợc ghi vào sách đỏ (Trần Ninh và Hakoda, 2009; George and Anthony, 2013). Trà hoa vàng có tinh dầu, polyphenol, các alkaloid, các vitamin, các nguyên tố nhƣ Se, Ge, Mo, Mn, Zn (Qin et al., 2008), có tác dụng trong việc phòng và chữa một số bệnh nhƣ: cao huyết áp, kiết lị, lở loét và một số bệnh ngoài da khác. Những năm gần đây, việc kiểm nghiệm dƣợc lý đầu tiên của trà hoa vàng đã đƣợc tiến hành trên động vật và đã cho kết quả khả quan. Thử nghiệm trên chuột cho thấy, dịch chiết từ lá và hoa của cây trà hoa vàng có khả năng ức chế tế bào tiền ung thƣ gan (Li et al., 2007). Nghiên cứu khác của Chen et al. (1993) và Qin et al. (2008) đã chỉ ra rằng trà hoa vàng có tác dụng rõ rệt trong việc giảm lƣợng lipid máu, rất tốt cho bệnh cao huyết áp do khả năng làm giảm và điều hòa huyết áp, tăng cƣờng hệ miễn dịch và kéo dài tuổi thọ. Trà hoa vàng còn chứa các hợp chất polyphenol chống oxy hóa cao hơn so với các loại trà khác (Qin et al., 2008; Lixia et al., 2011). Các flavonids, polyphenol, polysaccharide, trong trà hoa vàng có tác dụng chống viêm, ức chế ung thƣ gan, chống quá trình oxi hóa, điều chỉnh lipid huyết thanh giảm và kích thích sự thèm ăn và đặc biệt là không có tác dụng phụ (Chen et al., 2009; Lin et al., 2013; Wei et al., 2015). Có thể nói, trà hoa vàng là cây dƣợc liệu rất quý, rất cần đƣợc bảo tồn, phát triển và khai thác hiệu quả nguồn gen. Trà hoa vàng là nguồn dƣợc liệu quý nên những năm gần đây, trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh nói riêng và Việt Nam nói chung đang trong tình trạng khai thác quá mức do chƣa có biện pháp quản lý, sử dụng và bảo tồn phù hợp nên các quần thể trà hoa vàng trong tự nhiên giảm mạnh, sự phân bố cũng bị thu hẹp (Trần Ninh và Hakoda, 2010; Ngô Thị Minh Duyên và cs., 2011; Đỗ Văn Tuân, 2013-2016, Nguyễn Văn Việt và cs., 2017). Do đó, rất cần thiết phải có biện pháp bảo tồn nguồn gen trà hoa vàng. Một trong những thông tin làm cơ sở cho việc quản lý, bảo tồn nguồn gen là sự đa dạng di truyền nguồn gen của cây trà hoa vàng. Tuy nhiên, các thông tin về đa dạng di truyền nguồn gen trà hoa vàng phân bố ở nƣớc ta còn ít, đa số các loài trà hoa vàng đƣợc phân loại dựa theo hình thái (Trần Ninh và Hakoda, 2010; Ngô Thị Thảo và cs., 2016). Chính vì vậy, những phân tích đa dạng di truyền dựa trên sự kết hợp giữa phân tích kiểu hình và chỉ thị phân tử nhƣ RAPD hoặc ISSR sẽ góp phần làm đa dạng nguồn thông tin và do vậy sẽ hỗ trợ rất hiệu quả trong phân tích đa dạng nguồn gen trà hoa vàng. Bên cạnh công tác bảo tồn nguồn gen thì việc khai thác và phát triển nguồn gen cũng là nhiệm vụ quan trọng, đóng góp thiết thực vào việc phát triển kinh tế xã hội đặc biệt tại vùng khó khăn về kinh tế. Đối với cây trà hoa vàng, thì việc xây dựng quy trình nhân nhanh nhằm nhanh chóng cung cấp cây giống cho sản xuất sẽ không những góp phần duy trì đƣợc tập đoàn nguồn gen mà còn góp phần khai thác, sử dụng hiệu quả và bền vững nguồn gen trà hoa vàng quý phục vụ phát triển kinh tế xã hội của các vùng trồng cây trà hoa vàng nhƣ Quảng Ninh. Thời gian gần đây, các biện pháp nhân giống truyền thống nhƣ giâm cành, ghép cành và ghép cây con cũng đƣợc sử dụng để nâng cao năng suất số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cây giống trà hoa vàng đƣợc trồng tại Quảng Ninh. Đây là những biện pháp nhân giống trà hiệu quả, tuy nhiên nó lại bị hạn chế bởi một số yếu tố nhƣ: tốc độ nhân chậm, không có sẵn vật liệu trồng thích hợp, phụ thuộc vào thời vụ, tỉ lệ sống kém ở vƣờn ƣơm, khó khăn trong quá trình tạo rễ từ cành giâm (Smith and Hood, 1995; Mondal et al., 2004). Việc ứng dụng chỉ thị phân tử để phân loại, đánh giá đa dạng di truyền cây trà hoa vàng phân bố ở Quảng Ninh và sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong nhân giống sẽ không chỉ góp phần cung cấp thêm thông tin khoa học để bảo vệ nguồn gen mà còn là phƣơng thức hiệu quả để phát triển nguồn dƣợc liệu phục vụ công nghiệp dƣợc. Xuất phát từ những lý do trên, việc thực hiện đánh giá đa dạng di truyền cây trà hoa vàng và xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho cây trà hoa vàng Quảng Ninh làm cơ sở cho ứng dụng trong nhân giống ở quy mô lớn là cấp thiết. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Hệ thống hóa đƣợc cơ sở dữ liệu về đặc điểm thực vật, hóa sinh và mức độ đa dạng di truyền trà hoa vàng thu thập ở Quảng Ninh, làm cơ sở cho công tác nghiên cứu và phát triển cây trà hoa vàng thành nguồn dƣợc liệu mới; - Xây dựng quy trình nhân giống cây trà hoa vàng (Camellia spp.) Ba Chẽ, Quảng Ninh với hệ số nhân giống cao, chất lƣợng cây giống tốt, đồng đều phục vụ bảo tồn và phát triển cây thuốc quý này ở qui mô công nghiệp.
HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG QUANG BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA spp.) THU THẬP TẠI QUẢNG NINH NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP- 2018 MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu đề tài 1.4 Những đóng góp luận án 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) 2.1.1 Nguồn gốc chi trà Camellia 2.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật học chi trà Camellia 2.1.3 Đặc điểm phân bố chi trà Camellia 2.1.4 Sơ lƣợc lịch sử phát phân bố trà hoa vàng (Camellia spp.) 2.2 Những nghiên cứu chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) giới 2.2.1 13 Những nghiên cứu đa dạng di truyền nhân giống chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) 2.2.2 13 Nghiên cứu giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) giới 2.3 20 Những nghiên cứu chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) nƣớc 2.3.1 10 26 Những nghiên cứu đa dạng di truyền, nhân giống chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) 26 iii 2.3.2 2.4 Giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) nƣớc 33 Một số đặc điểm trà hoa vàng Camellia spp Quảng Ninh 38 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 41 3.2 Vật liệu nghiên cứu 41 3.3 Nội dung nghiên cứu 42 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 42 3.4.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu, mô tả đặc điểm hình thái xác định thành phần hàm lƣợng số hợp chất 3.4.2 42 Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen trà hoa vàng thu thập đƣợc kỹ thuật thị phân tử 3.4.3 3.4.4 Phƣơng pháp nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật nhân giống trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh 47 Phƣơng pháp xử lý số liệu 58 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 59 Thu thập nguồn gen trà hoa vàng tỉnh Quảng Ninh đánh giá đặc điểm hình thái thực vật hóa sinh chúng 4.1.1 59 Hàm lƣợng số hợp chất có hoạt tính sinh học nụ hoa trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tỉnh Quảng Ninh 4.2 59 Thu thập nguồn gen đánh giá đặc điểm hình thái thực vật trà hoa vàng (Camellia spp.) Quảng Ninh 4.1.2 44 65 Đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng thu thập đƣợc kỹ thuật thị phân tử 75 4.2.1 Kết phân tích đa dạng kiểu hình mẫu giống trà hoa vàng thu thập 76 4.2.2 Kết phân tích đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng thị RAPD ISSR 78 4.3 Xây dựng qui trình nhân giống trà hoa vàng 86 4.3.1 Xây dựng quy trình nhân giống in vitro trà hoa vàng 87 4.3.2 Xây dựng quy trình nhân giống vơ tính trà hoa vàng phƣơng pháp giâm cành 105 iv PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119 5.1 Kết luận 119 5.2 Kiến nghị 119 Danh mục cơng trình khoa học công bố liên quan đến luận án 121 Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục 143 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt (tiếng Anh) AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BLAST Basic Local Alignment Search Tool BA Benzyl adenine C Catechin CF Caffeic acid CV(%) Coefficient of variation (%) CR Coumarin Ct Công thức Cs Cộng CP Cổ phần CK Chất khô C00 Chu vi gốc DPPH 2,2 - Diphenyl -1 - picrylhydrazyl D00 Đƣờng kính gốc D1.3 Đƣờng kính thân ngang ngực Đc Đối chứng EC Epicatechin EGCG Epigallocatechin 3-gallate ECG Epicatechin 3-gallate GA3 Gibberellic acid HSN Hệ số nhân HPLC High performance Liquid Chromatography Hvn Chiều cao vút IUCN International Union for Conservation of Nature ISSR Inter Simple Sequence Repeat IBA Indol butyric acid Ki Kinetin LSD0.05 Least significant different 5% MS Murashige and Skoog vi MAS Marker Assisted Selection ND Nƣớc dừa NCBI National Center for Biotechnology information PCR Polymerase Chain Reaction PCA P - Coumaric acid QC Quercetin RES Resveratrol RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RP Resolving power RT Rutin VA Vanilic acid SSR Simple Sequence Repeat SLA Salicylic acid Tm Nhiệt độ gắn mồi THT Than hoạt tính TB Trung bình TNHH Trách nhiệm hữu hạn WPM Wooden plant medium α – NAA Axit α - naphtyl axetic vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Danh sách 25 mẫu giống trà hoa vàng dùng đánh giá đa dạng di truyền 41 3.2 Chế độ gradient với kênh A kênh B 44 3.3 Danh sách mồi sử dụng RADP ISSR 44 3.4 Thành phần phản ứng RAPD - PCR ISSR - PCR 46 3.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 46 4.1 Kết tính chiều cao vút trung bình trà hoa vàng 12 tuyến thu thập 4.2 60 Kết tính đƣờng kính gốc trung bình trà hoa vàng 12 tuyến thu thập 61 4.3 Các tiêu trà hoa vàng 12 tuyến thu thập 63 4.4 Danh sách mẫu nụ hoa trà hoa vàng thu thập Quảng Ninh đƣợc sử dụng cho phân tích hợp chất có hoạt tính sinh học 4.5 Hàm lƣợng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin quercetin trà hoa vàng 4.6 68 Hàm lƣợng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol coumarin trà hoa vàng 4.7 70 Hàm lƣợng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin quercetin nụ hoa trà hoa vàng 4.8 66 73 Hàm lƣợng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol coumarin nụ hoa trà hoa vàng 74 4.9 Đa hình 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa thị RAPD ISSR 80 4.10 Hệ số tƣơng đồng di truyền 25 mẫu giống trà hoa vàng 83 4.11 Hiệu tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn cành mang mắt ngủ 88 4.12 Ảnh hƣởng vật liệu nuôi cấy tới hiệu tạo nguồn vật liệu ban đầu 90 4.13 Ảnh hƣởng tổ hợp BA GA3 tới nảy mầm hạt trà hoa vàng 92 4.14 Ảnh hƣởng môi trƣờng tới sinh trƣởng chồi trà hoa vàng 94 4.15 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng tới khả nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng viii 95 4.16 Ảnh hƣởng nƣớc dừa tới khả nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng 4.17 98 Ảnh hƣởng hàm lƣợng môi trƣờng đến khả rễ chồi in vitro trà hoa vàng 4.18 99 Ảnh hƣởng giá thể đến khả thích nghi in vitro ngồi vƣờn ƣơm 4.19 101 Ảnh hƣởng tuổi in vitro tới khả thích nghi ngồi vƣờn ƣơm 103 4.20 Ảnh hƣởng biện pháp xử lý đến tỷ lệ sống cành giâm trà hoa vàng 106 4.21 Ảnh hƣởng giá thể đến tỷ lệ sống cành giâm trà hoa vàng 108 4.22 Ảnh hƣởng α-NAA đến tỷ lệ rễ cành giâm trà hoa vàng 109 4.23 Ảnh hƣởng chế phẩm giâm chiết cành đến tỷ lệ hom giâm tạo chồi 111 4.24 Ảnh hƣởng thời vụ giâm đến khả rễ cành giâm trà hoa vàng 4.25 113 Ảnh hƣởng che sáng đến sinh trƣởng trà hoa vàng giai đoạn vƣờn ƣơm 4.26 114 Ảnh hƣởng số lần bón phân đến sinh trƣởng trà hoa vàng vƣờn ƣơm 4.27 115 Ảnh hƣởng thời gian đảo bầu đến sinh trƣởng giống giai đoạn vƣờn ƣơm 117 ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Hình dạng chóp 2.2 Hình dạng gốc 2.3 Quả hình cầu (A: C hakodae), hình cầu dẹt (B: C petelotii) mở để lộ trụ (C: C tamdaoensis) 4.1 Hoa, quả, trà hoa vàng thu thập tuyến số Khe Sút, Hoành Bồ, Quảng Ninh 4.2 64 Lá, hoa, trà hoa vàng thu thập Hoành Bồ, Quảng Ninh, mẫu Csp1 77 4.3 Sơ đồ tƣơng đồng 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa kiểu hình 77 4.4 Ảnh điện di sản phẩm phản ứng mồi RAPD02 với 25 mẫu trà hoa vàng 79 4.5 Sơ đồ quan hệ di truyền 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa thị phân tử RAPD ISSR 4.6 84 Đoạn cành mang mắt ngủ đƣợc khử trùng NaOCl 7% bị nhiễm nấm sau tuần nuôi cấy 4.7 89 Cây nảy mầm từ hạt trà hoa vàng đƣợc khử trùng NaOCl 7% sau 12 tuần nuôi cấy 4.8 91 Ảnh hƣởng tổ hợp BA GA3 tới trình nảy mầm hạt trà hoa vàng sau tuần nuôi cấy 4.9 93 Ảnh hƣởng tổ hợp chất điều tiết sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng sau tuần nuôi cấy 4.10 Ảnh hƣởng hàm lƣợng môi trƣờng nuôi cấy tới trình rễ in vitro trà hoa vàng sau 12 tuần nuôi cấy 4.11 100 Ảnh hƣởng giá thể tới khả thích nghi in vitro ngồi vƣờn ƣơm sau 12 tuần ni cấy 4.12 97 102 Ảnh hƣởng tuổi in vitro tới khả thích nghi ngồi vƣờn ƣơm (10 tuần sau cây) 104 4.13 Sơ đồ quy trình nhân giống in vitro trà hoa vàng Ba Chẽ, Quảng Ninh 105 4.14 Sơ đồ quy trình nhân giống in vivo trà hoa vàng 118 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Đặng Quang Bích Tên Luận án: “Đánh giá đa dạng di truyền xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập Quảng Ninh” Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 9620110 Tên sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Hệ thống hóa đƣợc sở liệu đặc điểm thực vật, hóa sinh mức độ đa dạng di truyền trà hoa vàng thu thập Quảng Ninh, làm sở cho công tác nghiên cứu phát triển trà hoa vàng thành nguồn dƣợc liệu mới; - Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng (Camellia spp.) với hệ số nhân giống cao, chất lƣợng giống tốt, đồng phục vụ bảo tồn phát triển thuốc quý qui mô công nghiệp Phƣơng pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu 1) Thu thập nguồn gen, đánh giá đặc điểm hình thái thực vật hóa sinh trà hoa vàng phân bố Quảng Ninh; 2) Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen trà hoa vàng thu thập đƣợc kỹ thuật thị phân tử; 3) Nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật nhân giống trà hoa vàng Vật liệu nghiên cứu Là mẫu lá, hoa, quả, hạt, đoạn thân trà hoa vàng đƣợc thu thập tỉnh Quảng Ninh số khu vực có trà hoa vàng phân bố Các phƣơng pháp nghiên cứu: (1) Phƣơng pháp thu thập mẫu (Hồng Chung, 2006; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2007; Nguyễn Bá, 2007); (2) Phƣơng pháp mơ tả hình thái so sánh hình thái (Hồng Thị Sản Hồng Thị Bé, 2005; Nguyễn Nghĩa Thìn, 2009); (3) Phƣơng pháp kế thừa; (4) Phƣơng pháp xác định thành phần hàm lƣợng số hợp chất thứ cấp, áp dụng phƣơng pháp phân tích sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) đƣợc mơ tả theo Ang et al (2013) để đánh giá thành phần, hàm lƣợng hợp chất sinh học trà hoa vàng; (5) Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền thị ISSR RAPD Kỹ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền sử dụng thị ISSR 45 thị RAPD đƣợc thực máy PCR (Eppendorf ) Phản ứng PCR bao gồm thành phần tiêu chuẩn sử dụng nồng độ dung dịch đệm theo khuyến cáo nhà sản xuất, 0,2 mM dNTPs, 0,25 mM MgCl2, 0,5 µM mồi, 0,05 đơn vị enzyme/µl Phản ứng PCR đƣợc thực với chu kỳ nhiệt nhƣ sau: 94°C - phút, (94°C - 30 giây, Tm - 30 giây, 72°C - phút) x 40 chu kỳ, 72°C - (5 - 7) phút (Valdemar et al., 2004; Oliveira et al., 2010) Xử lý số liệu: Xây dựng sơ đồ đa dạng di truyền phần mềm NTSYS 2.1; (6) Phƣơng pháp nghiên cứu kỹ thuật xi ... ảnh xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng 7.1 Những hình ảnh xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng in vitro 7.1.1 hình ảnh vào mẫu trà hoa vàng Mẫu giống trà hoa vàng Mẫu giống trà hoa. .. trà hoa vàng thị RAPD ISSR 78 4.3 Xây dựng qui trình nhân giống trà hoa vàng 86 4.3.1 Xây dựng quy trình nhân giống in vitro trà hoa vàng 87 4.3.2 Xây dựng quy trình nhân giống vơ tính trà hoa vàng. .. mức độ đa dạng di truyền trà hoa vàng thu thập Quảng Ninh, làm sở cho công tác nghiên cứu phát triển trà hoa vàng thành nguồn dƣợc liệu mới; - Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng (Camellia