HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 82010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV (STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành: Kỹ thuật Trồng trọt Mã số: 60.62.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Hướng dẫn Khoa học: 1. PGS. TS. DƯƠNG TẤN NHỰT 2. TS. BÙI MINH TRÍ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 82010 ii LÝ LỊCH CÁ NHÂN Tôi tên là Hà Thị Tuyết Phượng, sinh năm 1981 tại huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. Con Ông Hà Văn Xua và Bà Nguyễn Thị Hữu. Tốt nghiệp trung học phổ thông tại Trường Trung học phổ thông An Hữu, tỉnh Tiền Giang năm 2000. Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học, hệ Chính quy tại trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh năm 2005. Từ năm 2006 đến nay, công tác tại Khoa Nông nghiệp Trường Đại học Tiền Giang. Tháng 9 năm 2006 theo học Cao học ngành Kỹ thuật Trồng trọt tại Trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ liên lạc: Nhà số 342, tổ 13, ấp 4, xã Tân Thanh, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. Điện thoại: 0982.137.800 Email: tuyetphuonghathigmail.com iii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Thị Tuyết Phượng iv LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông học, Phòng Sau đại học Trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện trong thời gian học tập. Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp Trường Đại học Tiền Giang đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí trong quá trình học tập. Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện trong quá trình làm đề tài. Quý Thầy Cô trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập tại trường. Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS.TS. Dương Tấn Nhựt, TS. Bùi Minh Trí, những người Thầy luôn tận tụy và giàu lòng hy sinh cho sự nghiệp trồng người. Một tấm gương lao động cần mẫn và hết lòng đam mê khoa học. Cám ơn Quý Thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và hỗ trợ kinh phí cho em trong quá trình làm đề tài. Cám ơn Quý Thầy đã cho em có cơ hội tiếp xúc với môi trường nghiên cứu khoa học mà em từng mơ ước được một lần đến. Cám ơn Quý Thầy đã là điểm tựa và chấp cánh cho em để ngày càng được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cám ơn PGS.TS. Lê Quang Hưng, TS. Võ Thái Dân đã tận tình chỉ dẫn giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Con xin cám ơn Ba Mẹ, các Chị đã hết lòng thương yêu, đùm bọc, dìu dắt con trong cuộc đời. Cám ơn các Anh Chị Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ trong quá trình làm đề tài. Em xin cám ơn thầy Phạm S, thầy Tuấn, chú Tới, chú Xuân Tùng, cô Toản, cô Hương, cô Lan, chị Hằng; anh Nam, Công, Hùng, Dũng, Tâm, Sơn; bạn Trang, Tâm, Công; em Thùy, Sương, Bá Nam, Tuấn, Thái, Dung, Chương, Nam, Diệu Hiền, Thanh, Hiền, Nhiên, Giáp, Hằng, Trực, Nhật, Tùng, Thưởng, Loan, Thương, Thu, Hương, Chiến, Nguyễn, Anh, Kha, My, Hà, Thái Hiền, Nhân, Quỳnh, Huy, Phúc Huy, Thuận, Vương đã giúp đỡ trong quá trình làm đề tài. Con xin cám ơn gia đình bác Hai, gia đình chú Yên đã thương yêu, đùm bọc trong thời gian làm đề tài. v TÓM TẮT Đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống cây dâu tây (Fragaria spp.) sạch virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng của Viện Sinh học Tây Nguyên, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường từ 102008 102009. Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy giống dâu tây Mỹ Hương có khả năng phát sinh chồi từ mô lá cao hơn so với giống Mỹ Đá và dâu Pháp. Môi trường thích hợp cho quá trình phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro là môi trường MS được bổ sung 1 mgl TDZ, 0,1 mgl NAA, 30 gl sucrose và 8 gl agar. Mô lá cây dâu tây in vitro thuộc giống Mỹ Hương được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mgl TDZ, 0,1 mgl NAA, 30 gl sucrose và 8 gl agar có khả năng phát sinh chồi cao nhất. Áp dụng kỹ thuật “Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn chồi” cho khả năng nhân chồi của cây dâu tây cao hơn so với kỹ thuật “Để nguyên chồi” và kỹ thuật “Cắt lá của chồi”. Giống dâu Mỹ Hương có khả năng nhân chồi cao hơn so với giống Mỹ Đá và dâu Pháp. Chồi dâu tây thuộc giống Mỹ Hương được xử lý bằng kỹ thuật “Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn chồi” có khả năng nhân chồi cao nhất. Môi trường ½ MS được bổ sung 30 gl sucrose, 0,2 mgl IBA, 0,75 gl than hoạt tính và 8 gl agar thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của cây dâu tây trong giai đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm so với các nồng độ sucrose còn lại (0; 10; 20; 40 gl). Cây dâu tây thuộc giống Mỹ Hương kết hợp với nuôi cấy trên môi trường ½ MS được bổ sung 30 gl sucrose, 0,2 mgl IBA, 0,75 gl than hoạt tính và 8 gl agar có khả năng sinh trưởng tốt nhất trong giai đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm. Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày của ba giống dâu tây Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu Pháp bằng kỹ thuật RTPCR. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu được kiểm tra đều không bị nhiễm virus SCV. vi SUMMARY The thesis “Improving SCVfree strawberry (Fragaria spp.) propagation protocol through tissue culture method”, was carried out at Department of Plant Molecular Biology and Plant Breeding, Tay Nguyen Institute of Biology; Department of Plant Bioteachnology, Research Institute for Biotechnology and Environment from 102008 to 102009. Experiments were arranged in Completely Randomized Design with three replications. The shoot regeneration from leaf tissues of in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars, namely My Da, My Huong and Phap, depended on different genotypes and supplemented TDZ concentrations. My Huong showed the highest regeneration rate among the three strawberry cultivars. The highest shoot regeneration rate from leaf tissues of in vitro strawberry plantlets was noticed after leaf tissues had been cultivated on MS medium containing 1 mgl1 TDZ, 0.1 mgl1 NAA, 30 gl1 sucrose and 8 gl1 agar. “Leaves cutting and shoot tip wounding” treatment performed significantly higher shoot regeneration rate compared with “No cutting” and “Leaves cutting” treatments. By supplementing sucrose to growing medium, the growth of in vitro strawberry plantlets were improved and the concentration of 30 gl1 sucrose showed the optimal growth for in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars. ½ MS medium supplemented with 30 gl1 sucrose, 0.2 mgl1 IBA, 0.75 gl1 activated charcoal and 8 gl1 agar was the most suitable for the development of in vitro strawberry plantlets. After 45 days in nethouse condition, strawberry plantlets of three strawberry cultivars, namely My Da, My Huong and Phap, were screened from SCV (Strawberry Crinkle Virus) by using RTPCR technique and no virus was detected. The results of this study confirm the potential of using tissue culture technique in virusfree strawberry propagation. vii MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Trang chuẩn y .............................................................................................................. i LÝ LỊCH CÁ NHÂN ................................................................................................. ii LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iv TÓM TẮT ................................................................................................................... v SUMMARY .............................................................................................................. vi MỤC LỤC ................................................................................................................ vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... xv DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................... xvii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ................................................................................. xx 1.ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu ............................................................................................................... 1 1.2 Mục đích mục tiêu và yêu cầu của đề tài ............................................................ 2 1.2.1 Mục đích của đề tài ............................................................................................ 2 1.2.2 Mục tiêu của đề tài ............................................................................................. 3 1.2.3 Yêu cầu của đề tài .............................................................................................. 3 1.3 Giới hạn của đề tài ................................................................................................ 3 1.3.1 Thời gian nghiên cứu ......................................................................................... 3 1.3.2 Địa điểm nghiên cứu .......................................................................................... 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4 2.1 Sơ lược về cây dâu tây .......................................................................................... 4 2.1.1 Phân loại khoa học của cây dâu tây ................................................................... 4 2.1.2 Nguồn gốc phân bố của cây dâu tây ................................................................ 5 2.1.2.1 Nguồn gốc ....................................................................................................... 5 viii 2.1.2.2 Phân bố ............................................................................................................ 5 2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây dâu tây ................................................................ 5 2.1.4 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây ......................................................... 6 2.1.5 Thành phần các chất có trong quả dâu tây ......................................................... 6 2.1.6 Công dụng của cây dâu tây ................................................................................ 7 2.1.7 Điều kiện canh tác của cây dâu tây .................................................................... 7 2.1.7.1 Đất trồng .......................................................................................................... 7 2.1.7.2 Khí hậu ............................................................................................................ 7 2.1.8 Tình hình canh tác cây dâu tây........................................................................... 7 2.1.8.1 Trên thế giới .................................................................................................... 7 2.1.8.2 Ở Việt Nam ..................................................................................................... 8 2.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật ......................................................................... 13 2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật ........................................................................... 13 2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật ........................................................... 13 2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ............................................................................. 13 2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo ............................................................................................ 14 2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn ...................................................................................... 14 2.2.2.4 Nuôi cấy protoplast ....................................................................................... 14 2.2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn .......................................................................................... 14 2.2.3 Lợi ích của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô ....................................... 15 2.2.4 Các bước trong nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô ................................ 15 2.2.4.1 Chọn vật liệu và cấy ...................................................................................... 15 2.2.4.2 Nhân chồi ...................................................................................................... 15 2.2.4.3 Tạo rễ từ chồi ................................................................................................ 16 2.2.4.4 Trồng cây cấy mô ra đất ................................................................................ 16 2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống bằng nuôi cấy mô............................. 17 2.2.5.1 Sự lựa chọn mẫu cấy ..................................................................................... 17 2.2.5.2 Môi trường nuôi cấy ...................................................................................... 17 2.2.5.3 Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 17 ix 2.2.6 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................................. 18 2.2.6.1 Auxin ............................................................................................................. 18 2.2.6.2 Cytokinin ....................................................................................................... 19 2.3 Một số nghiên cứu nhân giống cây dâu tây bằng phương pháp nuôi cấy mô ..... 20 2.3.1 Trên thế giới ..................................................................................................... 20 2.3.2 Ở Việt Nam ...................................................................................................... 21 2.4 Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hại thực vật ................................................. 23 2.4.1 Kỹ thuật chẩn đoán dựa vào triệu chứng ......................................................... 23 2.4.2 Kỹ thuật chẩn đoán bằng cây chỉ thị ................................................................ 24 2.4.3 Kỹ thuật chẩn đoán bằng kính hiển vi .............................................................. 24 2.4.3.1 Chẩn đoán bằng kính hiển vi quang học ....................................................... 24 2.4.3.2 Chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................................................ 24 2.4.4 Kỹ thuật chẩn đoán bằng phản ứng huyết thanh .............................................. 24 2.4.5 Kỹ thuật chẩn đoán dựa vào nucleic acid......................................................... 25 2.4.5.1 Kỹ thuật lai phân tử (Molecular hybridization) ............................................ 25 2.4.5.2 Kỹ thuật PCR và RTPCR ............................................................................ 25 2.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RTPCR ............................................................. 25 2.5.1 Kỹ thuật PCR ................................................................................................... 25 2.5.2 Kỹ thuật RTPCR ............................................................................................. 26 2.6 Sơ lược về virus SCV gây hại trên cây dâu tây .................................................. 27 2.6.1 Phân loại ........................................................................................................... 27 2.6.2 Nguồn gốc phân bố ........................................................................................ 27 2.6.3 Hình dạng kích thước..................................................................................... 27 2.6.4 Genome ............................................................................................................ 27 2.6.5 Protein .............................................................................................................. 27 2.6.6 Phạm vi ký chủ ................................................................................................. 27 2.6.7 Phương thức lan truyền .................................................................................... 27 2.6.8 Triệu chứng và tác hại của virus SCV trên cây dâu tây ................................... 28 2.6.8.1 Triệu chứng ................................................................................................... 28 x 2.6.8.2 Tác hại của virus SCV................................................................................... 28 2.6.9 Biện pháp quản lý virus SCV ........................................................................... 28 2.6.10 Một số nghiên cứu về virus SCV ................................................................... 28 2.6.10.1 Trên thế giới ................................................................................................ 28 2.6.10.2 Ở Việt Nam ................................................................................................. 29 2.7 Một số thành tựu trong việc tạo cây sạch bệnh virus bằng phương pháp nuôi cấy mô .............................................................................................................................. 33 2.7.1 Trên thế giới ..................................................................................................... 33 2.7.2 Ở Việt Nam ...................................................................................................... 33 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 34 3.1 Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 34 3.2 Nội dung và địa điểm nghiên cứu ....................................................................... 34 3.3 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 34 3.3.1 Giống cây dâu tây ............................................................................................. 34 3.3.2 Hóa chất ........................................................................................................... 34 3.3.2.1 Hóa chất dùng trong nuôi cấy mô cây dâu tây .............................................. 34 3.3.2.2 Hóa chất dùng trong kiểm tra virus ............................................................... 36 3.3.3 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37 3.3.3.1 Thiết bị .......................................................................................................... 37 3.3.3.2 Dụng cụ ......................................................................................................... 38 3.4 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 38 3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro ......................... 38 3.4.1.1 Điều kiện thí nghiệm ..................................................................................... 38 3.4.1.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 39 3.4.1.3 Phương pháp tiến hành .................................................................................. 39 3. 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................... 40 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro .............................. 41 xi 3.4.2.1 Điều kiện thí nghiệm ..................................................................................... 42 3.4.2.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 42 3.4.2.3 Phương pháp tiến hành .................................................................................. 42 3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 43 3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro ................................................. 43 3.4.3.1 Điều kiện thí nghiệm ..................................................................................... 43 3.4.3.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 44 3.4.3.3 Phương pháp tiến hành .................................................................................. 44 3.4.3.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 44 3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong giai đoạn nuôi cấy in vitro sự lên sinh trưởng của cây dâu tây sau khi đượctrồng ra vườn ươm .................................................................................................................. 45 3.4.4.1 Điều kiện thí nghiệm ..................................................................................... 45 3.4.4.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 45 3.4.4.3 Phương pháp tiến hành .................................................................................. 46 3. 4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi ........................................................................................... 46 3.4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm .................................................................................................................. 47 3.4.5.1 Điều kiện thí nghiệm ..................................................................................... 47 3.4.5.2 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 48 3.4.5.3 Phương pháp tiến hành .................................................................................. 48 3.4.5.4 Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 54 3.5 Xử lý số liệu ........................................................................................................ 54 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 58 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro ......................... 58 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro .............................. 67 xii 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro ................................................. 76 4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong giai đoạn nuôi cấy in vitro lên sự sinh trưởng của cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm .................................................................................................................. 83 4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm ........................................................................................................................... 91 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 97 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 97 5.2 Đề nghị ................................................................................................................ 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 99 Phụ lục .................................................................................................................... 109

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU

TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV

(STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HÀ THỊ TUYẾT PHƯỢNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY DÂU

TÂY (FRAGARIA SPP.) SẠCH VIRUS SCV

(STRAWBERRY CRINKLE VIRUS) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

Địa chỉ liên lạc: Nhà số 342, tổ 13, ấp 4, xã Tân Thanh, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang

Điện thoại: 0982.137.800

E-mail: tuyetphuonghathi@gmail.com

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Thị Tuyết Phượng

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cám ơn Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông học, Phòng Sau đại học Trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện trong thời gian học tập Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp Trường Đại học Tiền Giang đã tạo điều kiện về thời gian, kinh phí trong quá trình học tập Ban lãnh đạo Viện Sinh học Tây Nguyên, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện trong quá trình làm đề tài Quý Thầy Cô trong và ngoài trường đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến PGS.TS Dương Tấn Nhựt, TS Bùi Minh Trí, những người Thầy luôn tận tụy và giàu lòng hy sinh cho sự nghiệp trồng người Một tấm gương lao động cần mẫn và hết lòng đam mê khoa học Cám ơn Quý Thầy

đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và hỗ trợ kinh phí cho em trong quá trình làm đề tài Cám ơn Quý Thầy đã cho em có cơ hội tiếp xúc với môi trường nghiên cứu khoa học mà em từng mơ ước được một lần đến Cám ơn Quý Thầy đã

là điểm tựa và chấp cánh cho em để ngày càng được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cám ơn PGS.TS Lê Quang Hưng, TS Võ Thái Dân đã tận tình chỉ dẫn giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Con xin cám ơn Ba Mẹ, các Chị đã hết lòng thương yêu, đùm bọc, dìu dắt con trong cuộc đời Cám ơn các Anh Chị Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật đã giúp đỡ trong quá trình làm đề tài Em xin cám ơn thầy Phạm S, thầy Tuấn, chú Tới, chú Xuân Tùng, cô Toản, cô Hương, cô Lan, chị Hằng; anh Nam, Công, Hùng, Dũng, Tâm, Sơn; bạn Trang, Tâm, Công; em Thùy, Sương, Bá Nam, Tuấn, Thái, Dung, Chương, Nam, Diệu Hiền, Thanh, Hiền, Nhiên, Giáp, Hằng, Trực, Nhật, Tùng, Thưởng, Loan, Thương, Thu, Hương, Chiến, Nguyễn, Anh, Kha, My, Hà, Thái Hiền, Nhân, Quỳnh, Huy, Phúc Huy, Thuận, Vương đã giúp đỡ trong quá trình làm đề tài Con xin cám ơn gia đình bác Hai, gia đình chú Yên đã thương yêu, đùm bọc trong thời gian làm đề tài

TÓM TẮT

Đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống cây dâu tây (Fragaria spp.) sạch

virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) bằng phương pháp nuôi cấy mô” được thực hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng của Viện Sinh học Tây Nguyên, Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường từ 10/2008 - 10/2009 Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy giống dâu tây Mỹ Hương có khả năng phát sinh chồi từ mô lá cao hơn so với giống

Mỹ Đá và dâu Pháp Môi trường thích hợp cho quá trình phát sinh chồi từ mô lá cây

dâu tây in vitro là môi trường MS được bổ sung 1 mg/l TDZ, 0,1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar Mô lá cây dâu tây in vitro thuộc giống Mỹ Hương được nuôi

cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l TDZ, 0,1 mg/l NAA, 30 g/l sucrose và 8 g/l agar có khả năng phát sinh chồi cao nhất Áp dụng kỹ thuật “Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn chồi” cho khả năng nhân chồi của cây dâu tây cao hơn so với

kỹ thuật “Để nguyên chồi” và kỹ thuật “Cắt lá của chồi” Giống dâu Mỹ Hương có khả năng nhân chồi cao hơn so với giống Mỹ Đá và dâu Pháp Chồi dâu tây thuộc giống Mỹ Hương được xử lý bằng kỹ thuật “Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn chồi” có khả năng nhân chồi cao nhất Môi trường ½ MS được bổ sung 30 g/l sucrose, 0,2 mg/l IBA, 0,75 g/l than hoạt tính và 8 g/l agar thích hợp nhất cho sự

sinh trưởng của cây dâu tây trong giai đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm so với

các nồng độ sucrose còn lại (0; 10; 20; 40 g/l) Cây dâu tây thuộc giống Mỹ Hương kết hợp với nuôi cấy trên môi trường ½ MS được bổ sung 30 g/l sucrose, 0,2 mg/l IBA, 0,75 g/l than hoạt tính và 8 g/l agar có khả năng sinh trưởng tốt nhất trong giai

đoạn in vitro và ở giai đoạn vườn ươm Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi

được trồng ra vườn ươm 45 ngày của ba giống dâu tây Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu Pháp bằng kỹ thuật RT-PCR Kết quả cho thấy tất cả các mẫu được kiểm tra đều không bị nhiễm virus SCV

SUMMARY

The thesis “Improving SCV-free strawberry (Fragaria spp.) propagation

protocol through tissue culture method”, was carried out at Department of Plant Molecular Biology and Plant Breeding, Tay Nguyen Institute of Biology; Department of Plant Bioteachnology, Research Institute for Biotechnology and Environment from 10/2008 to 10/2009 Experiments were arranged in Completely Randomized Design with three replications The shoot regeneration from leaf

tissues of in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars, namely My Da,

My Huong and Phap, depended on different genotypes and supplemented TDZ concentrations My Huong showed the highest regeneration rate among the three

strawberry cultivars The highest shoot regeneration rate from leaf tissues of in vitro

strawberry plantlets was noticed after leaf tissues had been cultivated on MS medium containing 1 mgl-1 TDZ, 0.1 mgl-1 NAA, 30 gl-1 sucrose and 8 gl-1 agar

“Leaves cutting and shoot tip wounding” treatment performed significantly higher shoot regeneration rate compared with “No cutting” and “Leaves cutting”

treatments By supplementing sucrose to growing medium, the growth of in vitro

strawberry plantlets were improved and the concentration of 30 gl-1 sucrose showed

the optimal growth for in vitro strawberry plantlets of three strawberry cultivars ½

MS medium supplemented with 30 gl-1 sucrose, 0.2 mgl-1 IBA, 0.75 gl-1 activated charcoal and 8 gl-1 agar was the most suitable for the development of in vitro

strawberry plantlets After 45 days in nethouse condition, strawberry plantlets of three strawberry cultivars, namely My Da, My Huong and Phap, were screened from SCV (Strawberry Crinkle Virus) by using RT-PCR technique and no virus was detected The results of this study confirm the potential of using tissue culture technique in virus-free strawberry propagation

MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa Trang chuẩn y i

LÝ LỊCH CÁ NHÂN ii

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

TÓM TẮT v

SUMMARY vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xiii

DANH SÁCH CÁC HÌNH xv

DANH SÁCH CÁC BẢNG xvii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ xx

1.ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục đích - mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích của đề tài 2

1.2.2 Mục tiêu của đề tài 3

1.2.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.3 Giới hạn của đề tài 3

1.3.1 Thời gian nghiên cứu 3

1.3.2 Địa điểm nghiên cứu 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Sơ lược về cây dâu tây 4

2.1.1 Phân loại khoa học của cây dâu tây 4

2.1.2 Nguồn gốc - phân bố của cây dâu tây 5

2.1.2.1 Nguồn gốc 5

2.1.2.2 Phân bố 5

2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây dâu tây 5

2.1.4 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây 6

2.1.5 Thành phần các chất có trong quả dâu tây 6

2.1.6 Công dụng của cây dâu tây 7

2.1.7 Điều kiện canh tác của cây dâu tây 7

2.1.7.1 Đất trồng 7

2.1.7.2 Khí hậu 7

2.1.8 Tình hình canh tác cây dâu tây 7

2.1.8.1 Trên thế giới 7

2.1.8.2 Ở Việt Nam 8

2.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật 13

2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật 13

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật 13

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 13

2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo 14

2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn 14

2.2.2.4 Nuôi cấy protoplast 14

2.2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn 14

2.2.3 Lợi ích của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 15

2.2.4 Các bước trong nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô 15

2.2.4.1 Chọn vật liệu và cấy 15

2.2.4.2 Nhân chồi 15

2.2.4.3 Tạo rễ từ chồi 16

2.2.4.4 Trồng cây cấy mô ra đất 16

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống bằng nuôi cấy mô 17

2.2.5.1 Sự lựa chọn mẫu cấy 17

2.2.5.2 Môi trường nuôi cấy 17

2.2.5.3 Điều kiện nuôi cấy 17

2.2.6 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật 18

2.2.6.1 Auxin 18

2.2.6.2 Cytokinin 19

2.3 Một số nghiên cứu nhân giống cây dâu tây bằng phương pháp nuôi cấy mô 20

2.3.1 Trên thế giới 20

2.3.2 Ở Việt Nam 21

2.4 Các kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hại thực vật 23

2.4.1 Kỹ thuật chẩn đoán dựa vào triệu chứng 23

2.4.2 Kỹ thuật chẩn đoán bằng cây chỉ thị 24

2.4.3 Kỹ thuật chẩn đoán bằng kính hiển vi 24

2.4.3.1 Chẩn đoán bằng kính hiển vi quang học 24

2.4.3.2 Chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử 24

2.4.4 Kỹ thuật chẩn đoán bằng phản ứng huyết thanh 24

2.4.5 Kỹ thuật chẩn đoán dựa vào nucleic acid 25

2.4.5.1 Kỹ thuật lai phân tử (Molecular hybridization) 25

2.4.5.2 Kỹ thuật PCR và RT-PCR 25

2.5 Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RT-PCR 25

2.5.1 Kỹ thuật PCR 25

2.5.2 Kỹ thuật RT-PCR 26

2.6 Sơ lược về virus SCV gây hại trên cây dâu tây 27

2.6.1 Phân loại 27

2.6.2 Nguồn gốc - phân bố 27

2.6.3 Hình dạng - kích thước 27

2.6.4 Genome 27

2.6.5 Protein 27

2.6.6 Phạm vi ký chủ 27

2.6.7 Phương thức lan truyền 27

2.6.8 Triệu chứng và tác hại của virus SCV trên cây dâu tây 28

2.6.8.1 Triệu chứng 28

2.6.8.2 Tác hại của virus SCV 28

2.6.9 Biện pháp quản lý virus SCV 28

2.6.10 Một số nghiên cứu về virus SCV 28

2.6.10.1 Trên thế giới 28

2.6.10.2 Ở Việt Nam 29

2.7 Một số thành tựu trong việc tạo cây sạch bệnh virus bằng phương pháp nuôi cấy mô 33

2.7.1 Trên thế giới 33

2.7.2 Ở Việt Nam 33

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

3.1 Thời gian nghiên cứu 34

3.2 Nội dung và địa điểm nghiên cứu 34

3.3 Vật liệu nghiên cứu 34

3.3.1 Giống cây dâu tây 34

3.3.2 Hóa chất 34

3.3.2.1 Hóa chất dùng trong nuôi cấy mô cây dâu tây 34

3.3.2.2 Hóa chất dùng trong kiểm tra virus 36

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ 37

3.3.3.1 Thiết bị 37

3.3.3.2 Dụng cụ 38

3.4 Phương pháp nghiên cứu 38

3.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro 38

3.4.1.1 Điều kiện thí nghiệm 38

3.4.1.2 Bố trí thí nghiệm 39

3.4.1.3 Phương pháp tiến hành 39

3 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi 40

3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro 41

3.4.2.1 Điều kiện thí nghiệm 42

3.4.2.2 Bố trí thí nghiệm 42

3.4.2.3 Phương pháp tiến hành 42

3.4.2.4 Chỉ tiêu theo dõi 43

3.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro 43

3.4.3.1 Điều kiện thí nghiệm 43

3.4.3.2 Bố trí thí nghiệm 44

3.4.3.3 Phương pháp tiến hành 44

3.4.3.4 Chỉ tiêu theo dõi 44

3.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong giai đoạn nuôi cấy in vitro sự lên sinh trưởng của cây dâu tây sau khi đượctrồng ra vườn ươm 45

3.4.4.1 Điều kiện thí nghiệm 45

3.4.4.2 Bố trí thí nghiệm 45

3.4.4.3 Phương pháp tiến hành 46

3 4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi 46

3.4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 47

3.4.5.1 Điều kiện thí nghiệm 47

3.4.5.2 Bố trí thí nghiệm 48

3.4.5.3 Phương pháp tiến hành 48

3.4.5.4 Chỉ tiêu theo dõi 54

3.5 Xử lý số liệu 54

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ kết hợp với NAA lên khả năng phát sinh chồi từ mô lá cây dâu tây in vitro 58

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên khả năng nhân chồi của cây dâu tây trong điều kiện in vitro 67

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên sự

sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro 76

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose trong giai đoạn nuôi cấy in vitro lên sự sinh trưởng của cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 83

4.5 Thí nghiệm 5: Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 91

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 97

5.1 Kết luận 97

5.2 Đề nghị 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO 99

Phụ lục 109

cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid

DNA: Deoxyribonucleic acid

DAS-ELISA: Direct double antibody sandwich ELISADEPC: Diethyl pyrocarbonate

dNTP: Deoxyribo nucleic acid triphosphate

EDTA: Disodium ethylenedia minetera acetate

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

IBA: Indole-3-butyric acid

LC: Leaves cutting (Cắt lá của chồi)

LC-STW: Leaves cutting and shoot tip wounding

(Cắt lá và tạo vết thương ở đỉnh ngọn chồi)

N: Negative (Đối chứng âm)

NT: Nghiệm thức

Po: Positive (Đối chứng dương)

RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reactionSCV: Strawberry Crinkle Virus

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Cây dâu tây (Fragaria spp.) 4

Hình 2.2 Hình dạng trái dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở

Đà Lạt 10

Hình 2.3 Hình dạng cây dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở

Đà Lạt 11

Hình 2.4 Một số vườn trồng cây dâu tây ở Đà Lạt 12

Hình 2.5 Nguyên tắc phản ứng RT-PCR 26

Hình 2.6 Hình dạng của Strawberry Crinkle Virus 29

Hình 2.7 Trình tự genome của Strawberry Crinkle Virus 29

Hình 2.8 Trình tự base của vùng bảo tồn mã hóa cho Large (L) protein 30

Hình 2.9 Rệp gây hại và lan truyền virus SCV trên cây dâu tây 31

Hình 2.10 Triệu chứng bệnh virus SCV trên cây dâu tây 31

Hình 2.11 Vườn cây dâu tây Mỹ Đá bị bệnh virus SCV ở Đà Lạt 32

Hình 2.12 Vườn cây dâu tây Mỹ Hương bị bệnh virus SCV ở Đà Lạt 32

Hình 3.1 Nguồn mẫu cây dâu tây in vitro sạch virus SCV 55

Hình 3.2 Một số hóa chất được dùng trong kiểm tra virus SCV 55

Hình 3.3 Một số thiết bị và dụng cụ được dùng trong kiểm tra virus 56

Hình 3.4 Kỹ thuật xếp túi nylon chứa môi trường 57

Hình 4.1 Cách đặt mô lá cây dâu tây in vitro trên môi trường nuôi cấy 65

Hình 4.2 Mô lá cây dâu tây được nuôi cấy trên môi trường có nồng độ TDZ

khác nhau kết hợp với NAA (0,1 mg/l) trong điều kiện in vitro 65

Hình 4.3 Chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày 66

Hình 4.4 Mẫu cấy cây dâu tây ứng với các kỹ thuật xử lý khác nhau 74

Hình 4.5 Mẫu cấy cây dâu tây 74

Hình 4.6 Chồi dâu tây Mỹ Hương được phát 74

Hình 4.7 Chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày trong điều kiện 75

Hình 4.8 Chồi dâu tây được cấy vào túi nylon chứa môi trường nuôi cấy 81

Hình 4.9 Các túi nylon chứa chồi dâu tây được bố trí lên kệ nuôi cấy 81

Hình 4.10 Cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày trên môi trường

½ MS với các nồng độ sucrose khác nhau 82

Hình 4.11 Giải phẫu mô lá cây dâu tây in vitro (xem dưới kính hiển vi điện tử 40X) 82

Hình 4.12 Hình dạng khí khổng của lá cây dâu tây in vitro Mỹ Hương

sau khi được nuôi cấy 45 ngày trên môi trường không có sucrose

(xem dưới kính hiển vi điện tử 40X) 89

Hình 4.13 Cây dâu tây cấy mô của ba giống dâu tây ứng với các nồng độ sucrose khác nhau trong giai đoạn nuôi cấy in vitro được trồng ra vườn ươm 89

Hình 4.14 Cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày 90

Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩn PCR trong kiểm tra virus SCV trên cây

dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày 92

Hình 4.16 Cây dâu tây Mỹ Hương được nuôi cấy trên môi trường có các nồng

độ sucrose khác nhau trong giai đoạn ra rễ in vitro sau khi được trồng

ra vườn ươm 45 ngày 93

Hình 4.17 Cây dâu tây được dùng để kiểm tra virus SCV 93

Hình 4.18 Lá cây dâu tây được dùng để ly trích RNA 93

Hình 4.19 Các bước thực hiện trong kiểm tra virus SCV bằng kỹ thuật RT-PCR 94 Hình 4.20 Cây dâu tây sạch virus SCV được tiếp tục chăm sóc ở vườn ươm 94

Hình 5.1 Quy trình nhân giống cây dâu tây sạch virus SCV bằng phương pháp nuôi cấy mô 96

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1 Thành phần các chất có trong quả dâu tây 6

Bảng 2.2 Năng suất và hiệu quả kinh tế của các giống cây dâu tây được trồng tại Đà Lạt 9

Bảng 2.3 Đặc điểm của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật 20

Bảng 3.1 Các nguyên tố đa lượng của môi trường MS 35

Bảng 3.2 Các nguyên tố vi lượng của môi trường MS 35

Bảng 3.3 Các vitamin của môi trường MS 35

Bảng 3.4 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 1 40

Bảng 3.5 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 2 43

Bảng 3.6 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 3 45

Bảng 3.7 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 4 47

Bảng 3.8 Thành phần hóa chất để thực hiện phản ứng PCR 52

Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 52

Bảng 3.10 Các nghiệm thức trong thí nghiệm 5 54

Bảng 4.1 Thời gian phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi, số chồi dâu tây in vitro

sau khi được phát sinh 45 ngày từ mô lá 58

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ lên thời gian phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi, số chồi dâu tây in vitro sau khi được phát sinh 45 ngày từ mô lá 59

Bảng 4.3 Chiều cao chồi, số lá, kích thước lá, trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của chồi dâu tây in vitro sau khi được phát sinh 45 ngày từ mô lá 61

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ lên chiều cao chồi, số lá, kích thước lá của chồi dâu tây in vitro sau khi được phát sinh 45 ngày từ mô lá 62

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ TDZ lên trọng lượng tươi,

trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô chồi dâu tây in vitro sau khi được

phát sinh 45 ngày từ mô lá 63

Bảng 4.6 Thời gian phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi và số chồi dâu tây sau khi

được phát sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro 67

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên thời gian

phát sinh chồi, tỷ lệ phát sinh chồi và số chồi dâu tây sau khi được phát

sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro 68

Bảng 4.8 Chiều cao, số lá, kích thước lá, trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ

lệ chất khô của chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45 ngày trong điều

kiện in vitro 69

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên chiều cao

chồi, số lá, kích thước lá của chồi dâu tây sau khi được phát sinh 45

ngày trong điều kiện in vitro 71

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của yếu tố giống và kỹ thuật xử lý mẫu cấy lên trọng

lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của chồi dâu tây sau khi

được phát sinh 45 ngày trong điều kiện in vitro 71

Bảng 4.11 Chiều cao cây, số lá, kích thước lá, số rễ và chiều dài rễ của cây dâu

tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày 76

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên chiều cao cây,

số lá, kích thước lá của cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45

ngày 77

Bảng 4.13 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên số rễ và chiều

dài rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày 78

Bảng 4.14 Trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây

in vitro sau khi được nuôi cấy 45 ngày 79

Bảng 4.15 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên trọng lượng tươi,

trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây in vitro sau khi được

nuôi cấy 45 ngày 80

Bảng 4.16 Tỷ lệ sống, chiều cao cây, số lá mới, kích thước lá, số rễ và chiều dài

rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày 84

Bảng 4.17 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên tỷ lệ sống, chiều

cao cây, số lá mới của cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn

ươm 45 ngày 85

Bảng 4.18 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên kích thước lá,

số rễ và chiều dài rễ của cây dâu tây in vitro sau khi được trồng ra vườn

ươm 45 ngày 85

Bảng 4.19 Trọng lượng tươi, trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây

in vitro sau khi được trồng ra vườn ươm 45 ngày 86

Bảng 4.20 Ảnh hưởng của yếu tố giống và nồng độ sucrose lên trọng lượng tươi,

trọng lượng khô và tỷ lệ chất khô của cây dâu tây in vitro sau khi được

trồng ra vườn ươm 45 ngày 86

Bảng 4.21 Tỷ lệ nhiễm virus SCV của cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn

ươm 45 ngày 92

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 2.1 Các nước sản xuất dâu tây đứng đầu thế giới năm 2007 8

Chương 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Cây dâu tây (Fragaria spp.) là loại cây ăn quả giàu dinh dưỡng Quả dâu tây

cung cấp nhiều loại chất khoáng như Ca, K, P, Mg, Fe và nhiều vitamin cần thiết cho cơ thể con người như vitamin A, vitamin B và vitamin C (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004) Trong quả dâu tây còn có chất fisetin, có tác dụng chống oxy hóa, giúp bảo

vệ tế bào khỏi bị lão hóa (Lê Kim Phụng, 2007) Quả dâu tây còn cung cấp ellagic acid, một chất có khả năng hạn chế được bệnh ung thư (Kjersti và ctv., 2007)

Ở Việt Nam, cây dâu tây được trồng chủ yếu ở Đà Lạt và đã trở thành loại cây

ăn quả đặc sản của vùng này Việc sản xuất cây dâu tây mang lại hiệu quả kinh tế cao và ổn định Hiệu quả kinh tế trong sản xuất cây dâu tây ở Đà Lạt có nơi đạt trên

50 triệu đồng/1.000 m2/năm (Nguyễn Thị Phúc, 2006)

Sản phẩm từ quả dâu tây rất đa dạng Ngoài việc được sử dụng ở dạng tươi, quả dâu tây còn được dùng làm rượu vang, mứt và các loại kem Do đó, nhu cầu tiêu thụ của quả dâu tây ngày càng được gia tăng

Việc trồng cây dâu tây còn gắn liền với công nghệ chế biến, góp phần giải quyết công ăn việc làm cho lao động tại địa phương Vì vậy, cây dâu tây được xếp vào danh sách những loại cây trồng được ưu tiên đầu tư theo hướng công nghệ cao

của tỉnh Lâm Đồng (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002)

Cây dâu tây thường được nhân giống truyền thống bằng cách tách thân bò và tách cây con từ thân chính Phương pháp nhân giống này cho hệ số nhân giống không cao, cây con dễ bị nhiễm một số bệnh từ cây mẹ, đặc biệt là bệnh virus Chính vì vậy, việc sản xuất cây con giống sạch virus là khâu cơ bản nhất của ngành trồng cây dâu tây (Trần Văn Minh, 1997)

Trong các loài virus gây hại trên cây dâu tây, virus SCV (Strawberry Crinkle

Virus) là loài virus gây hại nghiêm trọng nhất cho cây dâu tây Virus SCV được lan truyền nhanh qua các môi giới truyền bệnh (Maas, 1998) Theo kết quả nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và ctv (2008), virus SCV đã xuất hiện trên các vùng canh tác cây dâu tây ở Đà Lạt Do đó, nghiên cứu để nhân nhanh giống cây dâu tây sạch virus SCV, sinh trưởng tốt cung cấp cho các vùng canh tác cây dâu tây là vấn đề thiết thực và cấp bách

So với phương pháp nhân giống truyền thống, phương pháp nuôi cấy mô có những ưu điểm như tiềm năng sản xuất nhanh, sử dụng rất ít nguồn mẫu ban đầu, giúp tạo các dòng cây con đồng nhất, sạch bệnh thông qua chọn lọc nguồn mẫu sạch bệnh hay làm cho nguồn mẫu trở nên sạch bệnh (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Hiện nay, quy trình nhân giống cây dâu tây nói chung và cây dâu tây sạch virus nói riêng bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được nghiên cứu trên thế giới và

ở Việt Nam Tuy nhiên, các quy trình đã được xây dựng còn một số hạn chế như hệ

số nhân chồi thấp khi tái sinh chồi trực tiếp từ mô lá Một số nghiên cứu đã sử dụng TDZ kết hợp với 2,4-D (một phần của chất độc da cam) để cải thiện hệ số nhân chồi cây dâu tây Tỷ lệ sống của cây dâu tây ở vườn ươm thấp Một số nghiên cứu tạo cây dâu tây sạch bệnh virus, tuy nhiên, chưa có nghiên cứu kiểm tra sự nhiễm virus trên cây dâu tây sau khi trồng ra vườn ươm

Xuất phát từ tình hình trên, đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống cây dâu

tây (Fragaria spp.) sạch virus SCV (Strawberry Crinkle Virus) bằng phương pháp

nuôi cấy mô” được thực hiện

1.2 Mục đích - mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích của đề tài

Đề tài được thực hiện nhằm góp phần xây dựng quy trình nhân giống phù hợp cho các giống cây dâu tây đang được canh tác tại Đà Lạt, góp phần cung cấp giống cây dâu tây sạch bệnh virus SCV, sinh trưởng tốt cho các vùng canh tác cây dâu tây

Đề tài được thực hiện nhằm góp phần hoàn thiện nghiên cứu về nhân giống cây dâu tây sạch bệnh virus

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu về nhân giống, tạo giống sạch bệnh trên cây dâu tây cũng như những nghiên cứu về bệnh virus và nhân giống cây trồng sạch bệnh virus

1.2.2 Mục tiêu của đề tài

Tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy giúp nâng cao khả năng tạo chồi, nhân chồi và chất lượng cây dâu tây nuôi cấy mô

Tạo cây dâu tây giống sạch virus SCV, có khả năng sinh trưởng tốt sau khi được trồng ra vườn ươm

1.2.3 Yêu cầu của đề tài

Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc phát sinh chồi từ mô lá cây

dâu tây in vitro

Xác định kỹ thuật nhân chồi thích hợp cho cây dâu tây in vitro

Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng của cây dâu tây trong điều kiện in vitro và sau khi được trồng ra vườn ươm

Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây sau khi được trồng ra vườn ươm

1.3 Giới hạn của đề tài

1.3.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ 10/2008 - 10/2009

1.3.2 Địa điểm nghiên cứu

Nhân giống cây dâu tây thông qua nuôi cấy mô lá đối với ba giống cây dâu tây

Mỹ Đá, Mỹ Hương và dâu Pháp được hiện tại Phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng, vườn ươm của Viện Sinh học Tây Nguyên

Kiểm tra virus SCV trên cây dâu tây cấy mô sau khi được trồng ra vườn ươm bằng kỹ thuật RT-PCR, được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật của Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây dâu tây

2.1.1 Phân loại khoa học của cây dâu tây

Cây dâu tây có tên khoa học

Hình 2.1 Cây dâu tây

Hình 2.1 Cây dâu tây (Fragaria spp.)

Trên thế giới có khoảng 20 loài cây dâu tây Chìa khóa phân loại các loài cây dâu tây dựa vào số lượng nhiễm sắc thể Một số loài là lưỡng bội (2n = 14) Các loài khác là tứ bội (4n = 28), lục bội (6n = 42), bát bội (8n = 56), thập bội (10n = 70)

Lưỡng bội: Fragaria daltonniana, Fragaria iinumae, Fragaria nilgerrensi

Tứ bội: Fragaria moupinesis, Fragaria orientalis

Lục bội: Fragaria moschata

Bát bội và lai ghép: Fragaria x ananassa, Fragaria chiloensis, Fragaria iturupensis, Fragaria virginiana

Thập bội và lai ghép: Fragaria x Potentilla, Fragaria x vescana

(http://vi.wikipedia.org/wiki/D%C3%A2u_t%A2yây)

2.1.2 Nguồn gốc - phân bố của cây dâu tây

2.1.2.1 Nguồn gốc

Cây dâu tây có nguồn gốc từ Châu Mỹ và được các nhà làm vườn Châu Âu cho lai tạo vào thế kỷ XIIX tạo nên các giống cây dâu tây được trồng hiện nay

2.1.2.2 Phân bố

Trên thế giới, cây dâu tây phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm và cận nhiệt đới

Ở Việt Nam, cây dâu tây được du nhập từ Châu Âu và được trồng chủ yếu ở Đà Lạt Trước năm 1954, cây dâu tây được trồng thử nghiệm ở Tam Đảo và Sa Pa (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

2.1.3 Đặc tính thực vật học của cây dâu tây

Thân: cây dâu tây thuộc loại cây thân thảo, sống đa niên Thân ngắn với nhiều

lá mọc rất gần nhau Chồi nách được mọc từ nách lá, tùy vào điều kiện môi trường

và đặc tính ra hoa của từng giống, các chồi nách có thể phát triển thành thân nhánh, thân bò hoặc phát hoa

Lá: lá cây dâu tây có hình dạng, cấu trúc, độ dày và lượng lông tơ thay đổi tùy theo giống Hầu hết các giống cây dâu tây đều có lá kép với 3 lá chét, một số giống

có lá kép với 4 hoặc 5 lá chét Mép lá có răng cưa Cuống lá dài, cuống lá thường có màu trắng khi lá còn non và chuyển sang màu đỏ của đất khi lá già

Hoa: phát hoa phân chia thành nhiều nhánh, mỗi nhánh có một hoa Hoa có 5 cánh tràng mỏng, màu trắng, hơi tròn Hoa lưỡng tính, có 25 - 30 nhị và 50 - 500 nhụy Hầu hết các giống cây dâu tây đều tự thụ

Quả: quả cây dâu tây là một loại quả giả do đế hoa phình to, quả thật nằm ở bên ngoài quả giả Quả dâu tây có hình bầu dục Quả non có màu xanh lục, khi quả chín, quả có màu hồng hoặc màu đỏ tùy từng giống Quả dâu tây có mùi thơm, vị ngọt lẫn vị chua

Rễ: cây dâu tây có hệ thống rễ chùm, rễ dâu tây thường phát triển ở độ sâu cách mặt đất khoảng 30 cm (Maas, 1998)

2.1.4 Các phương pháp nhân giống cây dâu tây

Cây dâu tây được nhân giống bằng ngó, tách cây con từ cây mẹ, nuôi cấy mô

Nhân giống từ hạt cũng đã được các nhà di truyền giống thực hiện trong công tác

nghiên cứu giống trên cây dâu tây (Maas, 1998)

2.1.5 Thành phần các chất có trong quả dâu tây

Quả dâu tây là một loại quả chứa ít năng lượng, ít đường nhưng chứa nhiều

loại dinh dưỡng, nhiều vitamin C và một số amino acid cần thiết cho cơ thể con

người (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Thành phần các chất có trong quả dâu tây

(Đơn vị tính: Hàm lượng/100 g quả tươi)

Ngoài ra, trong quả dâu tây còn có chất fisetin, có tác dụng chống oxy hóa

rất hiệu quả, giúp bảo vệ tế bào khỏi bị lão hóa (Lê Kim Phụng, 2007) Chất folate

có trong quả dâu tây có tác dụng giảm nguy cơ mắc bệnh Alzheimer gây mất trí nhớ

và lẫn lộn thường gặp ở người lớn tuổi Chất folate giúp giảm lượng homocystein trong máu, nguyên nhân gây bệnh Alzheimer Chất pectin trong quả dâu tây có khả năng làm giảm lượng cholesterol trong máu, hạ huyết áp và giảm lượng calo do cơ thể hấp thu (http://netfile.vietnamnet.vn/vn/lamdep/3636/index.aspx.)

2.1.6 Công dụng của cây dâu tây

Toàn cây và quả dâu tây được dùng chữa cảm sốt, ho, họng sưng đau, viêm tuyến mang tai, sỏi tiết niệu và bệnh thiếu vitamin C Nước nấu từ lá cây dâu tây được dùng trị bệnh đường tiết niệu Quả dâu tây được dùng để ăn tươi, làm mứt, chế rượu hay làm xi rô, dùng làm kem, sữa tươi tiệt trùng và tạo hương thơm cho các loại bánh mứt (Nguyễn Thị Mỹ Hạnh, 2002 ; Đỗ Huy Bích và ctv., 2004)

Quả dâu tây tươi giúp làm trắng răng Mặt nạ làm từ quả dâu tây giúp tẩy tế bào chết và làm mềm da Cocktail được chế biến từ quả dâu tây có tác dụng trị mụn

và làm sáng da (Lan Anh, 2006)

2.1.7 Điều kiện canh tác của cây dâu tây

2.1.7.1 Đất trồng

Cây dâu tây thích hợp với loại đất thịt nhẹ, hàm lượng chất hữu cơ cao, đất ẩm

và thoát nước tốt Độ mùn cần thiết trên 4%, độ pH thích hợp từ 6 - 7

Cây dâu tây được canh tác nhiều nhất ở nước Mỹ với diện tích 57.802,51 hecta

và đạt sản lượng là 1.066.227 tấn (Biểu đồ 2.1) California là nơi canh tác cây dâu

tây đứng đầu nước Mỹ, với các giống cây dâu tây được canh tác bao gồm giống Camarosa, giống Diamante, giống Aromas và giống Selva

Năm 2007, diện tích trồng cây dâu tây ở Trung Quốc lên đến 70.600 hecta, tăng 25% so với năm 2006 Nguyên nhân chính là do ngành trồng cây dâu tây đem lại lợi nhuận lớn cho người sản xuất Hơn 95% sản lượng dâu tây tươi của Trung Quốc được sử dụng để chế biến thành các sản phẩm như sữa chua và dâu tây đông lạnh (http://www.vinanet.com.vn/EconomicDetail.aspx?NewsID=122240#Scene1).

Biểu đồ 2.1 Các nước sản xuất dâu tây đứng đầu thế giới năm 2007

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Strawberry#_note-1)

2.1.8.2 Ở Việt Nam

Ở Việt nam, cây dâu tây được trồng chủ yếu tại Đà Lạt Theo số liệu thống kê của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Lâm Đồng năm 2001, diện tích trồng cây dâu tây ở Đà Lạt là 50 hecta Hầu hết các nhà vườn ở Đà Lạt đều trồng giống dâu Pháp Tuy nhiên, giống dâu Pháp có nhược điểm là thịt và vỏ quả mềm,

dễ dập, nhanh biến màu và rất khó vận chuyển đi xa (Trịnh Thị Toản, 2005)

Do nhu cầu tiêu thụ dâu tây ngày càng tăng, trồng cây dâu tây đem lại lợi nhuận cao cho người sản xuất nên diện tích trồng cây dâu tây ở Đà Lạt cũng tăng

theo một cách đáng kể Diện tích trồng cây dâu tây năm 2006 ở Đà Lạt là 120 hecta Một số giống cây dâu tây được trồng ở Đà Lạt bao gồm giống Angelique (Mỹ Đá), giống FA (Mỹ Hương) và giống New Zealand (Bảng 2.2) Giống Mỹ Đá được trồng nhiều nhất vì có khả năng thích nghi cao, chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao, thịt trái cứng nên có thể được vận chuyển đi xa (Hình 2.2, Hình 2.3, Hình 2.4) (Nguyễn Thị Phúc, 2006)

Theo Vương Thành (2007), vụ Đông năm 2006, cây dâu tây được đưa vào trồng thử nghiệm tại Hưng Yên với diện tích 1.800 m2 Các giống cây dâu tây được trồng thử nghiệm gồm 5 giống nhập nội (3 giống Nhật Bản, 1 giống Mỹ và 1 giống Tây Ban Nha) Các giống cây dâu tây mới này cho quả to (20 - 40 g/quả), màu sắc đẹp, ngọt và thơm Hiệu quả kinh tế của mô hình trồng thử nghiệm đạt 400 triệu đồng/hecta/năm Cây dâu tây mang lại hiệu quả kinh tế cao, nhu cầu thị trường của cây dâu tây rất lớn nên cây dâu tây sẽ là loại cây trồng lý tưởng trong vụ Đông - Xuân ở các tỉnh phía Bắc, đặc biệt là Đồng bằng sông Hồng

Bảng 2.2 Năng suất và hiệu quả kinh tế của các giống cây dâu tây được trồng tại Đà

Lạt

STT Giống Năng suất thu hoạch

(kg/1.000 m 2 /năm)

Lợi nhuận (VNĐ/1.000 m 2 /năm)

3.524,55 3.291,43 2.548,00

50.552.950 59.479.465 55.944.900 (Nguồn: Nguyễn Thị Phúc, 2006)

Hình 2.2 Hình dạng trái dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở Đà Lạt

(a: Dâu Pháp; b: Dâu Newzealand; c: Dâu Mỹ Đá; d: Dâu Mỹ Hương)

Hình 2.3 Hình dạng cây dâu tây của một số giống dâu đang được trồng ở Đà Lạt

(a: Dâu Pháp; b: Dâu Newzealand; c: Dâu Mỹ Đá; d: Dâu Mỹ Hương)

Hình 2.4 Một số vườn trồng cây dâu tây ở Đà Lạt

(a: Dâu Pháp; b: Dâu Newzealand; c: Dâu Mỹ Đá; d: Dâu Mỹ Hương)

b

d

c

a

2.2 Sơ lược về nuôi cấy mô thực vật

2.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật

Nuôi cấy mô được Haberlandt thử nghiệm đầu tiên vào năm 1902 Ông đã

nuôi cấy các tế bào được tách từ lá của một số cây một lá mầm như Erythonium, Orithogalum và Tradescantia nhưng đều không thành công

Năm 1934, White đã thành công trong nghiên cứu nuôi cấy đầu rễ của cây cà

chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose

và nước chiết nấm men

Trong thời gian từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn

đã được phát triển Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một

huyền phù của các tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulguris)

Năm 1960, Cooking đã thành công khi dùng cellulase phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật và đã thu được các tế bào tròn, không có vỏ, được gọi là protoplast

Từ năm 1960 đến năm 1964, Morel đã thành công trong nhân giống cây lan

(Cymbidium) thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nozeran đã ứng dụng nuôi cấy

mô trong việc làm trẻ hóa trên cây nho, cây khoai tây Kể từ đó, nuôi cấy mô được ứng dụng trên quy mô thương mại ở nhiều cây trồng có giá trị kinh tế như chuối, cây ăn quả có múi và đã có những đóng góp to lớn cho ngành nông nghiệp thế giới Ngày nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống và nhân giống Đồng thời nuôi cấy mô thực vật cũng được ứng dụng trong việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và trong nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao (Trần Văn Minh, 1997)

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật

2.2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian được nuôi cấy trên môi trường thích hợp sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Sau đó, chồi tiếp tục vươn thân, ra lá và rễ, trở thành cây hoàn chỉnh

2.2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là khối tế bào phát triển vô tổ chức, được hình thành khi đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được nuôi cấy trên môi trường giàu auxin Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có các chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây

mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Tuy nhiên, mức độ biến dị của tế bào soma cao hơn so với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẻ, được gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với các cơ chất thích hợp được bổ sung vào trong môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học

Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng, tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từng cụm mô sẹo Khi môi trường thạch có tỷ lệ giữa cytokinin và auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.2.2.4 Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng của tế bào Protoplast có thể được tách trực tiếp từ các

bộ phận của thực vật bằng cơ học (nghiền mẫu + enzym) hay từ tế bào sẵn có Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh

2.2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn

Hạt phấn của thực vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh có số nhiễm sắc thể 1n gọi là cây đơn bội (Trần Văn Minh, 1997)

2.2.3 Lợi ích của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô

Nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô giúp tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ, tạo một số lượng cây con lớn từ một nguồn mẫu trong một thời gian ngắn Ngoài ra, nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô còn giúp tạo ra các cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh (Bùi Bá Bổng, 1995)

2.2.4 Các bước trong nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô

2.2.4.1 Chọn vật liệu và cấy

Theo Nguyễn Văn Uyển (1993), không có hướng dẫn cụ thể trong việc chọn

mô cấy Về nguyên tắc, trừ những mô đã hóa gỗ, các mô khác trong cơ thể thực vật đều có thể được dùng làm mô cấy Các mô đang phát triển mạnh (mô phân sinh ngọn, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non, lá non, cuống hoa và mô phân sinh đốt) khi được cấy vào môi trường thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo Để bắt đầu

nghiên cứu nhân giống in vitro, chồi nách và mô phân sinh ngọn thường được sử

dụng

Các loại củ, căn hành cũng có thể được chọn để nuôi cấy nhưng cần được xử

lý nhiệt độ hoặc chu kỳ sáng để phá miêng trạng của củ và căn hành trước khi tách các mầm để nuôi cấy (Bùi Bá Bổng, 1995)

mất ảnh hưởng ưu thế ngọn, các mầm có thể phát triển thành chồi Trong nuôi cấy

mô, khi cấy đỉnh chồi vào môi trường có chứa chất cytokinin ở nồng độ thích hợp, các mầm bên của đỉnh chồi sẽ phát triển thành chồi Khi cấy mắt lóng (đoạn thân có mang mầm) cũng cho kết quả tương tự

Tạo chồi từ mô sẹo

Khi mô thực vật được cấy vào môi trường chứa nhiều chất điều hòa sinh trường thuộc nhóm auxin đặc biệt là 2,4 D, các tế bào sẽ phân chia và tạo thành một khối gọi là mô sẹo (callus) Khi chuyển sang môi trường chứa chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin, không chứa hoặc chứa ít auxin, các mô sẹo sẽ biệt hóa tạo thành cây Sự biệt hóa này có thể xảy ra bằng sự thành lập chồi trực tiếp hoặc tạo thành phôi vô tính hay còn gọi phôi soma

2.2.4.3 Tạo rễ từ chồi

Các chồi bất định và chồi bên phát triển từ môi trường nuôi cấy chứa cytokinin thường không có rễ Do đó, để tạo cây hoàn chỉnh, các chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ có thành phần chất điều hòa sinh trưởng khác với môi trường tạo chồi (thường chứa auxin hay không chứa chất điều hòa sinh trưởng)

2.2.4.4 Trồng cây cấy mô ra đất

Cây cấy mô (cây in vitro) được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và ẩm độ Do đó, khi cây in vitro được chuyển ra đất với

điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau bị héo

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp và ẩm độ cao Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp và giữ được ẩm

Trong 10 - 15 ngày đầu, cây con nên được duy trì ở ẩm độ cao bằng cách tưới phun sương cho luống ươm cây Sau 4 - 5 tuần, cây con có thể được đưa ra trồng ở điều kiện thông thường (Bùi Bá Bổng, 1995)

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng trong nhân giống bằng nuôi cấy mô

2.2.5.1 Sự lựa chọn mẫu cấy

Các mô non như chồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định có khả năng tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây Chồi hoa non hay cụm hoa non cũng thường có khả năng tái sinh rất tốt (Dương Công Kiên, 2002) Tình trạng sinh lý của cây có thể ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy nên việc lấy mẫu thường được tiến hành trong giai đoạn cây đang phát triển mạnh (Bùi Bá Bổng, 1995)

2.2.5.2 Môi trường nuôi cấy

Các thành phần cơ bản trong môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng vô cơ, nguồn carbon, vitamin và các chất điều hòa sinh trưởng Một số chất khác cũng được bổ sung như các acid hữu cơ và các dịch chiết

Hiện có nhiều môi trường cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Trong đó, môi trường MS của Murashige và Skoog (1962) được dùng phổ biến nhất

vì thích hợp cho phần lớn các trường hợp nuôi cấy in vitro (Trần Văn Minh, 1997)

Trạng thái môi trường có ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy Do đó, sự lựa chọn môi trường bán rắn hay lỏng là rất cần thiết Môi trường bán rắn giúp đỡ cây, cho phép sự thoáng khí nhưng có thể làm giảm sự tiếp xúc của cây mầm để hấp thu dinh dưỡng (Dương Công Kiên, 2002)

2.2.5.3 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng

Sự phân phối phổ ánh sáng, quang kỳ và hướng chiếu sáng đóng vai trò quan

trọng trong quá trình sinh trưởng của thực vật trong nuôi cấy in vitro Cường độ ánh

sáng bên cạnh khả năng điều hòa kích thước lá và thân còn ảnh hưởng đến sự hình

thành sắc tố và hiện tượng thủy tinh thể ở cây con in vitro Chất lượng ánh sáng có

ảnh hưởng đến sự kéo dài đốt thân, sự hình thành chồi bất định trong một số trường

hợp nuôi cấy in vitro (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Ánh sáng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô hiện nay là ánh sáng trắng (phổ ánh sáng khoảng từ 400 nm đến 700 nm) của đèn huỳnh quang Theo Bùi Bá Bổng (1995), cường độ ánh sáng trong giai đoạn nuôi cấy ban đầu và nhân chồi tiếp

theo thích hợp trong khoảng 1.000 - 5.000 lux Thời gian chiếu sáng thường là 16 giờ sáng/8 giờ tối Trong giai đoạn tạo rễ, cường độ ánh sáng có thể lên cao 3.000 -

10.000 lux giúp kích thích cây con in vitro chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp, qua đó giúp tăng tỷ lệ sống của cây con in vitro khi

chuyển ra trồng ngoài đất

Nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro

Nhiệt độ nuôi cấy được xác định thường dựa vào nguồn gốc của từng loại cây trồng Bên cạnh đó, trên cùng một loại cây trồng, nếu nuôi cấy các bộ phận khác nhau thì nhiệt độ yêu cầu cũng khác nhau Nhiệt độ thích hợp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là 20 - 27oC (Trần Văn Minh, 1997)

Nhiệt độ cũng đóng một vai trò quan trọng cho việc tạo cây giống sạch bệnh

virus trong nhân giống in vitro Xử lý nhiệt ở 35 - 40oC trong vài ngày hoặc vài tháng có thể loại trừ virus trên nhiều loại cây trồng để thu nhận nguồn vật liệu sạch virus Việc xử lý nhiệt thường được thực hiện trước khi tách đỉnh sinh trưởng để loại trừ virus trong trường hợp không thể loại trừ bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Reinert và Bajaj, 1977)

2.2.6 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant hormones, phytohormones) là những chất được tổng hợp bởi thực vật, có khả năng điều hòa các tiến trình sinh lý của thực vật ở nồng độ thấp Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật được chia thành 5 nhóm chính: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylene (Bảng 2.3) (Kumar và Purohit, 1997)

2.2.6.1 Auxin

Auxin là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật Trong cây auxin được tổng hợp chủ yếu ở chồi ngọn, lá ngọn và được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau để kích thích sự sinh trưởng của tế bào (Trịnh Xuân Vũ và ctv., 1976) Bên cạnh các auxin tự nhiên như indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA) còn có các auxin nhân tạo do con người tổng hợp bằng phương

pháp hóa học như 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)

Vai trò của auxin trong nuôi cấy mô được nghiên cứu bởi Skoog và Miller vào

năm 1957 Khi nghiên cứu về nuôi cấy mô trên cây thuốc lá (Nicotiana rustica),

Skoog và Miller đã phát hiện sự hình thành chồi xảy ra trong môi trường nuôi cấy

có nồng độ cytokinin cao và nồng độ auxin thấp, ngược lại, sự hình thành rễ xảy ra khi trong môi trường nuôi cấy có nồng độ cytokinin thấp và nồng độ auxin cao Ngày này, vai trò của auxin trong nuôi cấy mô đã được nghiên cứu khá đầy

đủ Chất 2,4-D có hiệu quả cao trong việc hình thành mô sẹo hay phát sinh phôi soma nhưng lại hạn chế trong việc hình thành rễ bất định Ngược lại, chất IAA hay IBA cho hiệu quả thấp trong việc tạo mô sẹo và phôi soma nhưng có hoạt tính rất

mạnh trong việc hình thành rễ bất định cho cây con in vitro (Klerk, 2003)

2.2.6.2 Cytokinin

Cytokinin là một nhóm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào Trong cây, cytokinin được tổng hợp chủ yếu ở mô phân sinh đỉnh rễ Ngoài ra, cytokinin còn có nhiều trong các bộ phận khác của cây như trong hạt đang lớn và quả đang phát triển (Trịnh Xuân Vũ và ctv., 1976)

Chất có hoạt tính cytokinin đầu tiên được Skoog và Miller tách từ chế phẩm

mẫu DNA của tinh dịch cá trích (Clupea), một sản phẩm biến tính của DNA, có tác dụng phát động và duy trì sự phân bào của mô cây thuốc lá (Nicotiana rustica) và

được đặt tên là kinetin (Kin) Sau đó, Letham (1963) tách từ hạt ngô non một chất

có hoạt tính cytokinin và được đặt tên là zeatin, xuất phát từ tên la tinh của cây ngô

là Zea mays (Nguyễn Như Khanh và Cao Phi Bằng trích dẫn, 2006)

Ngoài tác dụng hoạt hóa sự phân chia tế bào, cytokinin còn có tác dụng kích thích việc tạo mầm của mô sẹo, sự sinh trưởng của chồi bên, phát sinh chồi bất định Vì vậy, cytokinin thường được sử dụng để điều tiết sự sinh trưởng và phát

sinh hình thái của các mô trong nhân giống in vitro

Một số cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô như kinetin (Kin), 6-bezylaminopurine (BA) và thidiazuron (TDZ) (Klerk, 2003)