Xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (chrysanthemum maxximum seiun 3) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trư

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến ThS La Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận

Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập cũng như hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Tươi

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do ThS La Việt

Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Tươi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng 26 Bảng 2.2 Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi ở cúc CN01 27 Bảng 2.3 Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ  - NAA đến khả năng hình thành rễ của chồi cúc CN01 28 Bảng 2.4 Các công thức thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các giá thể

dinh dưỡng đến tỉ lệ sống của cây in vitro ngoài tự nhiên 28

Bảng 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng của cây cúc CN01 31Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi cúc CN01 Số mẫu cấy 36Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ  - NAA đến số lượng và chiều dài rễ cúc CN01 38Bảng 3.4 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chrysanthemum maximum Seiun - 3 8

Hình 2.1 Chồi đỉnh cây hoa cúc CN01 24

Hình 3.1 Mẫu cúc bị nhiễm khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy 33

Hình 3.2 Mẫu cúc bị mốc sau 5 ngày nuôi cấy 33

Hình 3.3 Mẫu cúc sạch nhưng chết sau 5 ngày nuôi cấy 33

Hình 3.4 Mẫu cúc vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy 33

Hình 3.5 Sơ đồ quy trình tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây cúc CN01 34

Hình 3.6 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi cúc CN01 37

Hình 3.7 Hình ảnh ra rễ của cúc CN01 40

Hình 3.8 Rèn luyện cây con ngoài môi trường tự nhiên 41

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trưởng của cây cúc CN01 32Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đế hệ số nhân chồi cúc CN01 36 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ  - NAA đến số lượng và chiều dài

rễ cúc CN01 39

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu 2

2.1 Mục đích nghiên cứu 2

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây hoa cúc 3

1.1.1 Nguồn gốc cây hoa cúc 3

1.1.2 Vị trí phân loại 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây hoa cúc 4

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật học 4

1.1.3.2 Sinh thái cây hoa cúc 5

1.2 Giá trị kinh tế của cây hoa cúc 7

1.3 Đặc điểm cây hoa cúc CN0l 7

1.4 Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam 8

1.4.1 Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới 8

1.4.2 Tình hình sản xuất và thương mại hoa cúc ở Việt Nam 9

1.5 Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào 10

1.5.1 Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới 10

1.5.2 Tình hình nghiên cứu về cây hoa cúc ở Việt Nam 11

1.6 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong công tác nhân giống 13

1.6.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào 13

1.6.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật 13

1.6.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật 13

1.6.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào 13

1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

1.7.1 Vật liệu nuôi cấy 14

1.7.2 Môi trường nuôi cấy 15

1.7.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 19

1.8 Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro 19

1.9 Ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong sản xuất 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu thực vật 24

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 24

2.3.1 Thiết bị 24

2.3.2 Dụng cụ 25

2.4 Môi trường nuôi cấy 25

2.5 Điều kiện nuôi cấy 25

2.6 Phương pháp nghiên cứu 25

2.6.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 25

2.6.2 Phương pháp xử lí số liệu 29

3.1 Tạo vật liệu in vitro 30

3.2 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh và tạo đa chồi cúc CN01 34

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ  - NAA đến quá trình hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh của chồi cúc CN01 37

3.4 Ảnh hưởng của các giá thể dinh dưỡng đến tỉ lệ sống của cây in vitro

ngoài tự nhiên 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một trong những loài hoa được nhiều

người ưa chuộng và phổ biến nhất ở Việt Nam

Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, đời sống vật chất cũng như trình độ thẩm mỹ của con người được nâng cao, nhu cầu thưởng thức cái đẹp cũng được coi trọng Do đó, nhu cầu về hoa trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng cũng không ngừng tăng lên Hoa tươi trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trong thị trường sản phẩm hàng hóa nông nghiệp thế giới Trong đó, hoa cúc là một trong những loại hoa được ưa chuộng và phổ biến nhất Hoa cúc không chỉ hấp dẫn người tiêu dùng về màu sắc, hình dáng và mùi thơm kín đáo mà còn thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi đặc trưng rất bền, một đặc tính mà không phải bất kỳ loài hoa nào cũng có Với các ưu thế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và phát triển

Trong số các giống cúc hiện nay, cúc CN01 (Chrysanthemum maximum

Seiun - 3) là giống có năng suất cao, các đặc điểm về chất lượng hoa lại phù hợp với nhu cầu xuất khẩu nên hiện đang trồng phổ biến Tuy nhiên, cúc CN01 lại được trồng chính vào mùa vụ mà thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh nhiều, việc nhân giống bằng phương pháp giâm cành vẫn còn gặp nhiều khó khăn

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, kỹ thuật nhân giống vô

tính bằng phương pháp nuôi cấy in vitro tỏ ra rất hiệu quả, cung cấp số lượng

lớn cây giống sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và đồng nhất

về mặt di truyền, đáp ứng được nhu cầu cho thực tiễn sản xuất Do đó, tôi đã

lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng quy trình nhân giống

cây hoa cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro”

2 Mục đích và nhiệm vụ nghiên cứu

2.1 Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc CN01 để góp phần

đáp ứng thực tiễn sản xuất hoa cúc hiện nay

2.2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo vật liệu in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi cúc CN01

- Nghiên cứu ảnh hưởng của  - NAA đến khả năng tạo rễ để tạo cây in

vitro hoàn chỉnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây con sau giai đoạn nuôi cấy

3 Ý nghĩa lí luận và ý nghĩa thực tiễn

- Cung cấp tư liệu khoa học cho nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa cúc CN01

- Đưa ra quy trình nuôi cấy mô cây hoa cúc CN01 phục vụ cho việc nhân giống đáp ứng nhu cầu sản xuất trên thị trường

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây hoa cúc

1.1.1 Nguồn gốc cây hoa cúc

Hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một loại hoa có nguồn gốc từ Trung

Quốc và Nhật Bản Các nhà khảo cổ học Trung Quốc đã chứng minh được rằng, từ đời Khổng Tử người ta đã làm lễ “thắng lợi hoa vàng” (hoa cúc) và cây hoa cúc đã đi vào các tác phẩm hội họa từ thời gian này Một thành phố

cổ xưa của Trung Quốc đã đặt tên là Ju - Xian, có nghĩa là: “Thành phố hoa cúc” Cây hoa cúc được sử dụng chính trong các lễ hội và đã được giới thiệu tới Nhật Bản khoảng thế kỉ thứ VIII Tới thế kỉ thứ XVII, hoa cúc được mang tới Châu Âu Ngày nay, cúc được trồng rộng rãi trên thế giới như: Hà Lan, Đức, Pháp, Nhật Bản, Nga, Mỹ, Singapore, Isaren…4 12 Ở Việt Nam đến đầu thế kỉ XIX, hoa cúc đã được trồng thành các vùng chuyên canh Hiện nay,

Đà Lạt có diện tích trồng hoa cúc lên tới 5000 ha; Hà Nội đã hình thành các vùng trồng chuyên canh như xã Tây Tựu (Từ Liêm) diện tích xấp xỉ 200 ha, quận Tây Hồ diện tích 70 ha, đảm bảo cung cấp hoa cho người tiêu dùng 12

Họ cúc Asteraceae là một trong những họ lớn nhất của Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), thực vật hạt kín (Angniospermatophyta) 29 Qua hai hội

thảo quốc tế về họ Asteraceae năm 1967 và 1994 mang tên “Sinh học và hóa

học của họ cúc” đã có sự thống nhất tương đối về hệ thống học của họ

Asteraceae Họ cúc trên thế giới xếp trong 2 phân họ, 13 tông 22, Việt Nam

có 2 phân họ và 12 tông, nhưng hiện tại chia làm 17 tông Họ cúc có khoảng

1550 chi với 23000 loài 115 29

Tuy nhiên, có nhiều tài liệu khác nhau về số liệu loài hoa cúc Theo GS.TS Khoa học Nguyễn Nghĩa Thìn thì họ cúc có 2500 loài và có 1100 chi

15 Theo Trần Lan Hương và cộng sự, hoa cúc có hơn 3000 loài với kích thước, màu sắc khác nhau 4 Nghiên cứu của Anderson (1987), Langton (1989) cho biết trên thế giới có hơn 7000 giống cúc đã đưa vào sử dụng với

sự đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc 1823

1.1.3 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây hoa cúc

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật học

- Rễ

Cúc thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang phân bố ở tầng đất mặt từ 5 - 20 cm, số lượng rễ lớn nên có khả năng hút nước và dinh dưỡng mạnh

- Thân

Cúc là cây thân thảo có nhiều đốt giòn, dễ gãy nên khi cây lớn phải làm giàn để đỡ cây khỏi đổ

- Lá

Thường là lá đơn, mỗi giống cúc có đặc điểm khác nhau như hình dạng

lá xẻ thùy nông hay sâu, phiến lá dày hay mỏng và màu sắc là khác nhau

- Hoa

Hoa cúc chủ yếu có 2 dạng: hoa lưỡng tính và hoa đơn tính

Hoa cúc chính gồm nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa Tùy theo mục đích sử dụng mà có thể để một bông hay nhiều bông trên cành

Tùy theo cách sắp xếp cánh hoa, người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp/bông) và hoa đơn (chỉ có một vòng hoa/bông) Hiện nay, người ta sử dụng loại hoa kép là chủ yếu Hoa kép nhiều hơn hoa đơn và thường mọc nhiều hoa trên một cành phát sinh từ nách lá Hoa có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, đỏ, tím, xanh, Những cánh hoa ở phía ngoài thường có màu sắc đậm hơn, xếp thành nhiều tầng, chặt hay lỏng tùy theo từng giống Cánh có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn đều, có loại dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong

Đường kính bông hoa phụ thuộc vào giống:

+ Giống hoa to: đường kính 10 - 12 cm (Pha Lê, Đại Đóa,…)

+ Giống hoa trung bình: đường kính 5 - 7 cm (Thọ đỏ, Đỏ nhung,…) + Giống hoa nhỏ: đường kính 1 - 2 cm (chi trắng, chi vàng,…)

- Quả

Cây hoa cúc có dạng quả bế khô, hình trụ hơi dẹt chỉ chứa một hạt Hạt

có phôi thẳng và không có nội nhũ

1.1.3.2 Sinh thái cây hoa cúc

Theo Nguyễn Xuân Linh và cộng sự, về cơ bản cây hoa cúc có một số yêu cầu về ngoại cảnh như sau 9:

- Nhiệt độ

Cây hoa cúc có nguồn gốc ôn đới, nên ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển từ 15 - 200

C, cúc có thể chịu được nhiệt

độ từ 10 - 350C, nhưng nhiệt độ trên 350C và dưới 100C sẽ làm cho cúc sinh trưởng và phát triển kém Ở thời kì cây con, cúc cần nhiệt độ cao hơn Đặc biệt trong thời kì ra hoa, đảm bảo cho cúc nhiệt độ cần thiết thì hoa sẽ to và

đẹp Ban ngày, cây cần nhiệt độ cao để quang hợp, còn ban đêm nếu nhiệt độ

cao sẽ thúc đẩy quá trình hô hấp làm tiêu hao chất dự trữ trong cây

- Ánh sáng

Ánh sáng có sự ảnh hưởng rất lớn đến sự ra hoa và phân hóa mầm hoa của cây hoa cúc Tuy nhiên, ở mỗi thời kỳ sinh trưởng và phát triển cây có yêu cầu ánh sáng khác nhau:

+ Thời kỳ cây con: khi mới ra rễ cây cần ít ánh sáng vì lúc này cây non còn sử dụng các chất dinh dưỡng dự trữ

+ Thời kỳ chuẩn bị phân cành: cây cần nhiều ánh sáng để quang hợp tạo các chất hữu cơ cần thiết cho hoạt động sống của cây

Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn, thời kỳ để phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng/ngày với nhiệt độ là 20 - 250

C Thời gian chiếu sáng kéo dài thì thời gian sinh trưởng của cây hoa cúc dài hơn, thân cao, lá to, chất lượng hoa tăng Thời gian chiếu sáng ngắn thì sẽ kích thích phân hóa mầm hoa sớm, cây ngắn, chất lượng hoa kém 12

- Ẩm độ

Độ ẩm thích hợp nhất cho cây sinh trưởng phát triển là độ ẩm đất 60 - 70%, độ ẩm không khí 60 - 65% Nếu độ ẩm trên dưới 80% thì cây sinh trưởng mạnh, nhưng dễ phát sinh sâu bệnh làm ảnh hưởng năng suất, chất lượng hoa 12

- Đất và dinh dưỡng

+ Đất: có vai trò cung cấp nước, dinh dưỡng cho sự sống của cây Cây hoa cúc có bộ rễ ăn nông do vậy yêu cầu đất cao ráo, thoát nước, tơi xốp + Các chất dinh dưỡng: các loại phân hữu cơ (phân chuồng, phân vi sinh, than bùn), phân vô cơ (đạm, lân, kali) và các loại phân trung, vi lượng (Mg,

Zn, Cu, Fe, Mn, Bo…) có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng của hoa cúc

1.2 Giá trị kinh tế của cây hoa cúc

Cúc là một loại hoa đẹp thường được dùng trong các ngày lễ, tết, cưới xin và được sử dụng với nhiều cách như: trồng đại trà để cắt hoa cắm bình, trồng trong bồn, trang trí trong nhà, trong vườn hoa và công viên 12 30 Sản xuất và kinh doanh hoa cúc đã đem lại cho người trồng hoa nhiều lợi nhuận Trên mỗi sào (Bắc Bộ) đất trồng trọt với mật độ trung bình 50 cây/m2

, người trồng có thể thu được từ 5 - 6 triệu đồng (tính giá trung bình 300 đ/bông); chi phí cho làm đất, chăm sóc, giống và các vật tư khác thì hết l,8 - 2 triệu đồng Trong khi đó trồng cây lúa thì thu nhập chỉ đạt 350.000 - 400.000 đ/sào 3 10 Ngoài ra, nếu hoa được dùng xuất khẩu thì lợi nhuận còn lớn hơn nhiều

Hiện nay, với sự thành công của các biện pháp kỹ thuật như kéo dài tuổi thọ của hoa, điều khiển hoa ra theo ý muốn, trồng hoa trái vụ hoặc cho nở vào các dịp lễ tết đã làm cho giá trị của hoa được tăng lên rất nhiều lần

Riêng với chi Chrysanthemum sp., có cúc Đại Đóa với nhiều loài, hoa có

màu sắc khác nhau: vàng, trắng, đỏ tía, tím Bông lớn, dáng đẹp, hoa nở nhiều vào dịp tết Nhưng gần đây một số loài trồng gần như quanh năm, phục vụ nhu cầu trang trí vào những ngày lễ

Một số loài khác của chi Chrysanthemum sp như cúc vàng hay kim cúc (C indicum L.) có bông nhỏ hơn, dùng để pha chè, ngâm rượu, trồng làm cảnh; cúc trắng hay bạch cúc (C morfolium ramat) dùng để pha chè, ngâm rượu hoặc làm thuốc chữa nhức đầu, đau mắt; rau cải cúc (C coronarium L.)

thường trồng làm rau ăn 16

1.3 Đặc điểm cây hoa cúc CN0l

Giống cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun - 3) là giống cúc đơn

10 Đây là giống nhập nội của Nhật Bản, được cung cấp từ Trung tâm

Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp tháng

3 năm 2001

Giống có đặc điểm cây cao 70 - 75 cm, thân mập cứng, lá dài xanh bóng,

bộ lá gọn, khả năng phân cành ít nên có thể

trồng dày 45 - 50 cây/m2

Hoa kép to, cánh ngắn, cứng, xếp chặt, có màu vàng cam 10

Thời gian sinh trưởng từ 85 - 95 ngày, độ

bền hoa cắt từ 10 - l2 ngày, được trồng chính

vào các vụ xuân hè, hè thu và thu sớm

Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ

Phòng Nông nghiệp các tỉnh phía Bắc, năm

2003, diện tích trồng cúc CN01 đã lên đến

6,3 ha; riêng Hà Nội có 4,9 ha 3

1.4 Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới và Việt Nam

1.4.1 Tình hình sản xuất và thương mại cây hoa cúc trên thế giới

Tuy cây hoa cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhưng đến năm 1688, Jacob Layn (Hà Lan) mới trồng phát triển mang tính thương mại ở đất nước này và đến tận thế kỉ XX nó mới có ý nghĩa thương mại trên thế giới Những năm

1961 – 1970, cúc được trồng rất nhiều và là cây hoa quan trọng ở Trung Quốc, Nhật Bản; quan trọng đứng thứ hai sau hoa hồng ở Hà Lan Hằng năm, kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc trên thị trường thế giới ước đạt tới 1,5

trên thế giới với tổng diện tích trồng cúc chiếm tới 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Bốn nước sản xuất chính là Hà Lan 800 triệu cành cúc mỗi năm, Colombia 600 triệu cành cúc mỗi năm, tiếp theo là Ý 500 triệu cành và Mỹ

300 triệu cành 12

1.4.2 Tình hình sản xuất và thương mại hoa cúc ở Việt Nam

Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng 3500

ha, tập trung chủ yếu ở các vùng trồng hoa như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, chủ yếu là các giống cúc nhập nội Riêng Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh hằng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục vụ cho nhu cầu trong nước

Ở Hải Phòng, cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoa tươi Cùng với Layơn, cúc là một mặt hàng xuất khẩu tiềm năng trong những năm tới

Ở các tỉnh phía Nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn nhất Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển

Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam đã tăng lên đáng kể Tuy nhiên, lượng hoa sản xuất ra thực sự còn rất hạn chế so với nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà cây hoa cúc có thể mang lại nếu được đầu tư phát triển

Hiện nay ở Việt Nam, việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằng phương pháp vô tính gồm hai biện pháp:

- Nhân giống bằng giâm cành: chọn cành bánh tẻ, to khoẻ, không sâu bệnh làm cành giâm Cành giâm có chiều dài 6 - 8 cm, có 3 - 4 lá, sau khi giâm phải che nắng, che mưa, giữ ẩm 70% - 80%

- Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro: là phương pháp được dùng phổ biến

hiện nay ở các nước trồng cúc bởi cây cúc dễ nhân giống trong ống nghiệm,

hệ số nhân giống cao, giá thành hạ, cây con sạch bệnh Đặc biệt, phương pháp

này có thể duy trì và nhân giống quanh năm, không phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh Từ các mô, các cơ quan khác nhau qua nuôi cấy người ta có thể tạo ra những cây hoàn chỉnh, hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền

1.5 Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào

Do giá trị kinh tế cũng như giá trị sử dụng của cây hoa rất cao mà trên thế giới có rất nhiều nước đi sâu nghiên cứu kỹ thuật trồng hoa, kỹ thuật nhân

và tạo giống hoa mới

1.5.1 Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới

Năm l974, Asjes và cộng sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sử dụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô Ông đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúc sạch bệnh

Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiện

thành công bởi Fukai, Goi và Tanaka (1991) [19] Các tác giả đã nghiên cứu phương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi cao nhất Kết quả thí nghiệm cho thấy, bảo quản chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2 ngày trong điều kiện lạnh dần cứ 0,20C/phút đến -400

C với 10% dimethyl sufoide và 3% glucose cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới 100%

Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận khác của cây hoa cúc để nuôi cấy như đoạn thân, mẫu lá, cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn các mẫu lá Cùng năm đó Lu, Nugent và Wardley [25] đã thành công trong việc tái sinh cây trực tiếp từ những đoạn

thân của hoa cúc Chrysanthemum morifolium Ramat trên môi trường cơ bản

MS có bổ sung 0,2 - 0,5 mg/l BAP và 0,2 - 2 mg/l NAA, tỷ lệ tạo chồi cao nhất là 100% Đối với những đoạn thân của cây đã thành thục, khả năng phát

sinh chồi cao hơn Người ta còn có thể nhân giống hoa cúc bằng cách tái sinh callus từ các mẫu cấy thân và lá Ngoài ra, việc sử dụng cánh hoa, quả để làm nguyên liệu nuôi cấy tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu

Cho đến nay, việc sử dụng chồi đỉnh và chồi nách để làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô vẫn là biện pháp phổ biến nhất bởi vì sử dụng chồi đỉnh và chồi nách dễ thành công, ít nhiễm bệnh, có hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng các bộ khác của cây hoa cúc để nuôi cấy Sử dụng phương pháp này, cho phép tạo một số lượng lớn cây con giống sạch bệnh và đồng nhất về mặt

di truyền trong thời gian ngắn, hoàn toàn đáp ứng được cho sản xuất ở quy

mô công nghiệp

Để hoàn thiện quá trình nuôi cấy mô hoa cúc, các nhà nghiên cứu đã đi sâu tìm hiểu ảnh hưởng của một số điều kiện và yếu tố môi trường trong

nhân nhanh in vitro như ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, điều kiện ánh

sáng Bên cạnh đó, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhân

giống là giai đoạn đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng Đây là

bước quyết định hiệu quả của toàn bộ quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất Roberts và Smith (1990) [28] đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệm cellulose sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng, làm giảm thiệt hại trong quá trình đưa cây ra ngoài

1.5.2 Tình hình nghiên cứu về cây hoa cúc ở Việt Nam

Ở Việt Nam, mặc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâu nhưng sự hiểu biết cũng như kết quả nghiên cứu về cây hoa này còn chưa nhiều Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu thường tập trung chủ yếu vào việc tập hợp các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống

Từ năm l992, Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện

Di truyền Nông nghiệp kết hợp với Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro Tiến hành thu thập, khảo sát và đánh giá một

số giống cúc mới, kết quả là từ 2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93 và CN98 đã được Hội đồng khoa học Bộ Nông nghiệp cho phép khu vực hóa, đến tháng 4/1996 và 9/2000 lần lượt hai giống cúc CN93 và CN98 đã được công nhận là giống cúc quốc gia

Năm 1988, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự [14] đã xây dựng hoàn

chỉnh quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang được trồng phổ biến ở miền Bắc nước ta như cúc CN93, vàng Đài Loan, đỏ

Hà Lan

Theo Nguyễn Quang Thạch và các cộng sự (1998) [14] để nâng cao tỷ lệ sống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sử dụng IBA hoặc  - NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cành khoảng 0,5 - 1 cm vào dung dịch thuốc từ 3 - 5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát Điều tra về sâu bệnh hại trên cây hoa cúc, các tác giả của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa - Cây cảnh, Viện Di truyền Nông nghiệp đã đề xuất các biện pháp phòng trừ và xác định trên cúc có 9 loại bệnh hại bao gồm

7 bệnh hại do nấm, 1 bệnh do vi khuẩn và 1 bệnh vàng lá do sinh lý Những bệnh do nấm gây ra bao gồm đốm lá, phấn trắng, đốm nâu, gỉ sắt, đốm vòng, héo ngọn, lở cổ rễ và héo vi khuẩn Trong đó, gây thiệt hại đáng kể nhất là bệnh đốm lá có thể dùng Score 250ND, bệnh phấn trắng dùng Daconil 75WP, bệnh đốm vòng, đốm nâu có thể dùng Zineb 80WD hoặc Boocdo 1% để phòng trừ Về sâu hại chủ yếu 1à sâu xanh, sâu khoang có thể dùng Pegasus 500SC Các côn trùng khác như rệp muội, nhện dùng Oncol 20EC hoặc Karate 2,5EC Để phòng trừ có hiệu quả cao cần kết hợp với các biện pháp canh tác, diệt bỏ các tàn dư gây bệnh, sử dụng nguồn giống khoẻ mạnh và sạch bệnh

1.6 Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trong công tác nhân giống

1.6.1 Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các hoocmon và các cơ quan thực vật ban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểm sinh học giống hệt nhau

1.6.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.6.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1902, Haberlandt (Đức) [21] là người đầu tiên đề xướng học thuyết

về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời” Theo ông: “Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh Vì vậy, khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể” Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan, bộ phận của cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với

cây mẹ

1.6.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào

Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bào chuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau

Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôi sinh để thực hiện chức năng phân chia

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật

1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.7.1 Vật liệu nuôi cấy

Cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khả năng phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp Do vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầm non, các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần,

Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài, có loài dễ tái sinh từ

mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá, có loài rất khó như hoa đồng tiền, trầm hương, Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của

mô cũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết quả khác nhau 5 6 Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ

cây in vitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi

cấy có nguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính Nhìn chung, tất cả các bộ phận như thân, lá, rễ, cuống lá, đều có thể sử dụng để nuôi cấy, nhưng các cơ quan này do có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã các thông tin di truyền trong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây, là cũng rất khác nhau

Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giống nhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng như mức độ ổn định về mặt di truyền của mô cấy Do đó, tuỳ từng đối tượng, từng loại mô và mục đích sử dụng mà người ta nuôi cấy mô có kích thước khác nhau cho phù hợp

1.7.2 Môi trường nuôi cấy

Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng Vì vậy, để cho mô tồn tại và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải tạo ra được môi trường có đủ các chất dinh dưỡng mà cây cần thiết Thành phần hoá học của môi trường dinh dưỡng gồm chủ yếu là muối khoáng, nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng, Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: môi trường Murashige và Skoog (l962) 27 viết tắt là

MS, môi trường Linsmainer và Skoog (1965) [24], môi trường Gamborg (1968) [20]… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải biến ra nhiều loại môi trường khác nhau cho phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm Trong số đó, môi trường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số loài thực vật 6

Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy cũng như mục đích nuôi cấy Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:

- Các nguyên tố đa lượng (muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lưu

huỳnh): là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các

cơ quan tử trong cơ thể thực vật

- Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban,

molipden, bo, iot) Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa, ngoài ra chúng còn là thành phần của enzym, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong cơ thể Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhưng lại xốp, mọng nước và tái sinh kém , molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật 2

- Nguồn cabon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có

khả năng quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượng cho các quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào Đường sucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ 2 - 3% Đường có thể bị caramen hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin, một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào 6

- Các vitamin: mô và các tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin

nhưng không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là: thiamin (B1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxi hóa khử dehydrogenase xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin (B6) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô,

có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của mô nuôi cấy, vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp tế bào 2

- Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết muối,

dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein,… cũng được

sử dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc

đẩy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng trưởng của mô 17

- Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ

một số tảo thuộc ngành tảo đỏ Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể nâng đỡ cây Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử

dụng thay đổi từ 0,8 - 1,0% Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuếch tán cũng như hấp thụ dinh dưỡng của mô, tế bào Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên Agar có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể

có những tác động sinh lí trên mô thực vật Ngoài agar, một số hợp chất khác cũng đã được thử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như Gerlit (là một polysaccarit tinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas 17

- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: phytohoocmon là thành

phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy Nhờ những chất này mà

các nhà nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in

vitro Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử

dụng rộng rãi là auxin và xytokynin:

 Auxin là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế

bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành

rễ 2 Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA,  - NAA, 2,4 - D có hiệu quả sinh lý

ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thường gây nên các đột biến 17 2,4 - D thường được sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA,  - NAA thường được sử dụng trong việc phát sinh rễ 6

 Xytokynin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên

quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy Các xytokynin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA, zeatin giúp tạo số lượng chồi nhiều nhưng có kích thước nhỏ 6, có thể gây ra hiện tượng mọng nước (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ) Theo Skoog và Miller, tỷ lệ auxin/xytokynin cao thường có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo

dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự phát triển chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ được hình thành 17

Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhóm phytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit) Gibberelin điển hình là GA3 có tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trưởng của cây, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của cây,… Nhưng so với auxin và xytokynin thì nhóm GA rất ít được sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực

vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA3 được đưa vào môi trường trong những trường hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật 17

- pH của môi trường là một yếu tố quan trọng Sự ổn định pH của môi

trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào Ngoài ra sự bền vững

và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH pH môi trường thường ở 5,5 - 5,8 trước khi khử trùng

13 Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và tổng hợp của tế bào Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy 11 Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 - 5,9 Vì hầu hết trong môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 - 4,5 trong vòng 24 - 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào.Tuy nhiên, giá trị pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 - 5,5 do có liên quan đến sự hấp thụ nitrate

1.7.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao

đổi chất trong mô nuôi cấy, ảnh hưởng đến sự phát triển của từng tế bào riêng

lẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy Nhiệt độ thích hợp sẽ ảnh hưởng tích cực đến quá trình sinh trưởng của đa số các loại thực vật nuôi cấy Nhiệt độ rất thấp còn được sử dụng làm chậm hay ngừng sinh trưởng hẳn của

mầm nuôi cấy nhằm mục đích bảo quản giống ở điều kiện in vitro Trong thực

tế, nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định 250

C  10C, điều này là do nhiệt độ thật của các mô nuôi cấy trong bình nuôi cấy có thể cao hơn 2 - 40C so với nhiệt độ của phòng Thông thường, người ta điều chỉnh nhiệt độ phòng nuôi cấy trung bình Các loại cây sống ở vùng ôn đới thường quen với nhiệt độ thấp hơn là cây nhiệt đới, chính vì vậy mà người ta sẽ có lợi hơn khi có những phòng nuôi cấy có nhiệt độ 200

C  10C dành cho cây nhiệt đới 6

- Ánh sáng: bao gồm cường độ, thời gian và chất lượng ánh sáng Khi

chuẩn bị cho cây con ra ngoài vườn ươm nếu gia tăng cường độ ánh sáng thì

sẽ “tăng sức” cho cây con 6 Trong thực tế ở phần lớn các phòng thí nghiệm thời gian chiếu sáng 16 - 18 giờ/ngày được coi là tốt nhất cho nuôi cấy mô

6 Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hoocmon nội sinh Các kết quả này cùng với các kết quả nghiên cứu khác cho thấy quá trình phát sinh hình thái của thực vật được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: chất phytochrom và các chất khác 6

1.8 Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro

 Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình

nhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được nguyên liệu