Xây dựng quy trình RT realtime PCR nhằm phát hiện virus sởi khóa luận tốt nghiệp đại học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH RT-REALTIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN VIRUS SỞI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VS - SHPT CBHD: ThS Cao Bảo Hiền SVTH: Trần Đại Hiệp MSSV: 1153010260 Khóa: 2011 - 2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập tại trƣờng em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ từ quý Thầy Cơ, gia đình bạn bè Em xin chân thành cảm ơn đến thầy Cao Bảo Hiền, cô Nguyễn Thụy Dạ Thảo, Trƣơng Thị Kim Phƣợng tận tình giúp đỡ, quan tâm, trực tiếp hƣớng dẫn em suốt trình làm đề tài thực tập Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh q thầy Khoa Công Nghệ Sinh học trƣờng Đại Học Mở Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em suốt trình học tập tại trƣờng Em xin chân thành cảm ơn đến Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á hỗ trợ em suốt trình làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chị Hồ Thị Tây dành thời gian giúp đỡ, dẫn, góp ý cho em suốt thời gian thực tập Em xin cảm ơn giúp đỡ anh chị phòng R&D Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, nhờ có anh chị mà em có thêm nhiều kĩ phịng thí nghiệm Cuối xin tỏ lòng biết ơn tới ba mẹ, ba mẹ sinh thành nuôi nấng nên ngƣời, động viên, giúp đỡ suốt thời gian học tập, thực hiện đề tài Trân trọng Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 05 năm 2015 Sinh viên thực hiện (Kí ghi rõ họ tên) Trần Đại Hiệp SVTH: Trần Đại Hiệp Trang iii KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT BLAST Bacsic local alignment tool Bp Base pair cDNA Complementary acid DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs 2'deoxy nucleotide 5'triphosphate ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay F Fusion H Hemagglutinin N Nucleoprotein NCBI National Center for Biotechnology Information P Polymerase RNA Ribonucleic acid RT Reverse transcirptase Tm Temperature melting SVTH: Trần Đại Hiệp Trang v KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP MỤC LỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần protein virus sởi chức Bảng 1.2 Phân bố số trƣờng hợp mắc sởi kết xét nghiệm theo khu vực tháng đầu năm 2014 17 Bảng 1.3 Các reporter đƣợc nhà nghiên cứu sử dụng với bƣớc sóng kích thích, huỳnh quang phát quencher tƣơng ứng 23 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi, mẫu dò 39 Bảng 3.2 Kết đặc tính cặp mồi mẫu dò 40 Bảng 3.3 Năng lƣợng tự cấu trúc Hetero-Dimer (kcal/mol) cặp mồi MV 40 Bảng 3.4 Trình tự sản phẩm Realtime-PCR 46 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ nhạy quy trình 48 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ nhạy quy trình 49 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ mồi mẫu dò virus sởi 51 Bảng 3.8 Kết quy ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm 52 SVTH: Trần Đại Hiệp Trang vi KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP MỤC LỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.2 Phân bố trƣờng hợp mắc sởi tháng đầu năm 2014 17 Biểu đồ 1.3 Phân bố ca sởi theo tuổi, từ ngày 1/1 đến 6/4/2014 18 Biểu đồ 1.4 Số trƣờng hợp sởi theo tình trạng tiêm chủng, tháng đầu năm 2014 18 SVTH: Trần Đại Hiệp Trang vii KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc virus sởi Hình 1.2 Dấu hiệu hạt Koplik 11 Hình 1.3 Ban sởi toàn thân 12 Hình 1.4 Bản đồ phân bố mắc sởi giới (tháng 2/2013-1/2014) 14 Hình 1.5 Bản đồ phân bố chủng virus sởi giới, năm 2013 15 Hình 1.6 Bản đồ phân bố chủng virus sởi, 2013 - tháng/2014 16 Hình 1.7 Ba bƣớc hoạt động chu kì phản ứng PCR 21 Hình 1.8 Tóm tắt chế hoạt động Taqman probe Real-time PCR 24 Hình 3.1 Kết kiểm tra bắt cặp cặp mồi, mẫu dị lên trình tự bảo tồn vùng gene N 41 Hình 3.2 Kết BLAST mồi xuôi MV 42 Hình 3.3 Kết BLAST mồi ngƣợc MV 42 Hình 3.4 Kết BLAST mẫu dò MV 43 Hình 3.5 Thí nghiệm Realtime PCR kiểm tra hoạt động mồi, mẫu dò virus sởi 44 Hình 3.6 Hiệu nhân cặp mồi MVF - MVR 45 Hình 3.7 Kết giải trình tự sản phẩm Realtime-PCR 46 Hình 3.8 Kết BLAST trình tự sản phẩm Realtime PCR 46 Hình 3.9 Kết gióng cột trình tự sản phẩm Realtime-PCR với trình tự chuẩn 47 Hình 3.10 Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu hệ mồi, mẫu dò virus sởi đƣợc đánh dấu màu FAM 47 Hình 3.11 Đồ thị khảo sát độ nhạy quy trình 48 Hình 3.12 Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi, mẫu dò đƣợc đánh dấu màu FAM 50 Hình 3.13 Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò virus sởi đƣợc SVTH: Trần Đại Hiệp Trang viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP đánh dấu màu FAM 50 Hình 3.14 Kết ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm 52 Hình 4.1.Hình ảnh giá trị lƣợng tự cấu trúc hetero-dimer mồi xuôi mồi ngƣợc i Hình 4.2 Hình ảnh giá trị lƣợng tự cấu trúc hetero-dimer mồi xuôi mẫu dò i Hình 4.3 Hình ảnh giá trị lƣợng tự cấu trúc hetero-dimer mồi ngƣợc mẫu dò i SVTH: Trần Đại Hiệp Trang ix KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN III DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT V MỤC LỤC CÁC BẢNG VI MỤC LỤC CÁC BIỂU ĐỒ VII MỤC LỤC CÁC HÌNH VIII ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN 1.1 BỆNH SỞI 1.1.1 Đại cƣơng bệnh sởi 1.1.2 Đặc điểm dịch tễ bệnh sởi 1.2 VIRUS SỞI 1.2.1 Cấu tạo 1.2.2 Quá trình nhân lên virus sởi 1.3 LÂM SÀNG VỀ BỆNH SỞI 10 1.3.1 Thể điển hình .10 1.3.2 Các thể lâm sàng đặc biệt 12 1.3.3 Chẩn đoán bệnh sởi 13 1.4 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH 14 1.4.1 Tình hình bệnh sởi giới 14 1.4.2 Tình hình bệnh sởi tại Việt Nam 16 1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN .19 1.5.1 Phƣơng pháp ELISA 19 1.5.2 Phƣơng pháp RT Realtime-PCR 20 1.6 SƠ LƢỢC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS SỞI BẰNG KỸ THUẬT RT REAL TIME PCR .28 1.6.1 Trên giới 28 1.6.2 Ở nƣớc 29 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31 2.2 VẬT LIỆU 31 2.2.1 Mẫu 31 2.2.2 Mồi mẫu dò .31 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 31 2.2.4 Hóa chất .32 2.3 PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 32 2.3.1 Phƣơng pháp thiết kế mồi 32 2.3.2 Phƣơng pháp xử lý mẫu .33 2.4 PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT RNA .33 2.4.1 Nguyên tắc 33 2.4.2 Phƣơng pháp tiến hành 34 SVTH: Trần Đại Hiệp Trang x KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2.5 PHƢƠNG PHÁP RT- REALTIME PCR 35 2.5.1 Cách tiến hành phản ứng RT 35 2.5.2 Cách tiến hành phản ứng Realtime PCR 35 2.6 PHƢƠNG PHÁP KIỂM TRA KHẢ NĂNG HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ MỒI VÀ MẪU DÒ 35 2.7 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘ LAI TỚI ƢU CỦA QUY TRÌNH 35 2.8 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY CỦA QUY TRÌNH 36 2.9 KHẢO SÁT ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA HỆ MỒI VÀ MẪU DÒ 36 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỒI, MẪU DÒ TRÊN LÝ THUYẾT 39 3.1.1 Thiết kế mồi, mẫu dò 39 3.1.2 Kết thiết kế mồi khảo sát đặc tính mồi 39 3.1.3 Kết khảo sát độ đặc hiệu mồi 40 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CẶP MỒI, MẪU DÒ TRÊN THỰC TẾ 43 3.2.1 Kết khảo sát hoạt động hệ mồi 43 3.2.2 Kết giải trình tự .44 3.2.3 Kết khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu cặp mồi, mẫu dò 47 3.2.4 Kết khảo sát độ nhạy quy trình .48 3.2.5 Kết kiểm tra độ đặc hiệu hệ mồi, mẫu dò .49 3.3 KẾT QUẢ ỨNG DUNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU BỆNH PHẨM 51 PHẦN 4.1 4.2 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC I SVTH: Trần Đại Hiệp Trang xi KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ Virus sởi (measles virus) thuộc chi Morbillivirus, họ Paramyxoviridae, tác nhân gây bệnh nhiễm sởi cấp ngƣời Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm 2008 toàn cầu có 164.000 trƣờng hợp chết sởi, chủ yếu trẻ dƣới tuổi nƣớc phát triển[19] Sởi bệnh truyền nhiễm cấp tính với triệu chứng sốt, phát ban, chảy nƣớc mũi, ho, mắt đỏ, thƣờng gặp trẻ em nhƣng gặp ngƣời lớn chƣa có miễn dịch gây thành dịch[1, 20] Các biến chứng sởi gặp là: viêm tai giữa, viêm phổi, tiêu chảy, khô loét giác mạc viêm não sau sởi, đặc biệt trẻ em suy dinh dƣỡng, dẫn đến tử vong[17, 19] Vì vậy, việc xây dựng quy trình phát hiện nhanh, xác tác nhân gây bệnh sởi cần thiết Hiện nay, việc chẩn đoán nhiễm virus sởi thƣờng dựa vào phƣơng pháp miễn dịch enzyme (ELISA, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) phát hiện kháng thể IgM phase cấp phase phục hồi[7, 19] Bên cạnh đó, phát hiện nhiễm virus sởi phƣơng pháp phân lập virus sởi việc phát hiện RNA virus sởi từ mẫu bệnh phẩm dịch tiết mũi-hầu, máu nƣớc tiểu (ngày 0-5 kể từ phát ban)[21] Tuy nhiên, phƣơng pháp phát hiện IgM có nhƣợc điểm khơng phân tích đƣợc kiểu gene virus sởi không phát hiện đƣợc IgM trƣờng hợp bị nhiễm virus sởi[1, 7] Chính vậy, việc phát hiện sớm xác bệnh sởi cấp thiết việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng Nghiên cứu Hummel cộng (2006) ghi nhận kỹ thuật real-time RT-PCR (quantitative gene-specific real-time Reverse transcription-PCR assays) phù hợp với việc định tính virus sởi mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ họng, dựa gene N (nucleoprotein), F (fusion) H (hemagglutinin) Kết nghiên cứu minh chứng quy trình RT-Realtime PCR có độ nhạy tƣơng ứng với gene mục tiêu, lần lƣợt 100%, 93%, 82% có độ đặc hiệu 100%[8] Nghiên cứu Akiyama cộng (2009) xây dựng quy trình phát SVTH: Trần Đại Hiệp Trang KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP 10 µl hỗn hợp RT (Primer, dNTPs, Enzyme Reverse transcriptase, MgCl2, nƣớc cất vô trùng) cho vào eppendorf 0,2 ml Đậy nắp eppendorf thật kĩ cho vào máy luân nhiệt Lập trình cho máy luân nhiệt hoạt động: 25oC phút, 42oC phút, 85oC phút, giữ 4oC Sau cDNA thu đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime-PCR Thành phần phản ứng Realtime-PCR: - 12.5 µl Master mix - 0.5 mồi - 2.5 cDNA (dịch cDNA từ phản ứng RT trên) - Thêm nƣớc Bio-pure cho đủ thể tích 25 µl/phản ứng Phản ứng đƣợc thực hiện theo chƣơng trình luân nhiệt đƣợc trình bày phần II, mục 2.5.2, tỉ lệ mồi mẫu dị 1:1 Hình 3.5 Thí nghiệm Realtime PCR kiểm tra hoạt động mồi, mẫu dò virus sởi Kết thí nghiệm Realtime PCR cho kết dƣơng tính (Ct = 24,69) mẫu virus sởi, mẫu chứng âm (nƣớc cất) cho kết âm tính 3.2.2 Kết giải trình tự Mẫu lên dƣơng tính kiểm tra hoạt động mồi đƣợc điện di để kiểm tra SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP vạch sản phẩm Giếng 1: Mẫu chứng dƣơng Giếng 2: Thang 100 bp Giếng 3: Mẫu chứng âm 74 bp Hình 3.6 Hiệu nhân cặp mồi MVF - MVR Kết điện di gel agarose cho thấy: có vạch sản phẩm với kích thƣớc nhƣ mong đợi (74 bp) mẫu chứng dƣơng, mẫu chứng âm khơng có sản phẩm khuếch đại Khơng thấy xuất hiện vạch kí sinh mẫu chứng dƣơng (Hình 3.6) Chúng tơi sử dụng kĩ thuật giải trình tự để khẳng định sản phẩm đƣợc khuếch đại trình tự mục tiêu Kết nhận đƣợc đƣợc so sánh với trình tự chuẩn đƣợc cơng bố GeneBank thông qua phần mềm ClustalX Đồng thời sử dụng chƣơng trình BLAST NCBI để tìm kiếm trình tự tƣơng đồng với đoạn trình tự mà chúng tơi nhân đƣợc Kết có đƣợc từ so sánh ClustalX tìm kiếm NCBI cho phép kết luận khả hoạt động hệ mồi mẫu dò sản phẩm Realtime-PCR thu đƣợc Sau sản phẩm Realtime-PCR đƣợc gửi đến công ti Macrogen để giải trình tự, chúng tơi đƣợc kết nhƣ sau: SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 45 KHÓA LUẬN TỚT NGHIỆP Hình 3.7 Kết giải trình tự sản phẩm Realtime-PCR Bảng 3.4 Trình tự sản phẩm Realtime-PCR Trình tự sản phẩm Realtime PCR Kích thƣớc AGGATCACCGATGACCCTGACGTTAGCATCAGGCTG TTAGAGGTTGTTCAGAGTGACCAGTCACAATCTGGCC 74 nu TTA Sau BLAST NCBI, có kết nhƣ sau: Hình 3.8 Kết BLAST trình tự sản phẩm Realtime PCR SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 46 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP Hình 3.9 Kết gióng cột trình tự sản phẩm Realtime-PCR với trình tự chuẩn Kết cho thấy sản phẩm Realtime PCR chúng tơi hồn tồn tƣơng đồng với chủng virus sởi giới GeneBank 3.2.3 Kết khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu cặp mồi, mẫu dị Ở thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lai nhằm xác định nhiệt độ lai tối ƣu, mà mồi, mẫu dị hoạt động tốt nhất, cho tín hiệu huỳnh quang vƣợt ngƣỡng (Ct) sớm rõ ràng Hình 3.10 Đồ thị khảo sát nhiệt độ lai tối ƣu hệ mồi, mẫu dò virus sởi đƣợc đánh dấu màu FAM SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 47 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP Bảng 3.5 Kết khảo sát độ nhạy quy trình Giếng/ A1/ B1/ C1/ D1/ E1/ F1/ G1/ H1/ H2/ Mẫu (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (-) 65,0 64,5 63,3 61,4 58,9 57,1 55,8 55,0 55,0 26,39 26,36 25,48 24,69 24,82 23,56 23,71 23,03 Nhiệt độ (oC) Tín hiệu ngƣỡng No Ct (Ct) Khảo sát nhiệt độ lai từ 65-55oC virus sởi cho thấy, 55oC cho tín hiệu huỳnh quang vƣợt ngƣỡng sớm (Ct = 23,03) Nên nhiệt độ 55oC đƣợc đánh giá nhiệt độ lai tối ƣu mồi, mẫu dò virus sởi 3.2.4 Kết khảo sát độ nhạy quy trình Sau có nhiệt độ lai tối ƣu quy trình, chúng tơi tiếp tục khảo sát độ nhạy quy trình Chúng tơi dùng mẫu dƣơng nồng độ 107 copies/ml đem pha loãng thành nhiều nồng độ thực hiện phản ứng multiplex realtime-PCR với nhiệt độ lai 55oC Hình 3.11 Đồ thị khảo sát độ nhạy quy trình SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 48 KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.6 Kết khảo sát độ nhạy quy trình Giếng B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 Nồng độ (copies/ml) 107 106 105 104 103 102 10 Chất phát huỳnh quang FAM FAM FAM FAM FAM FAM FAM 13,02 17,91 21,30 27,06 31,62 34,92 No Ct Tín hiệu ngƣỡng (Ct) Mỗi phƣơng pháp xét nghiệm có giới hạn độ nhạy Khảo sát độ nhạy quy trình multiplex realtime- PCR cho thấy, nồng độ thấp mà quy trình cịn cho kết dƣơng tính 102 copies/ml (Ct = 34,92) Vậy quy trình chúng tơi có độ nhạy 102 copies/ml 3.2.5 Kết kiểm tra độ đặc hiệu hệ mồi, mẫu dò Một phƣơng pháp đƣợc xem có độ tin cậy cao ngồi việc có độ nhạy cao cịn phải có độ đặc hiệu cao Do mồi mẫu dị chúng tơi thiết kế phải đặc hiệu, khuếch đại trình tự DNA virus đích virus sởi, khơng có phản ứng khuếch đại với chủng vi sinh vật khác Nên chúng tơi bố trí thí nghiệm gồm chứng dƣơng virus Human papilomavirus (HPV), vi khuẩn lao (MTB), Cytomagalovirius (CMV), Hepatitis B virus (HBV), Epstein-Barr virus (EBV), mẫu chứng dƣơng DNA virus sởi mẫu chứng âm (nƣớc cất) Tuy nhiên, để chắn mẫu vi khuẩn chứng chủng vi khuẩn ta cần khảo sát chúng tơi cịn cho chạy đồng thời thêm phản ứng chủng vi khuẩn với hệ mồi, mẫu dò đặc hiệu chúng để làm đối chứng SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 49 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP Hình 3.12 Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi, mẫu dò đƣợc đánh dấu màu FAM Đồ thị hình 3.11 cho thấy, mẫu chứng dƣơng với hệ mồi đặc hiệu chúng cho kết dƣơng tính, chứng minh mẫu chứng dƣơng ta dùng chủng vi khuẩn cần khảo sát Các mẫu chứng virus, CMV, HPV, HBV, EBV, MTB cho kết âm tính với hệ mồi, mẫu dị virus sởi Hình 3.13 Đồ thị kiểm tra độ đặc hiệu với hệ mồi mẫu dò virus sởi đƣợc đánh dấu màu FAM SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 50 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.7 Kết khảo sát độ đặc hiệu hệ mồi mẫu dò virus sởi Mồi, mẫu dò virus Chủng virus sởi Pimer-probe chuyên Đánh dấu màu biệt cho virus FAM Virus sởi 29,03 23,03 HPV No Ct 21,18 HBV No Ct 28,94 CMV No Ct 28,17 EBV No Ct 31,59 MTB No Ct 32,58 Chứng âm (nƣớc cất) No Ct No Ct Kết khảo sát độ đặc hiệu cho thấy, có mẫu chứa virus sởi cho kết dƣơng tính với mồi mẫu dị mà chúng tơi khảo sát Nhƣ mồi, mẫu dị chúng tơi có độ đặc hiệu cao với virus sởi, độ đặc hiệu đạt 100% 3.3 KẾT QUẢ ỨNG DUNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU BỆNH PHẨM Sau xây dựng quy trình Realtime-PCR, tiến hành ứng dụng quy trinh mẫu bệnh phẩm mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập xét nghiệm ban đầu phƣơng pháp ELISA PCR Kết ứng dụng quy trình đƣợc trình bày đƣợc tóm tắt, thống kê lại bảng dƣới đây: SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 51 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP Hình 3.14 Kết ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm Bảng 3.8 Kết ứng dụng quy trình mẫu bệnh phẩm Tên mẫu Realtime PCR virus sởi Ct Phƣơng pháp ELISA, PCR + 19,47 + + 34,59 + - No Ct - + 29,98 + + 34,58 + + 34,48 + + 34,78 + - No Ct - Tổng hợp kết từ bảng cho thấy, quy trình mà chúng tơi ứng dụng mẫu bệnh phẩm cho kết trùng khớp hoàn toàn với kết xét nghiệm phát hiện virus sởi ban đầu Từ chúng tơi cho thấy, quy trình phát hiện virus sởi chúng tơi xây dựng có độ đặc hiệu cao, xác, mà cịn tiết kiệm thời gian để phát hiện virus sởi SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 52 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 53 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 4.1 KẾT LUẬN Qua thời gian thực hiện đề tài, đánh giá mồi mẫu dò phát hiện virus sởi từ tài liệu qua thừa hƣởng lại mồi mẫu dị Hummel cộng Từ đó, tơi tiếp tục xây dựng thành cơng quy trình phát hiện virus sởi phƣơng pháp Realtime PCR Quy trình có độ nhạy 102 copies/ml có nhiệt độ lai tối ƣu cho phản ứng 55oC, độ đặc hiệu đạt 100% Đồng thời khảo sát quy trình mẫu bênh phẩm cho kết xét nghiệm xác, trùng khớp với kết xét nghiệm ban đầu phƣơng pháp ELISA PCR 4.2 KIẾN NGHỊ Từ kết thu đƣợc trên, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Để tăng khả tin cậy thí nghiệm ý nghĩa thống kê, chúng tơi xin đề nghị tăng số lƣợng mẫu bệnh phẩm thí nghiệm - So sánh quy trình Realtime-PCR chúng tơi xây dựng với phƣơng pháp ELISA PCR phát hiện virus sởi - Thử thêm tính đặc hiệu với chủng: mà chƣa thu thập đƣợc mẫu SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 54 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Phạm Văn Ty, (2005), Virus học, Nhà xuất giáo dục, Trang 214 - 218 Nguyễn Trần Chính, (2008), Bệnh truyền nhiễm, Nhà xuất y học, Trang 274 – 280 Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, (1998) Sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục, Trang 190 – 199 Phạm Hùng Vân, (2009), PCR Real-time PCR Các vấn đề áp dụng thường gặp, Nhà xuất y học, Trang 9-67 Lê Trần Binh, (2009), Cơ sở công nghệ sinh học tập 1, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, Trang 126-143 Quyền Đình Thi, (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, Nhà xuất khoa học tự nhiên cơng nghệ TIẾNG NƢỚC NGỒI Akiyama M., Kimura H., Tsukagoshi H., (2009), Development of an assay for the detection and quantification of the measles virus nucleoprotein (N) gene using real-time reverse transcriptase PCR, J Med Microbiol Vol 58(5), pp 638-643 Hummel KB., Lowe L., Bellini WJ., Rota PA., (2006) Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens, J Virol Meth ; Vol 132(1-2), pp 166-173 Mackay, I., K E Arden, and A Nitsche., (2002) Real-time PCR in virology Nucleic Acid RES 30: 10 Bustin, S A, (2002) Absolute quantification of mRNA using real-time reverse-transcription polymerase chain reation assays, J Mol Endocrinol 25: 11 Horoko Shimizu and et al, (1993), Polymerase Chain Reaction for Detection of Measles Virus in Clinical Samples, J Clical Microbiology: Vol 31, pp 1034-1039 12 Kyoko Aikoshi and et al, (2010), Reevaluation of Laboratory methods for diagnosis of Measles, J Infect, Vol 63, pp 225-228 13 Jennifer D Boddicker and et al,(2007), Real-tim reverse transcription-PCR SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 55 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP assay for mumps virus RNA in Clinical specimens, J Clinical Mirobiology, pp 2902-2908 14 Paul A Rota and et al, (1995), Detection of Measles virus RNA in Urine Specimens from Vaccine Recipients, J Clinical Mirobiology, Vol 33, pp 2485-2488 15 Nakayama T and et al, (1995), Detection of measles virus genome directly from clinical samples by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and genetic variability, J Virus Res, Vol 31, pp 1-16 16 Sonoda S and et al, (2001), Detection of measles virus genome in lymphocytes from asymptomatic healthy children, J Med Virol, Vol 65, pp 7-381 INTERNET 17 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 18 http://www.moh.gov.vn/news/pages/phongchongdichsoi.aspx?ItemID=552 19 http://www.moh.gov.vn/news/pages/phongchongdichsoi.aspx?ItemID=555 20 http://benhnhietdoi.vn/tin-tuc/Benh-nhiet-doi/benh-soi_7835.html 21 www.nihe.org.vn/new-vn/dao-tao-ngan-han tap-huan-412312272/512/Cac-p huong-phap-co-ban-trong-chan-doan-virus-gay-benh.vhtm 22 https://sg.idtdna.com/calc/analyzer 23 http://www.who.int/en/ 24 http://vncdc.gov.vn/PrintPage.aspx?id=289 25 http://www.yhth.vn/tochucytethegioicongbobaocaodichsoitoancau_d3138.asp x 26 http://www.tapchiyhocduphong.vn/vi/tap-chi-y-hoc-du-phong/2012/08/81E2 1038/chan-doan-nhiem-virus-soi-bang-mau-benh-pham-nuoc-bot/ 27 http://jcm.asm.org/ 28 http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 29 http://www.ppdictionary.com/viruses/measles.htm 30 http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n12/box/nrmicro1550_BX1.html 31 http://www.benhviennhi.org.vn/news/detail/1217/benh-soi-trieu-chung bienchung-va-cach-cham-soc-cho-be.html 32 http://www.tapchiyhocduphong.vn/vi/tap-chi-y-hoc-du-phong/2012/08/81E2 SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 56 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1038/chan-doan-nhiem-virus-soi-bang-mau-benh-pham-nuoc-bot/ 33 http://www.case.vn/vi-VN/34/96/114/details.case SVTH: Trần Đại Hiệp Trang 57 KHĨA LUẬN TỚT NGHIỆP PHỤ LỤC Hình 4.1.Hình ảnh giá trị lƣợng tự cấu trúc hetero-dimer mồi xi mồi ngƣợc Hình 4.2 Hình ảnh giá trị lƣợng tự cấu trúc hetero-dimer mồi xi mẫu dị Hình 4.3 Hình ảnh giá trị lƣợng tự cấu trúc hetero-dimer mồi ngƣợc mẫu dò SVTH: Trần Đại Hiệp Trang i ... virus sởi Thảm khảo cơng trình nghiên cứu phƣơng pháp Realtime PCR đƣợc xem có khả phát hiện nhanh xác virus sởi nên chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình phát hiện virus sởi phƣơng pháp RT. .. Dựa vào sở khoa học nêu trên, đƣợc cho phép công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, thực hiện chuyên đề thực tập tốt nghiệp "XÂY DỰNG QUY TRÌNH RT- REAL TIME PCR NHẰM PHÁT HIỆN VIRUS SỞI" SVTH: Trần... SƠ LƢỢC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS SỞI BẰNG KỸ THUẬT RT REAL TIME PCR 1.6.1 Trên giới RT- PCR phƣơng pháp đơn giản có độ nhạy cao việc phát hiện gene virus sởi việc khuếch đại