Xây dựng quy trình real time rtpcr phát hiện và phân type tác nhân gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo (prrsv)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN … oOo…… LÊ THÙY DUYÊN XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL TIME RT-PCR PHÁT HIỆN VÀ PHÂN TYPE TÁC NHÂN GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN TRÊN HEO (PRRSV) CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN Mã số chuyên ngành: 60 42 70 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG TP.HỒ CHÍ MINH - NĂM 2011 LỜI CẢM ƠN Luận văn đạt kết ngày hôm nhờ quan tâm, tận tình hư ớng dẫn nhiều thầy cô bạn bè thuộc Khoa Sinh họcTrường Đại học Khoa học Tự Nhiên Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng kính trọng chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cô tạo điều kiện mặt giúp tơi hồn thành tốt luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn anh Nguyễn Tuấn Anh, anh chị thuộc công ty TNHH Công Nghệ Sinh Học Khoa Thương luôn tận tình giúp đỡ, gợi ý hướng tiếp cận đề tài cho Xin cảm ơn anh chị công tác Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học-Sở Khoa học công nghệ Đồng Nai Công ty Thuốc Thú y Trung Ương Navetco nhiệt tình giúp đ ỡ việc cung cấp mẫu cho tơi hồn thành luận văn Tôi xin cảm ơn bạn tơi tơi chia sẻ khó khăn, quan tâm, giúp đỡ, động viên suốt thời gian qua Và cuối xin cảm ơn ba, mẹ, người thân yêu anh Mọi người chỗ dựa tinh thần, nguồn động viên to lớn cho tơi vượt qua khó khăn Tp HCM, tháng 11 năm 2011 Lê Thùy Duyên Luận văn Thạc sĩ Lời mở đầu LỜI MỞ ĐẦU Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) xuất lần Mỹ vào năm 1987 Đến PRRS lây lan khắp giới, trở thành dịch địa phương nhiều nước có ngành chăn ni phát triển, có Việt Nam [21] Đây hội chứng bệnh liên quan đến heo, PRRSV (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) gây ra, có khả lây nhiễm cao Heo bị nhiễm PRRSV dễ bị sảy thai, giảm tỉ lệ sinh sản, sinh non thai chết lưu Ngoài heo bị bệnh PRRS dễ mắc bệnh kế phát viêm phổi, tiêu chảy, thương hàn…dẫn đến tử vong [20] Dịch heo tai xanh lần xuất Việt Nam vào tháng năm 2007 Và năm 2011, năm có dịch bệnh xảy ra, gây tâm lý hoang mang cho người dân Theo cục Thú y, năm 2010, qua hai đợt dịch bệnh nước có 1.114.166 heo mắc bệnh, số heo tiêu hủy 438.699 [7] Bên cạnh đó, thịt heo vốn sản phẩm chăn nuôi quan trọng nước ta, chiếm 58% tổng GDP nơng nghiệp [21] Do đó, kiểm sốt dịch bệnh heo tai xanh trở thành nhiệm vụ quan trọng ngành chăn nuôi nước ta Một nhiệm vụ quan trọng việc kiểm soát dịch PRRS xây dựng công cụ phát phân type PRRSV xác nhanh chóng Do đó, mục tiêu luận văn đề xây dựng quy trình Real time RT- PCR có khả đồng thời phát phân type virus PRRSV với nội dung sau: 1) Thiết kế mồi mẫu dị bắt cặp đặt hiệu, có khả đồng thời phát phân type PRRSV 2) Tối ưu hóa phản ứng Real time RT-PCR 3) Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình Lê Thùy Duyên Luận văn Thạc sĩ Lời mở đầu 4) So sánh hiệu quy trình phát PRRSV với kit thương mại mẫu heo nuôi Sự thành công đề tài tiền đề cho phát triển kit chẩn đốn Real time RT-PCR có khả đồng thời phát phân type heo mang mầm bệnh PRRSV, cho kết nhanh, xác, góp phần phát kịp thời đàn heo bị nhiễm bệnh, giảm thiệt hại đàn heo, giảm chi phí xét nghiệm Ngoài ứng dụng phân type PRRSV tiền đề phục vụ cho nghiên cứu đặc tính gây đáp ứng miễn dịch khác type PRRSV, góp phần theo dõi lưu hành type PRRSV, lựa chọn vaccine phịng ngừa thích hợp cho dịch bệnh PRRS nước ta Lê Thùy Duyên Luận văn Thạc sĩ Mục lục MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số thông tin hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (PRRS) 1.2 Triệu chứng bệnh 1.3 Tác nhân gây bệnh 1.4 Cấu trúc gene PRRSV 1.5 Cơ chế gây bệnh PRRSV 10 1.6 Một số đặc tính PRRSV 11 1.7 Vaccine phòng ngừa 12 1.8 Các phương pháp phát PRRSV 13 1.8.1 Dựa biểu lâm sàng : 13 1.8.2 Phân lập virus (VI): 14 1.8.3 Huyết học: 14 1.8.4 RT-PCR ( Reverse transcription- polymerase chain reaction ): 15 Lê Thùy Duyên i Luận văn Thạc sĩ Mục lục 1.8.5 Real-time RT-PCR: 15 1.9 Phương pháp Real-time RT-PCR 16 1.10 Tình hình nghiên cứu phương pháp phát PRRSV Việt Nam 20 CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 22 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 23 2.2 Vật liệu 23 2.2.1 Mẫu sử dụng nghiên cứu 23 2.2.2 Các cặp mồi mẫu dò sử dụng đề tài 23 2.2.3 Hóa chất 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Phương pháp tách chiết RNA Phenol-Chloroform 29 2.3.2 Phương pháp tách chiết RNA theo Boom [10], [18],[26] 30 2.3.3 Phương pháp reverse transcriptase (RT) 31 2.3.4 Phương pháp thiết kế cặp mồi mẫu dò đặc hiệu cho PRRSV 32 2.3.4.1 Đánh giá hiệu hoạt động mồi mẫu dò phát phân type PRRSV 34 2.3.4.2 Đánh giá hiệu hoạt động mồi mẫu dò chứng nội 35 2.3.5 Phản ứng multiplex Real time RT-PCR: 35 2.3.6 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR 35 2.3.7 Xác định ngưỡng phát đặc hiệu phản ứng 36 2.3.8 So sánh hiệu phát phân type với kit thương mại 37 2.3.9 Các bước chuẩn bị cho việc tạo kit chẩn đốn hồn chỉnh 37 Lê Thùy Duyên ii Luận văn Thạc sĩ Mục lục 2.3.9.1 So sánh hiệu tách chiết RNA phương pháp PhenolChlorofom 37 2.3.9.2 Phương pháp tạo dòng gene làm chứng dương 38 2.1.2 Phương pháp phân tích kết giải trình tự Blast (Basic local alignment search tool): 42 CHƯƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 44 3.1 Thiết kế mồi mẫu dò đặc hiệu cho phát phân type PRRSV 45 3.1.1 Thiết kế mồi mẫu dò Taqman 45 3.1.2 Đánh giá khả hoạt động mồi PR4 mồi PR6 46 3.1.3 Đánh giá hiệu hoạt động ba mồi/mẫu dò chứng nội 51 3.2 Phản ứng Multiplex Real time RT-PCR 53 3.3 Tối ưu hóa phản ứng Multiplex Real time RT-PCR 54 3.3.1 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nhiệt độ lai 55 3.3.2 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ MgCl2 56 3.3.3 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ mồi PR6 57 3.3.4 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: mẫu dò PR6-P1 58 3.3.5 Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: Taq DNA polymerase 59 3.4 Xác định ngưỡng phát đặc hiệu quy trình 60 3.4.1 Ngưỡng phát quy trình 60 3.4.2 Sự đặc hiệu phản ứng vi sinh vật khác 61 3.4.3 Đánh giá khả phát phân type phản ứng multiplex Real Time RT-PCR mẫu có diện đồng thời PRRSV type NA PRRSV type EU 63 Lê Thùy Duyên iii Luận văn Thạc sĩ Mục lục 3.5 So sánh hiệu phát phân type PRRSV với kit thương mại 65 3.6 Các bước chuẩn bị khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đốn hồn chỉnh 66 3.6.1 So sánh hiệu tách chiết RNA phương pháp tủa PhenolChloroform phương pháp Boom 66 3.6.2 Tạo dòng gene làm chứng dương 68 CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 73 4.1 KẾT LUẬN 74 4.2 ĐỀ NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC 84 Lê Thùy Duyên iv Luận văn Thạc sĩ Chương Tổng quan tài liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Lê Thùy Duyên Luận văn Thạc sĩ Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Một số thông tin hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (PRRS) Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome-PRRS) mô tả lần Mỹ vùng bắc bang California, bang Iowa Minnesota vào năm 1987 Rất nhanh sau đó, năm 1988 bệnh lây sang Canada Ở Châu Âu nhiều vùng ghi nh ận dịch bệnh Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992) Năm 1998, bệnh phát nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản [39] Từ năm 2006 đến năm 2010, khu vực nước Châu Á Trung Quốc, Việt Nam, Philippines Thái Lan, Lào, Campuchia liên tiếp bị đợt dịch PRRS hoành hành với chủng PRRSV độc lực cao [22] Cho đến PRRS đ tr thành dịch ã bệnh lưu hành nhiều châu lục giới, bệnh gây tổn thất nặng nề kinh tế cho ngành chăn ni nhiều quốc gia Hình 1.1 cho thấy tình hình dịch bệnh PRRS khu vực Châu Á báo cáo Tồ chức Thú y Thế giới (OIE) vào năm 2007 Thời gian đầu, chưa xác định nguyên nhân gây bệnh nên bệnh PRRS có nhiều tên gọi bệnh bí ẩn heo (Mistery Disease of Swine-MDS), hội chứng hô hấp sẩy thai heo (Porcine endemic abortion and respiratory syndrome – PEARS), Việt Nam PRRS thường gọi bệnh heo tai xanh (Blue Ear Disease-BED) [16] Năm 1992, Hội nghị quốc tế hội chứng tổ chức Minnesota (Mỹ), tổ chức Thú y giới (OIE) th ống tên gọi Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo Lê Thùy Duyên Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận 1000 bp 500 bp 100 bp Hình 11: Kết điện di sản phẩm PCR từ vi khuẩn virus Ghi chú: - Giếng 1: thang kích thước DNA kp - Giếng 2: sản phẩm PCR từ E coli có kích thước 113 bp - Giếng 3: sản phẩm PCR từ Salmonella spp có kích thước 570 bp - Giếng 4: sản phẩm PCR từ Clostridium perfringenes có kích thước 327 bp - Giếng 5: sản phẩm PCR từ TGEV có kích thước168 bp - Giếng 6: sản phẩm PCR từ PEDV có kích thước 651 bp - Giếng 7: sản phẩm PCR từ Porcine Rotavirus có kích thước 356 bp 3.4.3 Đánh giá khả phát phân type phản ứng multiplex Real Time RT-PCR mẫu có diện đồng thời PRRSV type NA PRRSV type EU Do việc sử dụng đồng thời nguồn vaccine nhược độc có nguồn gốc từ PRRSV type EU PRRSV type NA, nên có khả nước ta lưu hành đồng thời hai type PRRSV Chính có tỉ lệ nhỏ trường hợp đồng nhiễm hai type mẫu heo nuôi Trường hợp báo cáo cơng trình Li V.Y.Y et al (Hội nghị quốc tế PRRS năm 2006) Cơng trình Nguyễn Ngọc Hải cộng (2011) đánh giá tình Lê Thùy Duyên 63 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận trạng nhiễm PRRSV đàn heo sinh sản thành phố Hồ Chí Minh ghi nhận 6/20 mẫu thực địa có đồng nhiễm hai type PRRSV [1] Việc đồng nhiễm hai type PRRSV dẫn đến nguy tái tổ hợp hai type PRRSV [30] Do đó, chúng tơi tiến hành kiểm tra xem phản ứng Multiplex Real Time RT-PCR mà chúng tơi xây dựng có khả phát diện hai type PRRSV mẫu hay không? Đầu tiên tiến hành tạo mẫu đồng nhiễm: (1) mẫu ES1 có nồng độ virus NA cao virus EU thấp (2) mẫu ES2 có nồng độ virus NA thấp virus EU cao Sau tiến hành phản ứng Real time RT-PCR đối chiếu mẫu đồng nhiễm với mẫu đơn nhiễm chứa lượng virus tương đương Kết trình bày bảng 3.9: Bảng 9: Giá trị Ct mẫu đồng nhiễm đơn nhiễm PRRSV Tên mẫu Giá trị Ct EU NA ES1 35,22 28,52 38,02/30,10 27,84 38,54 ES2 28,57/37,64 Nhận xét: Kết bảng 3.9 cho thấy quy trình chúng tơi có khả phát mẫu chứa vật liệu di truyền hai type PRRSV So sánh giá trị Ct mẫu đồng nhiễm mẫu đơn nhiễm cho thấy mẫu đồng nhiễm có gia tăng giá trị từ 1-3 Ct (giảm độ nhạy) chứng tỏ có cạnh tranh mồi mẫu dò Kết đánh giá tương tự chứng minh cơng trình Egli C et al (2001) Như vậy, qua thí nghiệm chúng tơi kết luận phản ứng multiplex Real Time RT-PCR mà chúng tơi xây dựng phát phân type mẫu huyết đơn nhiễm đồng nhiễm hai type PRRSV Lê Thùy Duyên 64 Luận văn Thạc sĩ 3.5 Chương Kết quả-Biện luận So sánh hiệu phát phân type PRRSV với kit thương mại Để kiểm tra khả phát phân type PRRSV quy trình Multiplex Real time RT-PCR mà xây dựng mẫu heo nuôi thực địa, tiến hành so sánh quy trình với kit Real time thương mại (kit PRRSV Real time RT-PCR Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd, Trung Quốc) 20 mẫu thực địa kiểm tra kháng thể ELISA (kit Herdchek*PRRS 2XR IDEXX) công ty Thuốc Thú y Trung Ương-Navetco Kết trình bày bảng 3.10 Nhận xét: Kết bảng 3.10 cho thấy quy trình Real time RT-PCR cho kết tương đồng 20/20 mẫu heo với Kit PRRSV Real Time RT-PCR Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd Trong 20 mẫu heo kiểm tra, có mẫu âm tính, mẫu dương tính PRRSV type EU 13 mẫu dương tính với PRRSV type NA Riêng Kit Herdchek*PRRS 2XR IDEXX phát kháng thể PRRSV theo nguyên tắc ELISA, quy trình cho kết đồng 16/20 mẫu heo mẫu cho kết không trùng khớp mẫu 5, 6, 10 16 Trong trường hợp mẫu heo âm tính với kháng thể PRRSV (mẫu 6) dương tính với hai quy trình Real Time RT-PCR, nguyên nhân không đồng độ nhạy kit Herdchek*PRRS 2XR Trường hợp ngược lại, mẫu heo dương tính với kháng thể PRRSV âm tính với hai quy trình Real Time RT-PCR, nguyên nhân kháng thể PRRSV mẫu heo ni có nguồn gốc từ vaccine nhược độc Như vậy, qua kết so sánh với hai kit thương mại, chúng tơi kết luận quy trình multiplex Real Time RT-PCR chúng tơi có khả đưa vào ứng dụng thực tiễn việc phát phân type PRRSV, góp phần phát sớm đàn heo mang mầm bệnh đồng thời góp phần theo dõi dịch tễ đàn heo Lê Thùy Duyên 65 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận Bảng 10 Kết so sánh hiệu phát quy trình Số thứ Tên mẫu PRRSV Real Time Quy trình Real time 2XR RT-PCR (Shanghai RT-PCR phát ZJ Biotech Co., Ltd) tự Herdchek*PRRS phân type PRRSV + + (NA) + (NA) - + (NA) + (NA) - + (NA) + (NA) + +(NA) + (NA) 10 + - - 11 + + (NA) + (NA) 12 + + (NA) + (NA) 13 + + (NA) + (NA) 14 + + (NA) + (NA) 10 15 + + (NA) + (NA) 11 16 + - - 12 17 + + (NA) + (NA) 13 18 + + (NA) + (NA) 14 19 + + (NA) + (NA) 15 20 + + (NA) + (NA) 16 S5 - - - 17 S7 - - - 18 S8 - - - 19 S10 - - - 20 3.6 41 + (EU) + (EU) Các bước chuẩn bị khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đốn hồn chỉnh 3.6.1 So sánh hiệu tách chiết RNA phương pháp tủa PhenolChloroform phương pháp Boom Nhằm tìm kiếm phương pháp tách chiết khác để ứng dụng nhiều điều kiện khác nhau, thích hợp với nhu cầu khác nhau, chúng tơi xây dựng qui trình tách chiết RNA theo nguyên tắc Boom R (1990) [10] Lê Thùy Duyên 66 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận so sánh với phương pháp tách chiết tủa Phenol-Chloroform truyền thống Thí nghiệm tiến hành cách tách chiết song song lặp lại mẫu VR2332 (ATCC) pha lỗng bậc 10 huyết âm tính PRRSV (1) mẫu thực địa (2) thu từ trại heo đồng nai Các thành phần phản ứng multiplex real-time PCR có nồng độ chọn phần tối ưu hóa phản ứng chương trình chạy tương tự với nhiệt độ lai tối ưu chọn 57oC Kết trình bày bảng 3.11 Bảng 11 Bảng so sánh hiệu tách chiết RNA Phenol-Chloroform Boom Mẫu (TCID50/0,2 Phenol- ml) Boom Chloroform NA 26,36 26,32 IC7 33,31 32,58 NA 29,27 30,54 IC7 32,10 33,90 NA 31,82 32,07 IC7 32,27 33,29 Mẫu thực địa âm NA N/A N/A tính PRRSV IC7 34,21 35,12 Mẫu thực địa dương NA 25,11 24,32 IC7 35,46 36,27 NA 27,14 26,68 IC7 34,68 34,39 VR2332 102,75 VR2332 101,75 VR2332 100,75 tính với PRRSV (mẫu 1) Mẫu thực địa dương tính với PRRSV (mẫu 2) Nhận xét Dựa vào giá trị Ct so sánh hai phương pháp tách chiết mẫu chứng mẫu thực địa, thấy mẫu chứng lẫn mẫu huyết thực Lê Thùy Duyên 67 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận địa, tách chiết RNA phương pháp Boom cho hiệu tương đương với phương pháp Phenol-Chloroform Do đó, kết luận phương pháp Boom phương pháp Phenol-Chloroform sử dụng tách chiết RNA từ huyết heo 3.6.2 Tạo dòng gene làm chứng dương Để tiến hành tạo dòng PRRSV cho mục đích làm chứng dương, chúng tơi thu nhận trình tự mục tiêu từ hai dịng với vaccine Amervac đại diện cho PRRSV type EU chủng VR2332 (ATCC) đại diện cho PRRSV type NA Kết hình 3.12 chứng tỏ chúng tơi thu nhận trình tự mục tiêu type EU với kích thước 660 bp (giếng 2) trình tự mục tiêu type NA với kích thước 637 bp (giếng 3) 600 bp Hình 12: Kết điện di sản phẩm PCR từ mẫu EU mẫu NA Giếng 1: chứng âm Giếng 2: sản phẩm PCR từ mẫu EU Giếng 3: sản phẩm PCR từ mẫu NA Giếng 3; Thang kích thước DNA 1kb (Solgent) Lê Thùy Duyên 68 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận Tiếp theo tiến hành cắt plasmid pBluescript SK II enzyme cắt giới hạn Sma I với thành phần mục 2.7.2 Phản ứng cắt thực 40C Sau đó, tiến hành tinh sản phẩm cắt phương pháp Phenol-Chloroform theo quy trình mục 2.7.3 Kết cắt plasmid pBluescript SK II trình bày hình 3.13 cho thấy thu nhận plasmid pBluescript SK II dạng mạch thẳng với kích thước tương đương 2961 bp (giếng 3) 2000 bp Hình 13: Kết phản ứng cắt giới hạn plasmid pBluescript SK II Giếng 1: Thang kích thước DNA 1kb –Promega Giếng 2: Plasmid pBluescript không thực phản ứng cắt Giếng 3: Plasmid pBluescript sau thực phản ứng cắt Sau thu nhận plasmid pBluescript II SK trình tự mục tiêu (PRRSV type EU PRRSV type NA) dạng mạch thẳng với hai đầu bằng, thực phản ứng nối biến nạp vào tế bào khả nạp E.coli DH5α Trải tế bào biến nạp môi trường dinh dưỡng LB agar Ampiciline/IPTG/Xgal ủ 16 37oC Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp khuẩn lạc có màu trắng Tiếp theo chúng tơi tiến hành sàng lọc dịng chứa plasmid tái tổ hợp mang trình tự EU (pBlue-EU) dịng plasmid tái tổ hợp mang trình tự NA (pBlueNA) Việc sàng lọc tiến hành theo ba phương pháp: (1) PCR khuẩn lạc với mồi T7 promoter mồi PR10-R (hình 3.14); (2) Real time PCR plasmid tái tổ Lê Thùy Duyên 69 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận hợp với cặp mồi mẫu dị PR6 (hình 3.15); (3) Giải trình tự plasmid (hình 3.16 hình 3.17) A 23 4 56 67 B B Hình 14: Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7 promoter PR10-R A: PRRSV type EU; B: PRRSV type NA Giếng 1: chứng âm Giếng 2-7: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc trắng ( khoảng 670 bp) Giếng 8: Thang kích thước DNA 1kb (Promega) Kết PCR khuẩn lạc khuẩn lạc từ hai nguồn tạo dòng với cặp mồi T7 promotet PR10-R cho thấy đố chúng tơi thu nhận hai dịng chứa plasmid tái tổ hợp pBlue-EU (A) dòng chứa plasmid tái tổ hợp pBlue-NA Từ đại diện dịng, chúng tơi thực phản ứng Real time PCR với cặp mồi PR6 Kết cho thấy phản ứng multiplex Real time PCR chúng tơi cho tín hiệu huỳnh quang phát EU plasmid pBlue-EU tín hiệu huỳnh quang phát NA plasmid pBlue-NA (hình 3.15) pBlue-EU EU pBlue-NA NA Hình 15: Kết phản ứng Real time PCR plasmid tái tổ hợp Lê Thùy Duyên 70 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận Phương pháp giải trình tự phương pháp cuối nhằm khẳng định chắn dịng plasmid tái tổ hợp Kết giải trình tự so sánh tương đồng với trình tự công bố NCBI công cụ Blast Kết Blast cho thấy: - Dịng pBlue-EU có tương đồng 99% với chủng Amervac (GU067771.1) 96 % với chủng Lelystad Ngồi pBlue-EU cịn có độ tương đồng với trình tự có nguồn gốc PRRSV type EU khác từ 9499% (hình 3.16) - Dịng pBlue-NA có tương đồng 99% với chủng VR2332 nhiều chủng khác (hình 3.17) Hình 16: Kết Blast trình tự plasmid pBue-EU với trình tự cơng bố NCBI Lê Thùy Duyên 71 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết quả-Biện luận Hình 17: Kết Blast trình tự plasmid pBue-NA với trình tự công bố NCBI Như vậy, từ kết kiểm tra khẳng định tạo dịng thành cơng plasmid mang trình tự PRRSV đặc trưng cho type (EU NA) Các plasmid sử dụng làm chứng dương quy trình Real time RT-PCR sau Lê Thùy Duyên 72 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết luận đề nghị CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Lê Thùy Duyên 73 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết luận đề nghị CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Lê Thùy Duyên 73 Luận văn Thạc sĩ 4.1 Chương Kết luận đề nghị KẾT LUẬN Trong khuôn khổ thực đề tài này, đ thu nh ận ã kết sau: 1) Thiết kế cặp mồi PR6 cho phép phát PRRSV hai mẫu dò đặc hiệu cho type PRRSV Bên cạnh đó, chúng tơi thiết kế mẫu dò chứng nội IC7 bắt cặp đặc hiệu gene mã hóa ribosomal protein L4 (RPL4) Cùng với cặp mồi IC7 lấy từ cơng trình Nygard A.B et al (2006) [38], mồi mẫu dò IC7 đư ợc sử dụng làm chứng nội nội sinh, nhằm kiểm sốt tồn quy trình phát 2) Phản ứng multiplex Real time RT-PCR phát phân type PRRSV tối ưu với thành phần có nồng độ cuối cho thể tích 25µl sau: Taq polymerase 1,5 u; MgCl2 4,5 mM; dNTPs 200 µM; loại mẫu dị 0,1 µM (PP6-P1, PR6-P2, IC7-P) , mồi PR6-F PR6-R 0,4 µM, mồi IC7-F IC7-R 0,2 µM; 2,5 µl cDNA Hỗn hợp phản ứng tiến hành luân nhiệt với nhiệt độ lai tối ưu 570C 3) Khảo sát ngưỡng phát đặc hiệu quy trình multiplex Real time RT- PCR Qua cho thấy quy trình chúng tơi phát virus PRRSV liều lượng 0,3 TCID50/ml có độ đặc hiệu cao, cho phép phát mẫu có chứa virus PRRSV, khơng cho tín hiệu huỳnh quang mẫu chứa vi sinh vật thường xuất heo 4) Kết so sánh hiệu phát phân type PRRSV 20 mẫu heo chăn nuôi với hai loại kit thương mại (Herdchek*PRRS 2XR IDEXX kit phát phân type PRRSV phương pháp Real time RTPCR Shanghai ZJ Biotech, Co., Ltd) cho thấy quy trình mà chúng tơi xây dựng có hiệu phát tương đồng 20/20 mẫu so với kit thương mại Shanghai XJ Biotech (13 mẫu dương tính với PRRSV type NA, mẫu dương tính với PRRSV type EU mẫu âm tính) 16/20 mẫu so với kit Herdchek*PRRS 2XR IDEXX Lê Thùy Duyên 74 Luận văn Thạc sĩ Chương Kết luận đề nghị 5) Chuẩn bị bước khởi đầu cho việc tạo kit chẩn đốn hồn chỉnh với kết sau: − Có thể sử dụng hai phương pháp Boom Phenol-Chloroform cho việc tách chiết RNA với hiệu tương đương − Thu nhận hai dịng plasmid tái tổ hợp chứa trình tự mục tiêu PRRSV đặc trưng cho type (pBlu-EU pBlu-NA) Hai dòng plasmid tái tổ hợp sử dụng làm chứng dương cho quy trình phát phân type PRRSV Tóm lại, quy trình Real time RT-PCR phát phân type PRRSV mà xây dựng mô tả sơ đồ sau: Mẫu huyết heo Tách chiết RNA + Boom + Phenol-Chlroform Phiên mã ngược + Thiết kế mồi iScriptTM cDNA synthesis Kit Bio-Rad mẫu dị + Giải trình tự sản phẩm nhân Phản ứng multiplex + Tối ưu nhiệt độ lai, nồng độ Real time RT-PCR MgCl2, mồi, mẫu dò, Taq + Tạo dòng polymerase PRRSV + Xác định ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu Áp dụng mẫu thực địa, so sánh với kit thương mại + Kit ELISA (INDEXX, Mỹ) + Real time RT-PCR bước (Shanghai ZJ Biotech, Trung Quốc) Lê Thùy Duyên 75 Luận văn Thạc sĩ 4.2 Chương Kết luận đề nghị ĐỀ NGHỊ Từ kết thu đưa số đề nghị sau: - Cần khảo sát quy trình số lượng mẫu heo lớn để nâng độ tin cậy - Cần giải trình tự số mẫu heo cho kết không tương đồng với kit thương mại - Cần tiến hành khảo sát quy trình loại mẫu khác mẫu tinh dịch, mẫu mô mẫu thịt Điều mang ý ngh l ớn việc kiểm soát ĩa nguồn heo giống bệnh nguồn thịt xuất nhập - Khảo sát độ ổn định quy trình đ ể phát triển thành kit chẩn đốn hồn chỉnh Lê Thùy Dun 76 ... văn Thạc sĩ Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Một số thông tin hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (PRRS) Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo (Porcine reproductive and respiratory syndrome-PRRS)... Một số thông tin hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản heo (PRRS) 1.2 Triệu chứng bệnh 1.3 Tác nhân gây bệnh 1.4 Cấu trúc gene PRRSV 1.5 Cơ chế gây bệnh... từ giảm nguy nhiễm Hiện kĩ thuật Real- time RT-PCR ngày ứng dụng nhiều chẩn đoán tác nhân gây bệnh người, động vật thực vật Nhiều cơng trình xây dựng quy trình Real- time RT-PCR phát PRRSV sử dụng