Đánh giá đa dạng di truyền và xây dựng quy trình nhân giống cây trà hoa vàng (camellia spp ) thu thập tại quảng ninh

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM ĐẶNG QUANG BÍCH ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY TRÀ HOA VÀNG (CAMELLIA spp.) THU THẬP TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 62 01 10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo TS Nguyễn Văn Phú NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Kết nghiên cứu luận án hoàn toàn trung thực, khách quan, chưa tập thể, cá nhân công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ trình thực luận án cám ơn thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 07 tháng 03 năm 2019 Tác giả luận án Đặng Quang Bích i LỜI CẢM ƠN Sau 03 năm học tập, nghiên cứu Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, q trình thực luận án môn Sinh lý Thực vật môn Công nghệ Sinh học thực vật, nhờ hướng dẫn tận tình giúp đỡ thầy giáo, cán phịng thí nghiệm môn, với nỗ lực, học tập, nghiên cứu thân, tơi hồn thành luận án nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Quản lý đào tạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban chủ nhiệm khoa Nông học, khoa Công nghệ Sinh học thầy cô giáo hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo; TS Nguyễn Văn Phú tận tình hướng dẫn bảo hỗ trợ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Trường Sơn, ThS Ninh Thị Thảo, ThS Nguyễn Thị Thùy Linh, TS Hoàng Hải Hà, Ths Phạm Thị Thu Hằng tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu thực đề tài Tôi xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới em sinh viên toàn thể bạn bè anh, chị thực tập phịng thí nghiệm mơn Sinh lý Thực vật, môn Công nghệ Sinh học thực vật phịng thí nghiệm Hóa sinh khoa Cơng nghệ Thực phẩm hợp tác, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian nghiên cứu Và cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân ln động viên, hỗ trợ tạo động lực cho suốt trình học tập, nghiên cứu Hà Nội, ngày 07 tháng 03 năm 2019 Tác giả luận án Đặng Quang Bích ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp luận án 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) 2.1.1 Nguồn gốc chi trà Camellia 2.1.2 Đặc điểm hình thái thực vật học chi trà Camellia 2.1.3 Đặc điểm phân bố chi trà Camellia 2.1.4 Sơ lược lịch sử phát phân bố trà hoa vàng (Camellia spp.) 10 2.2 Những nghiên cứu chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) giới 13 2.2.1 Những nghiên cứu đa dạng di truyền nhân giống chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) 13 2.2.2 Nghiên cứu giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) giới 20 iii 2.3 Những nghiên cứu chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) nước 26 2.3.1 Những nghiên cứu đa dạng di truyền, nhân giống chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) 26 2.3.2 Giá trị sử dụng, thực trạng khai thác chi trà Camellia trà hoa vàng (Camellia spp.) nước 33 2.4 Một số đặc điểm trà hoa vàng camellia spp Tại quảng ninh 38 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 41 3.1 Đối tượng nghiên cứu 41 3.2 Vật liệu nghiên cứu 41 3.3 Nội dung nghiên cứu 42 3.4 Phương pháp nghiên cứu 42 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu, mơ tả đặc điểm hình thái xác định thành phần hàm lượng số hợp chất 42 3.4.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen trà hoa vàng thu thập kỹ thuật thị phân tử 44 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật nhân giống trà hoa vàng thu thập Ba Chẽ, Quảng Ninh 47 3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 58 Phần Kết thảo luận 59 4.1 Thu thập nguồn gen trà hoa vàng tỉnh quảng ninh đánh giá đặc điểm hình thái thực vật hóa sinh chúng 59 4.1.1 Thu thập nguồn gen đánh giá đặc điểm hình thái thực vật trà hoa vàng (Camellia spp.) Quảng Ninh 59 4.1.2 Kết phân tích đa dạng kiểu hình mẫu giống trà hoa vàng thu thập 65 4.1.3 Hàm lượng số hợp chất có hoạt tính sinh học nụ hoa trà hoa vàng (Camellia spp.) thu thập tỉnh Quảng Ninh 67 4.2 Đánh giá đa dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng thu thập kỹ thuật thị phân tử 78 4.3 Xây dựng qui trình nhân giống trà hoa vàng 87 4.3.1 Xây dựng quy trình nhân giống in vitro trà hoa vàng 88 4.3.2 Xây dựng quy trình nhân giống vơ tính trà hoa vàng phương pháp giâm cành 106 iv Phần Kết luận kiến nghị 120 5.1 Kết luận 120 5.2 Kiến nghị 120 Danh mục cơng trình khoa học công bố liên quan đến luận án 122 Tài liệu tham khảo 123 Phụ lục 141 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi Chữ viết tắt Viết đầy đủ AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BLAST Basic Local Alignment Search Tool BA Benzyl adenine C Catechin CF Caffeic acid CV(%) Coefficient of variation (%) CR Coumarin Ct Công thức Cs Cộng CP Cổ phần CK Chất khô C00 Chu vi gốc DPPH 2,2 - Diphenyl -1 - picrylhydrazyl D00 Đường kính gốc D1.3 Đường kính thân ngang ngực Đc Đối chứng EC Epicatechin EGCG Epigallocatechin 3-gallate ECG Epicatechin 3-gallate GA3 Gibberellic acid HSN Hệ số nhân HPLC High performance Liquid Chromatography Hvn Chiều cao vút IUCN International Union for Conservation of Nature ISSR Inter Simple Sequence Repeat IBA Indol butyric acid Ki Kinetin LSD0.05 Least significant different 5% MS Murashige and Skoog Chữ viết tắt Viết đầy đủ MAS Marker Assisted Selection ND Nước dừa NCBI National Center for Biotechnology information PCR Polymerase Chain Reaction PCA P - Coumaric acid QC Quercetin RES Resveratrol RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RP Resolving power RT Rutin VA Vanilic acid SSR Simple Sequence Repeat SLA Salicylic acid Tm Nhiệt độ gắn mồi THT Than hoạt tính TB Trung bình TNHH Trách nhiệm hữu hạn WPM Wooden plant medium α – NAA Axit α - naphtyl axetic vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1 Danh sách 25 mẫu giống trà hoa vàng dùng đánh giá đa dạng di truyền 41 3.2 Chế độ gradient với kênh A kênh B 44 3.3 Danh sách mồi sử dụng RADP ISSR 44 3.4 Thành phần phản ứng RAPD - PCR ISSR - PCR 46 3.5 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 46 4.1 Kết tính chiều cao vút trung bình trà hoa vàng 12 tuyến thu thập 60 4.2 Kết tính đường kính gốc trung bình trà hoa vàng 12 tuyến thu thập 61 4.3 Các tiêu trà hoa vàng 12 tuyến thu thập 63 4.4 Danh sách mẫu nụ hoa trà hoa vàng thu thập Quảng Ninh sử dụng cho phân tích hợp chất có hoạt tính sinh học 68 4.5 Hàm lượng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin quercetin trà hoa vàng 70 4.6 Hàm lượng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol coumarin trà hoa vàng 72 4.7 Hàm lượng catechin C, EC, EGCG, ECG, rutin quercetin nụ hoa trà hoa vàng 76 4.8 Hàm lượng phenolic CF, PCA, SLA, VA, resveratrol coumarin nụ hoa trà hoa vàng 77 4.9 Đa hình 25 mẫu giống trà hoa vàng dựa thị RAPD ISSR 81 4.10 Hệ số tương đồng di truyền 25 mẫu giống trà hoa vàng 84 4.11 Hiệu tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn cành mang mắt ngủ 89 4.12 Ảnh hưởng vật liệu nuôi cấy tới hiệu tạo nguồn vật liệu ban đầu 91 4.13 Ảnh hưởng tổ hợp BA GA3 tới nảy mầm hạt trà hoa vàng 93 4.14 Ảnh hưởng môi trường tới sinh trưởng chồi trà hoa vàng 95 4.15 Ảnh hưởng tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng tới khả nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng 96 4.16 Ảnh hưởng nước dừa tới khả nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng 99 4.17 Ảnh hưởng hàm lượng môi trường đến khả rễ chồi in vitro trà hoa vàng 100 viii ... dạng di truyền mẫu giống trà hoa vàng thu thập kỹ thu? ??t thị phân tử 78 4.3 Xây dựng qui trình nhân giống trà hoa vàng 87 4.3.1 Xây dựng quy trình nhân giống in vitro trà hoa vàng. .. độ đa dạng di truyền trà hoa vàng thu thập Quảng Ninh, làm sở cho công tác nghiên cứu phát triển trà hoa vàng thành nguồn dược liệu mới; - Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng (Camellia spp. ). .. hóa sinh trà hoa vàng phân bố Quảng Ninh; 2) Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen trà hoa vàng thu thập kỹ thu? ??t thị phân tử; 3) Nghiên cứu số biện pháp kỹ thu? ??t nhân giống trà hoa vàng Vật liệu