Xây dựng quy trình TaqMan realtime PCR phát hiện một số nhóm gene blaOXA ở Acinetobacter baumannii

Hình 1.1 Acinetobacter baumannii nguồn: Janice Carr, CDC Acinetobacter baumannii là loại vi khuẩn siêu kháng thuốc với khả năng kháng lại hầu hết các loại kháng sinh hiện nay, nổi lên

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR

NGUYỄN TUẤN ANH HUỲNH MINH TUẤN

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/ 2016

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐOÀN TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TAQ-MAN REAL-TIME PCR

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2016

MỤC LỤC

Trang

TÓM TẮT 1

ABSTRACT 3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 8

PHẦN MỞ ĐẦU 9

1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 11

1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu trong và ngoài nước 11

1.2 Gene OXA ở A baumannii 17

1.3 Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan 19

1.4 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố 22

1.5 Lý do thực hiện nghiên cứu 24

1.6 Dự báo khả năng ảnh hưởng của kết quả nghiên cứu 24

1.7 Mục tiêu của đề tài 25

2 CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 Vật liệu 26

2.2 Phương pháp 26

2.2.1 Thu nhận các chủng A baumannii gây bệnh 26

2.2.2 Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh 26

2.2.3 Thiết kế mồi và mẫu dò 29

2.2.4 Phương pháp tách chiết nucleic acide 31

2.2.5 Phương pháp real-time PCR 31

3 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 35

3.1 Thu thập chủng vi khuẩn 35

3.2 Thiết kế mồi và mẫu dò 36

3.3 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR 36

3.3.1 Tối ưu điều kiện phản ứng monoplex real-time PCR 37

3.3.2 Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex real-time PCR 40

3.4 Đánh giá quy trình multiplex real-time PCR 43

3.4.1 Độ đặc hiệu của quy trình multiplex real-time PCR 43

3.4.2 Độ nhạy của quy trình multiplex real-time PCR 44

3.4.3 Độ ổn định của quy trình multiplex real-time PCR 44

3.4.4 Động học của quy trình multiplex real-time PCR 46

3.5 Thử nghiệm quy trình multiplex real-time PCR 46

4 CHƯƠNG IV – BIỆN LUẬN 51

5 CHƯƠNG V – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

7 PHỤ LỤC 63

7.1 Phụ lục 1: 63

7.2 Phụ lục 2: 65

7.3 Phụ lục 3: 66

7.4 Phụ lục 4: 68

7.5 Phụ lục 5: 69

7.6 Phụ lục 6: 70

7.7 Phụ lục 7: 71

7.8 Phụ lục 8: 72

7.9 Phụ lục 9: 73

7.10 Phụ lục 10: 84

7.11 Phụ lục 11: 85

7.12 Phụ lục 12: 86

7.13 Phụ lục 13: 87

7.14 Phụ lục 14: 89

7.15 Phụ lục 15: 90

TÓM TẮT

Tổng quan:

Việc sử dụng kháng sinh không đúng và lạm dụng kháng sinh đã tạo nên một áp lực chọn lọc và khiến xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh gia tăng về số lượng một cách nhanh chóng Carbapenem là kháng sinh phổ rộng, mạnh và thường được sử dụng trong trường hợp nhiễm trùng đa

kháng thuốc Acinetobacter baumannii là một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm hàng đầu hiện nay Đặc biệt, các chủng A

baumannii sở hữu một số nhóm gene blaOXA, có khả năng biểu hiện tính đa kháng kháng sinh, nhất là đối với carbapenem

Mục đích:

Nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình multiplex Taq-Man real-time PCR phát hiện 3 nhóm gene blaOXA-23/-51/-58 điển hình ở A baumannii, đồng thời với gene 16S rRNA đặc trưng cho Acinetobacter spp

OXA-23/-51/-58 đặc trưng của A baumannii với độ nhạy khoảng 4 bản

sao/phản ứng và độ đặc hiệu cao, không cho tín hiệu dương tính với DNA của nhiều loài vi khuẩn thường thấy trong bệnh viện

Kết quả khảo sát cho thấy trong các mẫu vi khuẩn thu thập được, có 63

(54,3%) chủng được xác định là Acinetobacter spp qua sự hiện diện của gene

16S rRNA Trong đó, có 45 (71,4%), 38 (60,3%) và 4 (6,3%) chủng lần lượt

mang các gene blaOXA-51, blaOXA-23 và blaOXA-58 Các chủng mang gene

bla

OXA-51 được cho là các chủng A baumannii xét trên quan điểm blaOXA-51

là chỉ thỉ sinh học phân tử đặc trưng của vi khuẩn này Trong 45 chủng A

baumannii (mang gene blaOXA-51), có 84,4% (38/45) mang thêm gene

real-baumannii và một số nhóm gene kháng kháng sinh blaOXA của chúng Quy trình có thể được ứng dụng để nghiên cứu dịch tễ học phân tử về sự hiện diện các nhóm gene blaOXA này ở A baumannii

usually used in cases of multidrug resistance Acinetobacter baumannii

currently is one of the most leading and dangerous factors causing nosocomial

infections In addition, A baumannii harbouring several blaOXA genes could express the ability of multidrug resistance, especially with carbapenem

to detect blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 and 16S rRNA correspondingly

in one reaction The multiplex real-time PCR was optimized to get the highest amplification efficiency for all targeted genes

Results:

The results showed that the protocol could detect precisely blaOXA-23,

bla

OXA-51, blaOXA-58 genes specific to A baumannii with high sensitivity (4

copies/reaction) and specificity, not reacting with DNA of many common bacteria in hospital environment

The survey result showed that 63 (54,3%) Acinetobacter spp isolates

was determined by 16S rRNA gene In there, 45 (71,4%), 38 (60,3%) and 4 (6,3%) isolates contained blaOXA-51, blaOXA-23 and blaOXA-58 genes correspondingly The isolates with blaOXA-51 gene was accepted to be so-

called A baumannii isolates based on the existence of the gene as the specific molecular marker In 45 A baumannii isolates (containing blaOXA-51), there were 84,4% (38/45) isolates with extra blaOXA-23 gene and 2,2% (1/45) isolates with blaOXA-58 gene The rest of isolates with blaOXA-58 gene was of the group without blaOXA-51 gene This group was determined as

Acinetobacter spp group There was not any isolate containing simultaneously

baumannii The protocol can be used to identify A baumannii rapidly and

their antimicrobial resistance blaOXA genes Potentially, the protocol might become a tool to study molecular epidemiology of several blaOXA genes

popularly in A baumannii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AmpC: Chromosomally encoded cephalosporinase

ARDRA: Amplified Ribosomal DNA Restriction analysis

ATCC: American Type Culture Collection

BHI: Brain Heart Infusion

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

CarO: Carbapenem Resistance Outer Membrane Protein

DNA: DeoxyriboNucleic Acid

EMB: Eosin Methylen Blue

ESBL: Extended Spectrum β-lactamase

GES: Guiana Extended Spectrum

IDT: Intergrated DNA Technologies

IND: Chryseobacterium indologenes

IS: Insertion Sequence

KPC: Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase

LB: Luria-Bertani

MIC: Minimum Inhibitory Concentration

NCBI: National Center for Biotechnology Information NDM-1: New-Delhi Metallo-beta-lactamase

Nel: Neltimicin

OF: Oxidative Fermentative

OUCRU: Oxford University Clinical Research Unit

OXA: Oxacillin hoặc Oxacillinase

PCR: Polymerase Chain Reaction

PER: Pseudomonas Extended Resistance

rRNA: Ribosomal RiboNucleic Acid

SME: Serratia Marcescens Enzyme

SIM: Sulfite Indole Motility

Tc: Ticarcillin Clavuclanic Acid

TSI: Triple Sugar Iron Agar

VIM: Verona Integron-encoded Metallo-beta-lactamase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân nhóm carbapenemase 17 Bảng 3.1 Trình tự các mồi được thiết kế 36 Bảng 3.2 Giá trị Ct hiệu quả nhân bản của các cặp mồi/mẫu dò 38 Bảng 3.3 Giá trị Ct phản ứng monoplex real-time PCR phát hiện gene 16S rRNA 38 Bảng 3.4 Giá trị Ct tối ưu hóa nhiệt độ lai của mồi/mẫu dò 39

Bảng 3.5 Giá trị Ct hiệu quả phản ứng multiplex real-time PCR 40

Bảng 3.6 Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ mồi/mẫu dò 16S rRNA trong phản ứng multiplex real-time PCR 41

Bảng 3.7 Giá trị Ct tối ưu hóa nồng độ MgCl2 trong phản ứng multiplex time PCR 42

real-Bảng 3.8 Giá trị Ct độ nhạy của phản ứng multiplex real-time PCR 44 Bảng 3.9 Giá trị Ct độ ổn định của phản ứng multiplex real-time PCR theo

thời gian 45 Bảng 3.10 Giá trị Ct độ ổn định của phản ứng multiplex real-time PCR theo người thực hiện 45 Bảng 3.11 Giá trị Ct động học của phản ứng multiplex real-time PCR 46 Bảng 3.12 Kết quả phát hiện các gene blaOXA và 16S rRNA của A

baumannii và Acinetobacter spp bằng phương pháp multiplex real-time

PCR 47 Bảng 3.13 Tương quan giữa sự hiện diện của gene blaOXA-23 và tính nhạy kháng kháng sinh β-lactam 49

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Acinetobacter baumannii (nguồn: Janice Carr, CDC) 11

Hình 3.1 Tỉ lệ nhạy/kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đã thu thập 35

Hình 3.2 Tỉ lệ nhạy/kháng kháng sinh của các chủng Acinetobacter spp /

A.baumannii 48

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Tên đề tài/dự án: Xây dựng qui trình Taq-Man real-time PCR phát hiện

một số nhóm gene bla OXA ở Acinetobacter baumannii

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Nguyễn Tuấn Anh và Huỳnh Minh Tuấn

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ

Thời gian thực hiện: 10/2014 – 4/2016

Kinh phí được duyệt: 80 triệu VNĐ

Kinh phí đã cấp: theo Thông báo số /TB-SKHCN

2 Mục tiêu: Xây dựng thành công “Qui trình Taq-Man real-time PCR phát hiện một số nhóm gene blaOXA ở Acinetobacter baumannii” Qui trình giúp

phát hiện đồng thời một số nhóm gene blaOXA quan trọng đã xuất hiện ở A

baumannii, có liên quan đến tính kháng carbapenem

3 Nội dung thực hiện:

Thu nhận khoảng 72-100 chủng

A baumanii gây bệnh kèm theo

thông tin kháng sinh đồ

Đã thu thập 116 chủng vi khuẩn gây bệnh kèm theo thông tin kháng sinh

đồ

Thiết kế các bộ mồi và mẫu dò

đặc hiệu với blaOXA-23, bla

với blaOXA-23, blaOXA-51,

bla

OXA-58 của A baumannii

Độ nhạy (ngưỡng phát hiện):

OXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58

của A Baumannii và 16S rRNA của

Thử nghiệm quy trình trên các

chủng A baumannii đã thu thập

để đánh giá tỉ lệ nhóm gene

bla

OXA hiện diện

Qui trình đã được thử nghiệm trên các

chủng vi khuẩn Acinetobacter spp /

A baumannii đã thu thập để đánh giá

tỉ lệ nhóm gene blaOXA hiện diện

1 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan vấn đề nghiên cứu trong và ngoài nước

Việc sử dụng kháng sinh không đúng và lạm dụng kháng sinh đã tạo nên một áp lực chọn lọc và khiến xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh gia tăng về số lượng một cách nhanh chóng Khi liệu pháp dùng kháng kháng sinh thất bại, điều đó có nghĩa là bệnh tình sẽ trở nên trầm trọng và kéo dài, phải sử dụng các loại thuốc mạnh và mắc tiền, tiềm tàng những hiệu ứng phụ nguy hiểm và tỉ lệ tử vong cao vì nhiễm khuẩn

Carbapenem hiện là kháng sinh được coi là mạnh nhất hiện nay, được

sử dụng trong trường hợp các đa kháng thuốc ở vi khuẩn Tuy nhiên, sự xuất hiện của enzyme carbapenemase ở một số vi khuẩn khiến kháng sinh này dần mất tác dụng độc tôn của nó blaOXA gene ở A baumannii là gene được xem

là có khả năng tạo ra carbapenemase và giúp vi khuẩn kháng lại kháng sinh

này Đây là một trong những yếu tố khiến A baumannii trở thành vi khuẩn

gây nhiễm khuẩn bệnh viện hàng đầu nguy hiểm nhất hiện nay

Hình 1.1 Acinetobacter baumannii (nguồn: Janice Carr, CDC)

Acinetobacter baumannii là loại vi khuẩn siêu kháng thuốc với khả

năng kháng lại hầu hết các loại kháng sinh hiện nay, nổi lên như một trong những tác nhân hàng đầu gây nhiễm trùng tại các bệnh viện trên thế giới

Acinetobacter, trước đây có tên là Acinetobacter calcoaceticus, là vi khuẩn

Gram (-) cơ hội, không lên men, có nguồn gốc từ đất và nước, và có thể tìm

thấy trên da người khỏe mạnh Có nhiều loại Acinetobacter và tất cả chúng đều có khả năng gây bệnh cho người, trong đó Acinetobacter baumannii chiếm hơn 80% trường hợp bị nhiễm bởi các chủng thuộc Acinetobacter [1]

A.baumannii là tác nhân chủ yếu gây viêm phổi, viêm màng não, nhiễm

khuẩn huyết, nhiễm trùng đường tiết niệu, bệnh về da và mô mềm, nhiễm

trùng hệ thần kinh trung ương Sự nguy hiểm khi nhiễm Acinetobacter

baumannii ở chỗ nó có khả năng kháng lại tất cả các loại kháng sinh hiện nay

như β-lactam (penicillin, cephalosporin, carbapenem), tetracycline, aminoglycoside, fluoroquinolone [2]; và vì thế đặc biệt nguy hiểm cho những bệnh nhân nằm viện lâu ngày (nhiều hơn 90 ngày), phải dùng các biện pháp can thiệp như ống thở hay kim truyền liên tục, dùng quá nhiều kháng sinh phổ rộng hoặc bị suy giảm miễn dịch, thường tập trung vào các bệnh nhân có độ tuổi từ 70-90 tuổi Các loại kháng sinh đặc hiệu phổ biến hiện nay có khả

năng không thể vô hiệu hóa được vi khuẩn này Acinetobacter baumannii

đang trở thành loại vi khuẩn siêu kháng thuốc Đây là loại vi khuẩn nguy hiểm không những cho Việt Nam mà cho cả trên thế giới, đặc biệt là các bệnh viện có đông bệnh nhân

Vào những năm 70, vi khuẩn này nhạy cảm với hầu hết các lọai kháng sinh, nhưng hiện nay đã trở thành tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện trên toàn thế giới vì đặc tính thu nhận nhanh chóng những nhân tố kháng với

nhiều loại kháng sinh khác nhau Hiện nay, có một số chủng Acinetobacter

baumannii đã trở nên kháng với tất cả các kháng sinh sẵn có, bằng cách thu

nhận những plasmid, transposon hoặc integron mang cụm gene mã hóa tính

kháng với nhiều họ kháng kháng sinh cùng lúc Vì Acinetobacter baumannii

đã trở nên khó bị tiêu diệt bắt nguồn từ khả năng kháng thuốc gia tăng, như đối với carbapenem, beta-lactam và tetracycline, hiểu biết về bộ gene của nó cũng như các gene kháng thuốc nó sở hữu đặc biệt quan trọng để tiệt trừ hiệu

quả và ngăn cản sự tồn tại và lan truyền của Acinetobacter baumannii, đặc

biệt trong môi trường bệnh viện

Tình trạng kháng kháng sinh ở A.baumannii đang ở mức báo động,

được tổ chức WHO tuyên bố là một trong năm tác nhân đa kháng phổ biến

gồm Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae,

Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter spp

được gọi với cái tên nhóm “ESKAPE” Trong đó, A.baumannii đặc biệt chiếm

tỷ lệ cao (16-32%) và nổi trội, đồng thời có mức đề kháng hơn 80% với hầu hết các loại kháng sinh trong bệnh viện Tình trạng đa kháng thuốc ở

A.baumannii tăng trong suốt thập kỉ qua, là hậu quả của việc sử dụng kháng

sinh tràn lan Nguy hiểm hơn khi carbapenem được coi như là lựa chọn cuối

cùng để điều trị nhiễm trùng do A.baunannii đa kháng cũng không còn hiệu

quả do sự xuất hiện của enzyme carbapenemase (đặc biệt là nhóm D lactamase/ CHDLs) có khả năng phân hủy carbapenem, tỷ lệ kháng tăng trên

β-toàn thế giới, và chủng A.baumannii kháng carbapenem đủ tiêu chuẩn để xác

định là đa kháng sinh

Trên thế giới, tại Hoa Kỳ, tần suất các loại nhiễm khuẩn bệnh viện gây

ra bởi trực khuẩn gram âm, hiếu khí, không lên men được theo dõi và báo cáo hàng năm qua hệ thống NNIS Trong giai đoạn 1987-1997, các loại vi khuẩn này là tác nhân của khoảng 13% các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện xác

định được, trong đó Acinetobacter là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện

duy nhất hiện diện ít nhất 1 lần ở tất cả các bệnh viện [3] Dữ liệu từ hệ thống quốc gia giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện thu thập trong khoảng thời gian

1986 - 2003 cho thấy sự gia tăng đáng kể của các chủng Acinetobacter kháng amikacin (5% đến 20%; p = 0,001), ceftazidime (25% đến 68%; p = 0,001) và imipenem (0% đến 20%; p = 0,001) [4] Trong một nghiên cứu khác cũng cho thấy chủng Acinetobacter spp thu thập từ năm 2004 đến năm 2005 ở 76 trung

tâm trên khắp nước Mỹ, có 60,2% chủng nhạy cảm với imipenem Số chủng

Acinetobacter baumannii không còn nhạy cảm với kháng sinh chiếm tỷ lệ khá

cao: 10% đến 15% đối với carbapenem, 35% đến 40% đối với ceftazidime/cefepime, 10% đến 30% đối với aminoglycoside và 35% đến 40% đối với ciprofloxacin/levofloxacin [1]

Ở Anh, sự nhiễm khuẩn bệnh viện do A.baumannii kháng carbapenem

đã xảy ra từ năm 2000 Giữa năm 2004 và 2008 tỉ lệ không nhạy cảm với meropenem đã tăng từ 13 đến 29% Trong năm 2008 sự không nhạy của

Acinetobacter với các lớp khác của kháng sinh được báo cáo:

aminoglycosides khoảng 20%; ciprofloxacin 30%; ceftazidime 70%; cefotaxime 89%; piperacillin/ tazobactam 50%

Ở châu Âu, tỉ lệ kháng cao nhất được báo cáo ở các vùng Địa Trung Hải bao gồm Hi Lạp, Thổ Nhĩ Kì, Ý và Nhật Tại 48 bệnh viện ở Châu Âu

giai đoạn 2002-2004, 73,1% các chủng Acinetobacter baumannii là nhạy cảm

với meropenem và 69,8% là nhạy cảm với imipenem

Mỹ la tinh là một trong những khu vực có tỷ lệ Acinetobacter

baumannii kháng với meropenem, imipenem, ceftazidime, piperacillin/tazobactam, ciprofloxacin, hay gentamicin cao nhất thế giới Nghiên cứu giám sát liên quan đến Argentina, Brazil, Chile và Colombia được thực hiện trong khoảng thời gian 1997 – 2001 cho thấy tỷ lệ kháng cao nhất ở Argentina và không có quốc gia nào là không xuất hiện các chủng đa kháng [1]

Tại châu Phi, khoảng 30% Acinetobacter baumannii phân lập từ máu

có khả năng kháng carbapenem, 40% kháng với cefepime và piperacillin/tazobactam, 30% kháng với ciprofloxacin và levofloxacin [5]

Tại châu Á và Trung Đông, tỷ lệ Acinetobacter baumannii không còn

nhạy cảm với imipenem và meropenem là trên 25%, đối với ampicillin/sulbactam, cefepime và ceftazidime là 40%, đối với amikacin là

35% và đối với ciprofloxacin là 45% [6] Nghiên cứu về dịch tễ học lâm sàng tại các đơn vị chăm sóc sức khỏe mở rộng của Ravi và cộng sự (Ấn Độ, 2013)

cho thấy mô hình kháng thuốc của A baumannii là kháng đa thuốc với tỉ lệ 92%, vượt xa hai đối tượng còn lại là P aeruginosa (35%) với cùng mô hình

và E coli (5%) với mô hình kháng carbapenem [7] Nghiên cứu về sử dụng

colistin trong điều trị của Karli và cộng sự (Thổ Nhĩ Kỳ, 2013) cho thấy tác

nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện chủ đạo là A baumannii (48.8%), kế đến là

P aeruginosa (22%), đồng thời A baumannii và P aeruginosa (17.1%) và

những vi khuẩn khác (12.2%) [8] Báo cáo của hệ thống kiểm soát nhiễm

khuẩn bệnh viện ở Đài Loan (2011) cho thấy A baumannii là một trong

những tác nhân phổ biến gây nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở các khu vực

chăm sóc đặc biệt, bên cạnh E coli và Candida spp Trong đó, tỉ lệ kháng thuốc carbapenem của A baumannii lên tới 62.5%, trong khi K pneumoniae

là 10.7% và P aeruginosa là 18.1% [Báo cáo khoa học]

Ở Việt Nam, báo cáo “can thiệp dựa trên bằng chứng bao gồm chương

trình quản lý kháng sinh nhằm giảm gánh nặng về kháng sinh tại cạc bệnh viện ở Việt Nam” (2013) của Mattias Larsson (OUCRU Hà Nội) và Vũ Đình

Phú (Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương) cho thấy các vi khuẩn thường

gặp gây nhiễm trùng bệnh viện là A baumannii (22%), P aeruginosa (13%),

K pneumonia (11%), K unspecified (6%) và S aureus (6%) … (VINARES)

[Báo cáo khoa học]

Báo cáo “viêm phổi liên quan đến thở máy – chiến lượng nghiên cứu

cho Việt Nam” - 2013) của Behzad Nadjm (OUCRU Hà Nội) cho thấy tác

nhân gây viêm khí phế quản phổi liên quan đến thở máy do 80% là vi khuẩn

Gram (-) điển hình là A baumannii và P aeruginosa, 20% do vi khuẩn Gram

(+) mà chủ yếu là MRSA (OUCRU) [Báo cáo khoa học]

Báo cáo “tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện và các yếu tố liên quan tại

bệnh viện đa khoa Đồng Nai năm 2011” cho thấy loại vi khuẩn phân lập được

từ các mẫu bệnh phẩm chiếm tỷ lệ cao nhất là Acinetobacter baumanni

(25%), kế tiếp Klebsiella pneumoniae sinh ESBL (21,9%), Escherichia coli chiếm (18,8 %), S aureus và Stenotrophomonas maltophilia ( 9,4%), 5 nhóm

vi khuẩn khác mỗi nhóm chiếm (3,1%) [Báo cáo khoa học]

Nghiên cứu “khảo sát mức độ đề kháng kháng sinh của Acinetobacter

và Pseudomonas phân lập tại bệnh viện nhiệt đới năm 2010” cho thấy Acinetobacter đa kháng và kháng carbapenem rất cao trong dịch hút khí quản

(75%) Hầu hết các chủng kháng imipenem cũng kháng với meropenem [9]

Phân tích 476 mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Trưng Vương (2010) cho

thấy A baumannii là vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện (32.3%) Trong đó A baumannii được phân lập chủ yếu từ bệnh phẩm đàm (39.3%) và cũng là nguyên nhân gây bệnh phổi nhiều nhất A baumannii có mức độ đề

kháng cao với hầu hết kháng sinh như: Gentamycin (95.5%), Cefepime (89.9%), Tobramycin (87%), Ceftazidime (81.5%), imipenem/Cilastatin (79.3%) và meropenem (77.4%)

Phân tích 195 mẫu bệnh phẩm tại viện Pasteur (2013) cũng cho kết quả

tương tự bệnh viện Trưng Vương 80% A baumannii được phân lập từ đờm,

mức độ kháng kháng kháng sinh của vi khuẩn này hầu như trên 90%, vẫn nhạy hoàn toàn với Colistin

Một phân tích từ 7 bệnh viện ở Việt Nam (2013) cho thấy có đến 80%

Acinetobacter spp là A baumannii, và mức độ đề kháng kháng sinh rất cao:

imipenem 76.5%, meropenem 81.3%; các kháng sinh khác hầu hết đều bị

kháng trên 80%, đáng lo ngại nhất là A baumannii kháng colistin đến 15.7%

1.2 Gene OXA ở A baumannii

Carbapenemase là enzyme bất hoạt carbapenem và một số β-lactam khác Carbapenemase thuộc lớp A, B và D trong hệ thống phân loại Ambler Mỗi lớp có những loại enzyme khác nhau ở cấp độ phân tử

KPC, GES, SME

Metallo-carbapenemase

Tất cả β-lactam ngoại trừ aztreonam

IMP, NDM, VIM, IND

cephalosporinase

Penicillin, cephalosporin, bao gồm cefoxitin, cefotetan, cetriaxone, cefotaxime

AmpC

D 2df Carbapenemase Carbapenem, penicillin,

cephalosporin, aztreonam OXA

Hai hệ thống phân loại β-lactamase: Ambler và Bush Jacoby Hệ thống phân loại Ambler gồm 4 lớp, đặt tên

từ A đến D, dựa trên sự tương đồng về trình tự amino acid Hệ thống phân loại Bush-Jacopy gồm 4 nhóm, đặt tên từ 1 đến 4, dựa trên cơ chất (imipenem) và chất ức chế (clavulanic acid)

Carbapenemase được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp và Acinetobacter spp Phần lớn gene kiểm soát sự sản xuất

carbapenemase có thể được vận chuyển dễ dàng bằng plasmid và hầu hết các chất ức chế β-lactamase, như clavulanic acid, tazobactam và sulbactam, không có khả năng kháng lại carbapenemase

Nhóm carbapenemase lớp D còn được gọi là oxacillinase (OXA) Chúng có hoạt tính bản thể kháng lại với carbapenem và hoạt tính đó có thể gia tăng bởi những nhân tố điều hòa biểu hiện gene blaOXA ở vùng thượng nguồn Các gene blaOXA có thể nằm trên bộ nhiễm nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc plasmid Tính nguy hiểm của OXA carbapenemase là khả năng đột biến nhanh chóng và mở rộng phổ kháng

Các gene blaOXA được phát hiện tồn tại chủ yếu ở K pneumoniae ở Thổ Nhĩ Kỳ và Bỉ Hiện nay, các gene này còn hiện diện chủ yếu ở P

aeruginosa, A baumannii và Enterobacteriaceae [10, 11]

A baumannii sản xuất oxacillinase một cách tự nhiên Bình thường, các

enzyme này có hoạt tính carbapenemase nhưng không đáng kể Tuy nhiên,

bla

OXA có lẽ khi được biểu hiện vượt mức và dẫn tới tính kháng carbapenem

mạnh ở A baumannii nhờ có trình tự chèn (IS) ở vùng thượng nguồn, có vai trò như promotor điều khiển sự biểu hiện gen [12-15] Bên cạnh đó, tiếp thu

một số gene blaOXA cũng là nguyên nhân dẫn tới tính kháng carbepenem ở A

baumannii [2] Oxacillinase có khả năng thủy giải carbepenem (carbapenem

hydrolyzing oxacillinase – CHDL) đã thường được phát hiện ở các chủng

baumannii kháng carbapenem [2]

Nhóm CHDL thứ nhất, đại diện là blaOXA-23 và blaOXA-27, được phát hiện ở Scotland nãm 1995 [16] blaOXA-23 là dạng CHDL phổ biến nhất ở A

baumannii đã được phát hiện trên toàn thế giới (Romania, Brazil, South

Korea, China, Russia, French) [17-20] blaOXA-23 đã được xác định là một phần của cấu trúc transposon Tn2006 và Tn2007 [21]

Nhóm CHDL thứ 2, đại diện là blaOXA-24, blaOXA-25, blaOXA-26 và

bla

OXA-40, đã được phát hiện ở A baumannii [17, 22-24] Những CHDL này

cũng được phát hiện trên khắp thế giới và hiện diện ở trên nhiễm sắc thể vi khuẩn hoặc plasmid của chúng Sự giảm biểu hiện của ORF mã hóa porin, 43-

kDa, có cấu trúc tương tự protein biến nhiệt A của Acinetobacter khi kết hợp

với sự hiện diện của blaOXA-24 đóng vai trò trong sự kháng lại carbapenem ở

A baumannii Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của những porin như thế thì vẫn

chưa được biết [25-28]

Nhóm CHDL thứ 3, đại diện là blaOXA-58 và blaOXA-97, đã được phát hiện đầu tiên ở Pháp và theo kết quả điều tra dịch tễ phân tử cho thấy blaOXA-

58 đã lan rộng trên toàn thế giới [28-30] blaOXA-58 được xác định nằm trên plasmid và liên quan tới trình tự chèn IS (mà không liên quan đến transposon) Những trình tự này có lẽ đóng vai trò nào đó trong sự biểu hiện ở mức độ cao của nhóm CHDL này [31]

Đề tài xác định mục tiêu xây dựng qui trình real-time PCR phát hiện 3 nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 vì qua khảo sát sơ bộ của nhóm

nghiên cứu trên 252 chủng A baumannii, blaOXA carbapenemase ở Việt Nam chủ yếu (theo thứ tự giảm dần) là blaOXA-51, blaOXA-23 và blaOXA-58

bla

OXA-24 không được phát hiện trong khảo sát sơ bộ này nên nhóm nghiên cứu không đưa vào quy trình Hiện nay, chưa có thông tin điều tra dịch tễ chính thức về các gene blaOXA lưu hành ở Việt Nam

1.3 Hiện trạng các công trình nghiên cứu liên quan

Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về A baumannii và tính kháng

thuốc của chúng, liên quan đến gene blaOXA gần đây tập trung vào các nội dung như:

Nghiên cứu tính kháng kháng sinh và sự đa dạng di truyền của các gene

OXA mã hóa cho enzyme carbapenemase ở A baumannii Kết qủa cho thấy

cơ chế kháng carbapenem chủ yếu tồn tại ở những chủng A baumannii phân

lập từ không khí là do gene blaOXA-23 và blaOXA-51 [32]

Nghiên cứu sự phân bố của các chủng A baumannii mang gene

Nghiên cứu tính kháng kháng sinh và cơ chế di truyền liên quan đến

tính đa kháng của A baumannii ở Istanbul, Thổ Nhĩ Kỳ Multiplex PCR được

ứng dụng để xác định sự hiện diện của các nhóm gene blaOXA-23, blaOXA-24,

bla

OXA-51 và blaOXA-58 cùng một số gene khác Kết quả cho thấy có sự hiện diện phổ biến của các chủng mang gene blaOXA-51 Kế đến là các chủng mang gene blaOXA-23 Các chủng mang gene blaOXA-24 và blaOXA-58 chiếm

tỉ lệ nhỏ [34]

Nghiên cứu các gene kháng thuốc ở những chủng A baumannii đã biết

kiểu hình đa kháng cho thấy sự đa dạng di truyền liên quan hiện tượng đa kháng này, trong đó có sự hiện diện của nhóm gene blaOXA-58 và PER Kết luận của nghiên cứu cho rằng phát hiện các gene liên quan đến tính đa kháng

là điểm khởi đầu để đưa ra những phương án phù hợp nhằm giới hạn sự lan truyền của những chủng vi khuẩn nguy hiểm [35]

Nghiên cứu sử dụng PCR để phát hiện các gene mã hóa carbapenemase

ở A baumannii Kết quả cho thấy đã phát hiện được các chủng mang gene

bla

OXA-23 Kết quả được khẳng định bằng giải trình tư gene và hoạt tính của enzyme cắt giới hạn [36]

Nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ cơ chế kháng carbepenem của một số

chủng A baumannii phân lập ở USA và Mexico Các chủng nghiên cứu đều

cho kết quả âm tính với các gene metallo-β-lactamase và OXA đã biết bằng PCR Bằng phương pháp biến nạp, phasmid mang gene mới kháng carbapenem đã được phát hiện Giải trình tự gene cho thấy đó là các blaOXA-

235, blaOXA-236 và blaOXA-237 [37]

Nghiên cứu chỉ ra cơ chế kháng carbapenem chủ yếu ở các chủng A

baumannii là do blaOXA-23 Trong khi đó, gene CarO liên quan đến tính thấm trên màng, đóng vai trò phụ trong cơ chế này Tuy nhiên, nghiên cứu cũng thấy rằng các allele CarO khác nhau và sự biểu hiện của chúng có lẽ liên quan

đến tính kháng imipenem Nghiên cứu nhấn mạnh tính chất phức tạp trong cơ chế kháng đối với tính kháng carbapenem [38]

Nghiên cứu sự nhiễm khuẩn bệnh viện ở những cơ sở chăm sóc sức

khỏe mơ rộng tại Ai Cập cho thấy các chủng A baumannii phân lập được với

tính kháng carbapenem có tỉ lệ cao (74%) Hơn nữa, 100% các chủng này mang gene blaOXA-23 và blaOXA-51 Nghiên cứu cảnh báo sự lây lan của các

chủng A baumannii mang gene blaOXA-23 ở Ai Cập Sự lây lan này rất nguy hiểm cho cộng đồng và đòi hỏi cần phải có những phương cách kiểm soát nhiễm khuẩn nghiêm ngặt [39]

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về A baumannii và tính kháng

thuốc của chúng, liên quan đến gene blaOXA gần đây tập trung vào các nội dung như:

“Nghiên cứu tính kháng thuốc của A baumannii phân lập được ở 7

bệnh viện tại Việt Nam” của tác giả Nguyễn Thị Thanh Hà và cộng sự cho

thấy có sự gia tăng tính kháng thuốc của A baumannii tại 7 bệnh viện ở 3

miền khác nhau của Việt Nam Tỷ lệ kháng thuốc thay đổi theo vùng, lức tuổi, khoa điều trị Nghiên cứu kết luận cần phải có một chính sách kiểm soát

nhiễm khuẩn do A baumannii và tính kháng thuốc của vi khuẩn này ở mọi

cấp độ bệnh viện, vùng và quốc gia [40]

“Nhiễm khuẩn bệnh viện do A baumannii – khó khăn trong trị liệu do

vi khuẩn đa kháng thuốc” của tác giả Trần Quang Bính, bệnh viện Chợ Rẫy

(2010) cho thấy các chủng A baumannii phân lập được đề kháng hoàn toàn

với các kháng sinh đang dùng như cephalosporin thế hệ thứ 3 và thứ 4, quinolone, aminoglycoside, piperacilline-tazobactam, ngay cả với carbapenem, chỉ còn nhạy cảm với colistin Colistin hiện là một kháng sinh không có sẵn trong bệnh viện Thuốc trôi nổi trên thị trường không đảm bảo

về nguồn gốc và chất lượng Sử dụng thường xuyên colistin trong điều trị có khả năng dẫn đến sự giảm nhạy cảm và đề kháng nhanh chóng với kháng sinh này trong tương lai gần [41]

“Tìm hiểu tỉ lệ nhiễm và tính kháng kháng sinh của các chủng

Acinetobacter spp phân lập tại bệnh viện Đà Nẵng từ tháng 1/2002 đến tháng 7/2005” của tác giả Đỗ Thị Thu Hương và cộng sự cho thấy số lượng

chủng Acinetobacter phân lập được ngày càng tăng, phân bố chủ yếu ở các

khoa có tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện cao như khoa hồi sức tích cực, khoa

ngoại bỏng …Trong đó, 46% mẫu bệnh phẩm nhiễm duy nhất Acinetobacter, còn lại 54% nhiễm Acinetobacter và 1 hoặc 2 loại vi khuẩn khác Các chủng

vi khuẩn Acinetobacter phân lâp được hầu hết là đa kháng sinh

Hiện nay, Acinetobacter spp cùng với P aeruginosa được xem là

những vi khuẩn hàng đầu gây viêm phổi bệnh viện tại những bệnh viện lớn trong nước và đề kháng với hầu hết kháng sinh, kể cả những kháng sinh phổ rộng, hiệu lực mạnh [42]

1.4 Đánh giá kết quả các công trình nghiên cứu đã công bố

Đối với các công trình nghiên cứu trên thế giới về A baumannii và tính

kháng kháng sinh, nghiên cứu tính kháng chủ yếu tập trung vào nhóm kháng sinh carbapenem, đánh giá tỉ lệ kháng luôn đi kèm theo phân tích sự hiện diện của các gene kháng thuốc điển hình, như blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51,

bla

OXA-58, metallo-β-lactamase, PER, CarO cũng như các nhóm gene mới

có vai trò quan trọng quyết định tính kháng thuốc của A baumannii Nghiên

cứu giải thích cơ chế kháng thuốc bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, bên cạnh kỹ thuật vi sinh cổ điển và làm kháng sinh đồ bằng đĩa giấy hay E-test, như PCR, multiplex PCR, giải trình tự gene, hoạt tính enzyme cắt giới hạn, biến nạp gene, phân tích biểu hiện gene

Đối với các công trình ở Việt Nam, sự hạn hẹp của chi phí nghiên cứu cũng như phương tiện và kỹ thuật nghiên cứu có lẽ là rào cản chủ yếu dẫn đến

sự nghèo nàn trong nội dung nghiên cứu được công bố gần đây trên các chủng

A baumannii nói riêng và các chủng vi khuẩn kháng thuốc khác nói chung

Mặc dù, kết quả khảo sát các chủng kháng thuốc bằng vi sinh truyền thống mang tính chất địa phương là rất quí giá, cung cấp thông tin quan trọng cho bác sĩ để điều trị và bộ phận phòng chống nhiễm khuẩn ở các bệnh viện có thông tin để bảo đảm an toàn cho môi trường bệnh viện, sẽ rất thiếu sót nếu

không thể khai thác được tính địa phương về sự kháng thuốc của A

baumannii, vì có thể tồn tại những cơ chế kháng thuốc khác chưa được biết,

mà chỉ tồn tại hoặc xuất hiện trong hoàn cảnh lâm sàng ở các bệnh viện của Việt Nam

Sự khác biệt lớn nhất giữa những nghiên cứu về A baumannii ở Việt

Nam và trên thế giới là trong khi các nghiên cứu trên thế giới, bên cạnh việc xác định tỉ lệ kháng và các chủng kháng, thì luôn đi sâu tìm hiểu về các cơ

chế liên quan đến tính kháng thuốc của A baumannii Trong khi đó, các

nghiên cứu ở Việt Nam chủ yếu nhắm vào đánh giá sự hiện diện và tỉ lệ các

chủng A baumannii kháng/đa kháng thuốc Rất ít nghiên cứu đánh giá liên quan đến gene kháng thuốc và giải thích cơ chế kháng thuốc của các chủng A

baumannii thu thập từ thực địa, mang tính chất đặc trưng của Việt Nam

Nói chung, các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam đều cho thấy sự khác biệt trong tỉ lệ các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện cũng như mức

độ đề kháng kháng sinh của chúng, phụ thuộc vào đặc trưng của từng bệnh viện hoặc từng khu vực địa lý riêng biệt Từ đó cho thấy cần phải xác định nhanh phổ vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện và tính kháng kháng sinh của chúng cho từng khu vực cụ thể, góp phần đưa ra các chiến lược phòng chống nhiễm khuẩn bệnh viện cũng như chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý tại

từng đơn vị Như thế, các phương pháp hoặc công cụ giúp chẩn đoán nhanh trong hoàn cảnh này thực sự rất cần thiết

1.5 Lý do thực hiện nghiên cứu

Hầu hết các công trình nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy rằng tính

kháng carbapenem ở A baumannii liên quan đến các nhóm gene blaOXA Vì

thế, qui trình xây dựng thành công giúp phát hiện nhanh các chủng A

baumannii kháng carbapenem sở hữu các gene này

Bên cạnh đó, qui trình đã tối ưu, sẽ giúp ứng dụng đánh giá dịch tễ học

phân tử các gene này, phần nào làm sáng tỏ vai trò của chúng ở các chủng A

baumannii phân lập ở Việt Nam (so với thế giới), cùng với phương pháp kiểu

hình truyền thống, sẽ là một sự kết hợp tốt để đánh giá và nghiên cứu về tính

kháng thuốc và cơ chế kháng ở A baumannii

Qui trình cũng là nền tảng cho những nghiên cứu tiếp theo của tác giả trong việc tìm hiểu sự biểu hiện của các gene này, ứng dụng được những ưu điểm của real-time PCR so với qui trình PCR truyền thống, cần phải điện di mới biết được kết quả và không cho phép phân tích biểu hiện các gene này một cách chính xác

Vì thế, tác giả đề xuất xây dựng qui trình mulitplex real-time PCR để xác định nhanh chóng các nhóm gene blaOXA quan trọng

1.6 Dự báo khả năng ảnh hưởng của kết quả nghiên cứu

Khả năng ứng dụng của qui trình real-time PCR là rất lớn, vì ưu điểm hơn hẳn qui trình PCR truyền thống về tính đặc hiệu, nhanh, nhạy, và hạn chế ngoại nhiễm Về mặt khoa học, đây là qui trình multiplex TaqMan real-time

PCR trên đối tượng A baumannii đầu tiên được xây dựng ở Việt Nam Về

mặt công nghệ, khi qui trình được xây dựng thành công thì cũng chứng tỏ

nhóm nghiên cứu của tác giả cũng đã làm chủ được công nghệ xây dựng qui trình chẩn đoán dựa trên nguyên lý multiplex real-time PCR với nhiều tổ hợp mồi và mẫu dò được tích hợp trong cùng một phản ứng, tiết kiệm được hóa chất và thời gian thực hiện Quy trình được xây dựng thành công có thể được ứng dụng để khảo sát dịch tễ học phân tử một số gene blaOXA phổ biến ở A

baumannii đồng thời cũng có thể áp dụng để phát hiện nhanh và chính xác A baumannii dựa trên chỉ thị phân tử là gene blaOXA-51 đặc trưng cho vi khuẩn này

1.7 Mục tiêu của đề tài

Xây dựng thành công qui trình mulitplex real-time PCR xác định nhanh các gene blaOXA quan trọng như blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58

Khảo sát tỉ lệ các gene blaOXA trong quần thể A baumannii đã thu

thập

2 CHƯƠNG II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

Chủng A baumannii chuẩn (ATCC 19606) và DNA nhân tạo của các

gen blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58 và 16S rRNA được sử dụng để tối ưu

và đánh giá qui trình kĩ thuật đang xây dựng DNA của một số chủng vi

khuẩn khác được dùng như là chứng âm 116 chủng vi khuẩn A baumannii

với kháng sinh đồ phân lập từ mẫu lâm sàng của bệnh viện Đại học Y Dược được dùng để đánh giá khi qui trình khi đã hoàn thành

Nồng độ DNA nhân tạo của các gen blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58

và 16S rRNA được xác định theo nồng độ cung cấp bởi nhà sản xuất (IDT)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Thu nhận các chủng A baumannii gây bệnh

Các chủng A baumannii được xác định bằng phương pháp phân lập

truyền thống với môi trường chuẩn

Cỡ mẫu cho nghiên cứu thử nghiệm qui trình được tính theo website: http://www.raosoft.com/samplesize.html với sai số (d) tối đa 5%, độ tin cậy

95% (Z=1.96), dân số khoảng 20.000 và tỷ lệ định danh vi khuẩn (p) A

baumannii 95% Cỡ mẫu được xác định là 72 mẫu

Công thức tính cỡ mẫu (n):

2.2.2 Phương pháp xác định tính nhạy cảm với kháng sinh

Chủng vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của β-lactam được xác

định bằng phương pháp tương tự, theo qui trình chuẩn, hiện đang sử dụng tại Bệnh viện Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh

Mẫu bệnh phẩm được nuôi cấy trên mồi trường BA&EMB (1) Nếu vi khuẩn mọc, tiến hành nhuôm Gram (2) Nếu là vi khuẩn Gram (-), tiếp tục thử

các phản ứng sinh hóa đặc trưng của A baumannii (3) Khi kết quả là TSI: glu(-), lac(-); Citrat: (+); SIM: (-); OF không dầu: (-) thì xác định chủng là A

baumannii Tiếp tục làm kháng sinh đồ (4)

(1) Phương pháp nuôi cấy trên môi trường BA & EMB

Phương tiện: mẫu bệnh phẩm, đèn Bunsen, vòng cấy, hộp petri môi

trường thạch máu (BA= Blood Agar), hộp petri môi trường EMB (Eosin Methylen Blue)

Các bước thực hiện: Dùng bút chì sáp chia đáy hộp thạch ra làm 4 phần

bằng nhau bằng cách kẻ chữ thập, đánh số mỗi phần từ 1-4 Dùng tay trái cầm vật chứa mẫu bệnh phẩm Tay phải cầm vòng cấy và hơ nóng đỏ trên ngọn đèn Busen Đợi vòng cấy nguội, nhúng vòng cấy vào vật chứa mẫu bệnh phẩm Đặt vòng cấy (có mẫu) vào mặt thạch của hộp petri (cả 2 loại môi trường BA, EMB) ở vùng số 1 Cấy vi khuẩn từ vùng 1 sang vùng 2 bằng cách chạm nhẹ đầu vòng cấy trên mặt thạch, kéo zig-zag từ vùng 1 sang vùng

2 Cấy khoảng 1/3 bán kính hộp thì dừng lại Đốt đỏ vòng cấy, để nguội Xoay hộp thạch 90o, để vùng 2-3 lên trên, đặt vòng cấy vào vùng 2, nơi đã cấy vi khuẩn, vạch zig-zag từ vùng 2 sang vùng 3, sau khi cấy được 1/3 bán kính hộp thạch, ta dừng lại Đốt đỏ vòng cấy, để nguội Xoay hộp thạch 90o,

để vùng 3-4 lên trên, đặt vòng cấy vào vùng 3, nơi đã cấy vi khuẩn, vạch zag từ vùng 3 sang vùng 4, lần này ta cấy trên khắp diện tích mặt thạch còn lại Cấy xong, đặt ngược hộp thạch đáy lên trên, nắp ở dưới, cho vào tủ ủ ấm

zig-37oC, hôm sau đọc kết quả

Cách đọc kết quả: Quan sát vi khuẩn bằng mắt ở vùng số 4, nơi có các

vi khuẩn nằm riêng lẻ Chú ý quan sát sự khác nhau giữa các khuẩn lạc, có

bao nhiêu khuẩn lạc khác nhau là có bấy nhiêu loại vi khuẩn hiện diện trên hộp thạch Mỗi loại khuẩn lạc khác nhau sẽ được đánh số và đem nhuộm Gram

(2) Phương pháp nhuộm Gram

Phương tiện: khuẩn lạc vi khuẩn, lame kính, bộ thuốc nhuộm Gram

(tím Gentian, lugol (iod 3%), cồn 95o, đỏ safranin

Các bước thực hiện: Lấy từng khuẩn lạc làm phết vi khuẩn trên lame

kính Phủ phẩm tím Gentian lên phết vi khuẩn 30 giây Rửa nước để loại bỏ phẩm thừa Phủ dung dịch lugol lên phết vi khuẩn 30 giây Rửa bằng cồn 10 giây Rửa nước để loại cồn thừa Phủ safranin lên phết vi khuẩn 30 giây Rửa nước Thấm khô lame Nhỏ một giọt dầu cèdre lên phết nhuộm Quan sát qua kính hiển vi với vật kính dầu

Cách đọc kết quả: Vi khuẩn nhuộm màu tím: Gram (+) Vi khuẩn

nhuộm màu đỏ: Gram (-)

(3) Phương pháp thử sinh hóa

Nuôi cấy vi khuẩn (giống phần 1) trên các loại môi trường khác nhau

và phải có kết quả như sau: TSI (triple sugar iron agar): glucose ), lactose ); Citrat: (+); SIM (sulfite-indole-motility): (-); OF (Oxidative Fermentative) không dầu: (-)

(-(4) Phương pháp làm kháng sinh đồ của Acinetobacter baumannii

Phương tiện: vi khuẩn Acinetobacter baumannii(chủng nhạy làm chủng

kiểm chứng và chủng bệnh phẩm), đĩa kháng sinh các loại (Pt, Tc, Cz, Co, Mem, Ak, Ne, Lv, Ci, Fr), môi trường BHI (Brain Heart), môi trường MHA (Muller Hinton Agar), tampon vô khuẩn, kẹp

Các bước thực hiện: Làm dịch huyền phù của vi khuẩn Acinetobacter baumannii trong môi trường BHI Dùng tampon vô khuẩn tẩm dịch vi khuẩn

trên, ép hết nước bằng cách đè tampon lên thành ống nghiệm Trải đều vi khuẩn lên mặt thạch bằng cách dùng tampon đã tẩm vi khuẩn đánh nhẹ lên

khắp mặt thạch từ trái sang phải, từ trên xuống dưới Để đảm bảo cho vi khuẩn được trải đều khắp trên mặt thạch, ta xoay hộp thạch 90o, một lần nữa đánh đều tampon lên khắp mặt thạch cũng từ trái qua phải, từ trên xuống dưới Bước cuối là kéo tampon theo vòng mặt rìa của hộp thạch Chờ mặt thạch khô Dùng kẹp hơ lửa, để nguội rồi lấy một đĩa kháng sinh cho mỗi loại, đặt nhẹ đĩa kháng sinh trên mặt thạch Các đĩa kháng sinh phải cách mép hộp thạch khoảng từ 2-2,5cm và cách nhau khoảng 2,5-3,5cm Phải đảm bảo mặt đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa kháng sinh, ủ ở 35oC± 2 trong 16-18 giờ

Cách đọc kết quả: Quan sát hộp thạch với dòng vi khuẩn kiểm chứng

(chủng nhạy): Vi khuẩn mọc tốt: môi trường nuôi cấy và làm kháng sinh đồ đạt yêu cầu Các đường kính vòng vô khuẩn đối với các kháng sinh đạt tiêu chuẩn qui định chứng tỏ các đĩa kháng sinh có chất lượng tốt và còn hiệu lực hoạt động Quan sát hộp thạch với dòng vi khuẩn của bệnh phẩm Vi khuẩn mọc trên khắp mặt thạch và làm đục mặt thạch Có 2 trường hợp xảy ra: (1) Xung quanh đĩa kháng sinh không có vòng vô khuẩn (thạch đục đến tận mép đĩa kháng sinh)  kết luận: vi khuẩn kháng với loại kháng sinh đó (2) Xung quanh đĩa kháng sinh có một vòng trong suốt, đó là vòng vô khuẩn, là nơi dưới tác động của kháng sinh vi khuẩn không tăng trưởng được  đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với tiêu chuẩn của CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), như sau: Nhạy cảm (Susceptible): đường kính ≥ 22mm; Trung gian (Intermediate): 17mm≤đường kính≤21mm

2.2.3 Thiết kế mồi và mẫu dò

Chúng tôi sẽ thiết kế mồi và mẫu dò phù hợp với chỉ tiêu đặc trưng của chúng Sự thiết kế và kiểm tra sản phẩm thiết kế được thực hiện bằng các phần mềm chuyên dụng như ClustalX, Bioedit, Annhyb, Oligo Analyzer, Oligo explorer, Oligo calculator và BLAST

Chỉ tiêu khi thiết kế mồi: Thiết kế mồi tập trung vào việc tạo sự cân

bằng giữa tính đặc hiệu và tính hiệu quả trong việc nhân bản sản phẩm đích

Có những thông số ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và tính hiệu quả của mồi như sau:

Chiều dài mồi: Tính đặc hiệu của mồi được điều khiển bởi chiều dài

của mồi Mồi được chọn tối ưu có kích thước từ 18-24 base

Nucleotide cuối của mồi: Vị trí đuôi 3’ của mồi đóng vai trò chủ chốt

trong việc hình thành sự bắt cặp nhầm, dẫn đến hiện tượng hình thành các sản phẩm không mong muốn Các mồi được thiết kế sao cho không có hiện tượng

bổ sung cho nhau đặc biệt là ở đầu 3’

Tỉ lệ GC và T m: Mồi PCR với 50% (G + C) thường có giá trị Tm trong khoảng 50-650C, cung cấp một ngưỡng nhiệt độ cho sự bắt cặp hiệu quả của mồi với mạch khuôn

Chiều dài sản phẩm PCR: Sản phẩm nhân bản giữa hai mồi có kích

thước khoảng 120 – 250 cặp base thì tối ưu cho real-time PCR

Chỉ tiêu khi thiết kế mẫu dò: Mẫu dò là những trình tự đặc trưng trong

một gene, bắt cặp hoàn hảo với trình tự mục tiêu, có khả năng phát hiện những khác biệt nhỏ trong trình tự gene Nguyên tắc chọn lựa mẫu dò như sau:

 Chiều dài mẫu dò phải từ 18-30 base Mẫu dò dài hơn sẽ làm thời gian lai dài hơn và hiệu suất tổng hợp thấp, mẫu dò ngắn hơn sẽ thiếu

sự đặc hiệu

 Thành phần GC nên trong khoảng 40-60% Tỉ lệ GC ngoài khoảng này có thể làm tăng sự lai không đặc hiệu

 Trong mẫu dò không nên có những vùng bổ sung cho nhau Chúng

có thể tạo cấu trúc kẹp tóc và sẽ ức chế sự lai với trình tự mục tiêu

 Tránh những trình tự chứa base giống nhau lặp lại hơn 4 base

 Tm của mẫu dò nên cao hơn Tm mồi 100C

2.2.4 Phương pháp tách chiết nucleic acide

DNA tổng số của các chủng vi khuẩn phân lập và chủng vi khuẩn lâm sàng trong mẫu bệnh phẩm được tách chiết theo phương pháp tách chiết bằng cột lọc, dựa trên nguyên tắc hấp phụ đặc hiệu DNA lên màng lọc silica Bộ kit tách chiết do công ty Khoa Thương sản xuất Tất cả các thao tác đều làm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.5 Phương pháp real-time PCR

Phương pháp real-time PCR được dùng để nhân bản và phát hiện các trình tự mục tiêu và thực hiện trong hệ thống máy real-time PCR CFX96TMcủa Bio-Rad hoặc MX3005P của Stratagene sử dụng các cặp mồi và mẫu dò được thiết kế chuyên biệt cho sự nhân bản các trình tự đích khác nhau

Phản ứng real-time PCR nhân bản các trình tự đích với thành phần đề

nghị như sau: 1X Apta Taq DNA polymerase (Roche), 200nM mỗi loại mồi,

100nM mỗi loại mẫu dò, 10µl DNA tách chiết và bổ sung nước cất hai lần đã khử trùng cho đủ 25µl

Chương trình real-time PCR đề nghị gồm 40 chu kỳ lập lại gồm 95oC trong 10 giây, 60oC trong 20 giây Sau khi phản ứng real-time PCR kết thúc, kết quả được phân tích trực tiếp trên máy tính kết nối với hệ thống real-time

PCR

2.2.5.1 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR

Mẫu DNA A baumannii chứng dương (ATCC 19606) được dùng để tối

ưu qui trình, cùng với các mẫu DNA A baumannii thực địa với các gene

tương ứng được giải trình tự

Tối ưu điều kiện nhân bản từng nhóm gene bla OXA và 16S rRNA

Từng cặp mồi và mẫu dò tương ứng với từng nhóm gene blaOXA và gene 16S rRNA được tối ưu để xác định điều kiện nhân bản tốt nhất như thành phần PCR, nhiệt độ lai của mồi và mẫu dò

Tối ưu điều kiện nhân bản đồng thời 3 gene bla OXA và 16S rRNA

Tổ hợp 4 cặp mồi/mẫu dò tương ứng với 3 gene blaOXA và 1 gene 16S rRNA được tạo điều kiện hoạt động trong cùng một phản ứng real-time PCR

để xác định điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng multiplex real-time PCR Cặp mồi 16S rRNA được tích hợp vào hệ thống nhằm kiểm soát kết quả phát hiện

Acinetobacter spp của qui trình, trong trường hợp các gen blaOXA âm tính

Điều kiện cho phản ứng nhân bản 4 gene được xây dựng dựa trên điều kiện đã tối ưu của phản ứng nhân bản từng gene Bên cạnh đó, nồng độ mồi

và mẫu dò trong phản ứng multiplex real-time PCR được khảo sát để tối ưu

sự nhân bản của 4 gene trong cùng một phản ứng

2.2.5.2 Đánh giá qui trình real-time PCR

Độ đặc hiệu

Qui trình real-time PCR được đánh giá độ đặc hiệu bằng DNA của các

vi khuẩn A baumannii có và không có gene blaOXA tương ứng và DNA của các vi khuẩn khác, kết hợp với giải trình tự gene tương ứng

Độ đặc hiệu phản ứng được chứng minh bằng cách tiến hành phản ứng

real-time PCR với mẫu DNA của A baumannii (ATCC 19606) và DNA của một số vi khuẩn khác: E.coli (ATCC 25922, 35218, 35401, 11775),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (ATCC

700603), Staphylococcus aureus (ATCC 12600), Listeria monocytogenes (ATCC 19115), Salmonella typhimurium (ATCC 29946)

Qui trình chỉ nên lên dương tính với DNA của A baumannii và không lên dương tính với DNA không phải của A baumannii

Ngưỡng phát hiện

Ngưỡng phát hiện của qui trình real-time PCR được xác định bằng mẫu

DNA A baumannii chuẩn (ATCC hoặc giải trình tự) đã biết trước nồng độ

Nồng độ DNA mẫu chuẩn khoảng 106–108 bản sao/μl, được pha loãng bậc 10 thành 6-8 nồng độ nhỏ hơn và xác định giới hạn phát hiện thấp nhất của qui trình Mỗi mẫu được chạy lập lại 3 lần Ngưỡng phát hiện đề nghị là 10-100 bản sao/phản ứng

Các thông số phản ứng xác định ngưỡng phát hiện của qui trình phải đạt thông số chuẩn của một phản ứng real-time PCR, cho từng cặp mồi và mẫu dò tương ứng

Ngưỡng phát hiện (Độ nhạy kỹ thuật) của qui trình được xác định là

nồng độ mẫu DNA mà tại đó phản ứng vẫn còn cho dương tính

Độ ổn định

Độ ổn định của qui trình real-time PCR được xác định theo hai chỉ tiêu: (1) các thời điểm thực hiện khác nhau và (2) người thực hiện khác nhau Đối với chỉ tiêu (1), quy trình được thực hiện bởi cùng một người tại 3 thời điểm

khác nhau trên 2 mẫu DNA A Baumannii, nồng độ thấp và nồng độ cao Đối

với chỉ tiêu (2), tối thiểu 3 người khác nhau thực hiện qui trình tại cùng một

thời điểm trên 2 mẫu DNA A baumannii, nồng độ thấp và nồng độ cao

Chỉ tiêu đánh giá độ ổn định qui trình là thông số phản ứng real-time PCR phải ổn định, không có sự sai biệt có ý nghĩa giữa các thời điểm thực hiện khác nhau và người thực hiện khác nhau

Động học phản ứng

Để xác định động học phản ứng của qui trình, các mẫu DNA có nồng

độ khác nhau, từ 101 – 108 bản sao/phản ứng, được chạy lập lại 3 lần với qui

trình đã tối ưu Khoảng nồng độ bản mẫu DNA vẫn cho giá trị dương tính ổn định ở cả 3 lần lập lại được xác định là động học phản ứng của qui trình

2.2.5.3 Thử nghiệm qui trình real-time PCR

Sau khi hoàn thành, qui trình real-time PCR sẽ được thử nghiệm trên

một số mẫu vi khuẩn A baumannii phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu từ

bệnh viện Kết quả hiện diện của nhóm gene blaOXA được khẳng định lại bằng phương pháp giải trình tự gene

2.2.5.4 Phương pháp giải trình tự gene

Trình tự các nhóm gene blaOXA đặc trưng của A baumannii được gửi

giải ở Hàn Quốc (Macrogen, Solgent) hoặc Singapore (1-BASE) theo phương pháp Sanger cải tiến

Các mẫu tế bào vi khuẩn A baumannii đã được giải trình tự, mang các

gene blaOXA-23, blaOXA-58 sẽ được dùng như đối chứng dương cho việc xây

dựng qui trình real-time PCR, bên cạnh mẫu A baumannii (ATCC 19606) có

chứa gene blaOXA-51 và DNA nhân tạo của các gen blaOXA-23, blaOXA-51,

bla

OXA-58 và 16S rRNA

Nghiên cứu đã giải trình tự các gen blaOXA-23, blaOXA-51, blaOXA-58

và 16S rRNA tương ứng hiện diện trong 5 chủng A baumannii thu thập từ

lâm sàng

3 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ

3.1 Thu thập chủng vi khuẩn

Đã thu thập 116 chủng vi khuẩn kèm theo thông tin kháng sinh đồ (phụ lục 1) từ các nguồn bệnh phẩm (máu, đàm, mủ, dịch cơ thể và nước tiểu) của bệnh nhân

Thống kê mô tả quẩn thể mẫu / bệnh nhân đã thu thập

Tuổi: Tuổi trung bình của quần thể là 67,2 ± 20,7 (Tuổitrung vị là 69,0), trong đó người có tuổi nhỏ nhất là 3 tuổi và người có tuổi lớn nhất là 103 tuổi

Giới tính: Tỉ lệ nam giới trong nghiên cứu cao hơn nữ giới Tỉ lệ nam

và nữ lần lượt là 54,3% (63/116) và 45,7% (53/116)

Nguồn mẫu bệnh phẩm: 5 loại mẫu bệnh phẩm được thu thập để phân

lập vi khuẩn bao gồm mẫu máu, đàm, mủ, dịch cơ thể và nước tiểu Tỉ lệ các loại mẫu lần lượt là 44,8% (52/116), 37,1% (43/116), 10,3% (12/116), 4,3% (5/116) và 3,4% (4/116) Như vậy, mẫu máu chiếm tỉ lệ cao nhất và mẫu nước tiểu chiếm tỉ lệ thấp nhất

Tóm tắt thông tin kháng sinh đồ (phụ lục 2)

Hình 3.1 Tỉ lệ nhạy/kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đã thu thập

Nhận xét: Đồ thị có tính đối xứng, lấy tỉ lệ nhạy/kháng kháng sinh

Mem (meropenem) làm trung tâm (50.9/49.1) Các kháng sinh Tc, Cx, Nel và

Ak có tỉ lệ kháng trên 60%; kháng sinh Cz có tỉ lệ kháng trên 50%; các kháng sinh Cip và Lv có tỉ lệ kháng xấp xỉ 40% và các kháng sinh còn lại như Pt, Cs

và Co có tỉ lệ kháng dưới 40%

3.2 Thiết kế mồi và mẫu dò

Mồi và mẫu dò dùng trong nghiên cứu được thiết kế dựa trên các trình

tự bảo tồn đặc trưng cho từng nhóm nhóm gene đích và được kiểm tra tính đặc hiệu và chính xác trong nhân bản bằng giải trình tự gene Mồi và mẫu dò nhằm phát hiện các trình tự đặc trưng của 3 nhóm gene blaOXA-23, -51 và -58

đặc trưng cho A baumannii và gene 16S rRNA đặc trưng cho Acinetobacter

spp

Các chủng A baumannii được dùng để thiết kế mồi và mẫu dò được thể

hiện chi tiết trong phụ lục 3

Bảng 3.1 Trình tự các mồi được thiết kế

Kích thước mồi (bp)

Tm mồi ( o C)

Kích thước sản phẩm (bp)

3.3 Tối ưu điều kiện phản ứng real-time PCR

Phản ứng real-time PCR để phát hiện các nhóm gene blaOXA-23,

bla

OXA-51, blaOXA-58 và 16S rRNA được tối ưu điều kiện phản ứng để hiệu