TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ma Oe? Dé tai:
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DUNG NAM TRICHODERMA SPP
DE PHAN HUY GO CAY DO BAU
KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ VI SINH
GVHD: TS LE THI THANH MAI SV: PHAN TRAN THANH THAO NIEN KHOA: 2004 — 2008 |
Trang 2DANH MỤC CÁC BẢNG - Bảng 1: Bảng đường chuẩn Albumin
- Bảng 2: Bảng đường chuẩn glucose
` Bảng 3; Bảng tóm tắt |
: Bảng 4: Bảng vòng phân giải các enzyme
Bảng 5: Số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù với khảo sát độ âm Bảng 6: Số lượng bào tử trong 1 ml địch huyền phù với khảo sát pH
- Bảng 7: Số lượng bào tử trong 1 ml dich huyền phù với khảo sát nồng độ dinh dưỡng Bảng 8: Số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù với khảo sát thời gian nuôi cấy Bảng 9: Số lượng bào tử có trong 1 ml huyền phù của nhân giống cấp I và nhân: giống cấp 2:
Bang 10: Ham lượng protein và hoạt tính CMCase với khảo sát độ âm
Bảng 11: Hàm lượng protein và hoạt tính CMCase với khảo sát pH
Bảng 12: Hàm lượng protein và hoạt tính CMCase với khảo sat nồng độ dinh
dưỡng
Bảng 13: Hàm lượng protein và hoạt tính CMCase với khảo sát tỷ lệ giống
Bảng 14: Hàm lượng protein và hoạt tính CMCase với khảo sát thời gian
Trang 3DANH MỤC CÁC ĐỎ THỊ
“Đồ thị 1: Vòng phân giải các enzyme cia Trichoderma harzianum `
| Đồ thị 2: Ảnh hưởng độ âm tới sự sinh trưởng và phát triển của 7richoderma harzianum | Đồ thị 3: Ảnh hưởng pH tới sự sinh trưởng và phát triển của Trichoderma harzianum | Đề thị 4: Ảnh hưởng nồng độ dinh dưỡng tới sự sinh trưởng và phát triển của Trichoderma harzianum Đồ thị 5: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới sự sinh trưởng và phát triển của Trichoderma harzianum
Đồ thị 6: So sánh giữa hai cấp nhân giống
Trang 4DANH MỤC HÌNH ẢNH
_:Hình I : Cấu trúc Cellulose
: Hinh 2: Dai thé cia Trichoderma harzianum
Hinh 3: Vi thé của 7¡ richoderma harzianum Hình 4: vòng phân giải của cellulase
Trang 5DANH MUC VIET TAT VA KY HIEU
PGA : Potato Gucose Agar
DNS : 2 — hydroxy — 3,5 — dinitrobenzoic acid ox : lần nồng độ dinh dưỡng
Trang 6MỤC LỤC
- ĐẶT VẤN ĐỶ .ceeeereeerreriirriiirerrrrrrrriirnnsennnenrnerrreoaee Í — PHAN 1: TỎNG QUAN - << reo se 4
1.1 GIỚI THIỆU VẺ CÂY DÓ BẦU, TRAM HUONG VA MOT SO PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT TINH DẦU: 2- 5° se csecse 5 1.1.1 Cây Dó Bầu: wee — 5 1.1.2 Trầm hương: . s-< seo vs sse xsc+seevseersevseersee 6 1.1.3 Mộtsố phương pháp sản xuất tỉnh đầu: s- so so so cses 7 1.2 CELLULOSE VA ENZYME CELLUULASE: 5-s° << se<s 9 59 9
1.2.2 EnzyImme C€ÌÏUÌ¿4S€: .s s65 sS5 s93 9° SES9585.985.995.989595865699565554 11
1.3 TRÌCHODERÌM/1 (SP) oi H996 0016 96843940840908989908589509561505866 17
1.3.1 Phân loại và đặc điểm hình thái: «seccessseseseesssee 17
1.3.2 Dac diém sinh ly, sinh hoá: ee uy 18 1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng của TTỈCÏL0/l6FHIN: - 4< cee«sessesesessecseees 19 1.3.4 Các nghiên cứu ảnh hưởng của Triehoderma đối với môi trường:22 ˆ 1.3.5 Chung Trichoderma harzianum: Mandl, cccessvesenccsecccneseserssensonecenscoesonees 22 1.4 THANH PHAN MOI TRUONG NUOI CAY VA CAC DIEU KIEN ANH
HUONG DEN VI SINH VAT TONG HOP CELLULASE: : 23 1.4.1 Thanh phần môi trường nuôi 7 23 1.4.2 Các yếu tổ ảnh hướng đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh tổng
hợp enzyme Của VỈ SỈnÏI VẬY: .o <5 c5 cs n2 59555558956856858555 25
PHAN 2: VAT LIEU VA PHUONG PHAP THUC NGHIỆM 31 "5A Z.vWH00009.10 0061777 32 2.1.1 NẤm SỢÏÍ: os se se t9 EEEEseEeeseeersereee 32 2.1.2 Cơ chất: ccccessS2 Le m0 32 2.1.3 Thiết bị dụng Cụ: - << se +k*SeEEeekseEEseveeerstersereepre 32 2.2 ):10198)19):000)), 010177 33
2.2.1 Phương pháp mô tả hình thái 7¡ richoderma H(IFZÍHHHH: «<5 33 2.2.2 Đo đường kính vòng phân giải một số enzyme cua Trichoderma
NAZIAHUING w.essssssssessseevesessssscossnccscseccassnscensenscsasenssacsaesecssesneesseassasessseses 34 2.2.3 Khao sat diéu kién nudi cAy nam méc Trichoderma hazianum: 36 (2.2.4 Khao sát điêu kiện ảnh hưởng đên qua trinh sinh tong hop enzyme
cellulase của Trichoderma Narzidnuins srcccccccccsssesssssecccscccccccssssccescecs 42
Trang 7PHAN 3: KET QUA NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 QUAN SAT HINH THAI DAI THE VA VI THE CUA TRICHODERMA V/Zÿ 7/0/00 S 31 54
° 3.1.1 Quan sat dai tHes ceccessessssssessecsesssssscssssssssesscssssvscssssscsscesecsesesseercsesses 54
30.2 Quan SAt Vi thE: oc cccsssesssssescsssessscsssessessessecesesssceesecsessesessecseceessceeees 54
3.2 DO DUONG KINH: VONG PHAN GIAI MOT SO ENZYME CUA
- TRICHODERMA HA RZLAINUM: 5< << 2 5899 S939.95 35515855855 056 0526 55 3 3 KHẢO SÁT ĐIÊU KIỆN NUOI CAY TRICHODERMA HARZIANUM:56
— 3.3.1 Nhân giống cấp | 56
3.3.2 Kết quả các yêu tố ảnh hưởng: s-cseceeccsecssecssecssecse 56 3.3.3 Nhân giống CAP 1 Go HO HO HH TH HH G0 19 0000008068965005065.6566 61 3.3.4 So sánh số lượng bào tử nhân giống cấp 1 va nhan giống cấp 2: 61 3.4 KHAO SAT CAC YEU TO ANH HUONG DEN KHA NANG SINH
TỎNG HỢP ENZYME CELLUUL.ASE: 5-2 css©2cse+vseecesee 62
3.4.1 Ảnh hưởng độ Âm: -s- se s©++*Exs+veezvervseovesse 62
Trang 9
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI DAT VAN DE
ane Trâm hương — ky nam là sản vật thiên nhiên quý hiém tir cay do bau, và giá “tri của nó đã được khẳng định từ hơn 2000 năm qua Sở dĩ trầm hương - kỳ nam có giá trị kinh tế cao là do nhiều công dụng tích cực của chúng Trong y học dân tộc, người ta thường dùng trầm chữa bệnh hơn là kỳ bởi kỳ quá quý
hiếm và đất tiền; chúng là vị thuốc quý dùng để chữa các chứng bệnh: đau
bung, hen suyễn, bổ thận khí, mạnh tim, hỗ trợ nam giới, Trong hương liệu,
mỹ phâm, trâm - kỳ được sử dụng đê điêu chê các loại nước hoa, phân sắp cao cấp hảo hạng, một số xà phòng tắm và nhất là nhang trầm Ngoài ra, do đặc
điểm nổi bật nhất của trầm - kỳ là mùi thơm hơi hắc, đặc biệt là khi đốt sẽ cho
mii thom tinh đầu trầm không thể lẫn lộn với một hương thơm nào khác, do đó, nó còn được làm những vật chế tác hay những trang sức có hương thơm rất
lâu,
Do nhiều công dụng ưu việc trên mà cây Dó Bầu được ví như “con trai tạo ngọc” Mặt khác, trầm hương được tụ kết trong thân cây Dó Bầu sống lâu năm (vài mươi tuổi) với tỉ lệ thật hiểm hoi, trong hàng ngàn, hàng muôn cây Dó rừng mới có một cây có trầm Tỉnh dầu trầm hương trở thành một trong số những loại tỉnh dầu có giá trị cao nhất trên thế giới Và việc khai thác tỉnh dầu trầm đã và đang rất được quan tâm của quần chúng nhân dân cũng như nhiều nhà nghiên cứu
_ Ở Việt Nam, hiện diện tích cây dó bầu ngày tăng lên ở các hộ gia đình, nhưng việc tạo trầm cho cây Dé Bầu là một điều dễ mà lại khó Có rất nhiều
phương cách và thủ thuật tạo trầm nhưng hầu hết họ thường sử dụng phương cách cơ học truyền thống, thời gian tạo trầm ở cây được rút ngắn nhưng kèm theo đó là giá trị chất lượng trầm giảm đáng kể Vậy, việc nghiên cứu chưng
cất và trích ly tỉnh dầu trầm hương có giá trị chất lượng cao, thời gian ngắn, tận
dụng nguồn nguyên liệu có san dé chi phi hạn chế đang là một vẫn đề nóng cho
các nhà khoa học
Trang 10
‘GVHD: TS LE: THI THANH MAI DAT VAN DE
Được biết nhóm nắm đối khang Trichoderma hién dang dugc nghién cứu T phổ biến trong công nông nghiệp do có nhiều đặc tính ứng dụng Ở đây, trong phạm vi này chúng tôi nghiên cứu khả năng enzyme cellulase nhiều nhất trên _ cơ chất gỗ cây bó đầu nhằm hổ trợ cho việc rút ngắn thời gian khi chưng cất và _ trích ly tinh dầu trầm hương ở cây Dé Bau Trén cơ sở đó, chúng tôi thực hiện | đề tài: “Bước đầu nghiên cứu ứng dụng nắm Trichoderma spp để phân huỷ ` gô cây Dó Bau”
Trang 11
PHAN 1
Trang 12- GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN
M4
ty
1.1GIOI THIEU VE CAY DO BAU, TRAM HUONG VA MOT SO
PHƯƠNG PHAP SAN XUAT TINH DAU: 1.1.1 Cây Đó Bầu: - Tên khoa học: Aquilaria crassma Pierre ex Lecomte e Lép (Class): Magnoliopsida © Bo (Order): 7: hyméales e Ho (Family): Thymeleaceae - Tên thông thường:
Tuỳ theo từng quốc gia mà trầm hương có tên khác nhau:
e_ Việt Nam: cây Dó Bầu, cây Trầm Huong, cay Dé Trầm, cây
Tóc,
e Trung Quốc: Tram Hương (Tiếng phé théng: Ch’en Hsiang) e Anh: Agarwood hay Aloes wood e Due: Adlerhoiz e Hy Lap:Agallochon : i e Arab: Aghaluhy _ e Phap: Bois d’aigle, Bois d’aloes e Malaysia: Garu
e Campuchia: Kalampeahk chan, Crassna, KresnaKlampéoh Theo thống kê của ngành thực vật, trên thế giới có khoảng loài Dó Bầu, chỉ mọc rải rác ở các nước Đông Dương, nhưng chỉ 15 loài có khả
năng cho trầm huong: Aguilaria crassma; A.baillonii; A.sinensis hoặc A.chinesis; A.borneensis; A.malaccensis; A.gollocha; A.hirta; A.rostrata; A.beccariana; A.cummingiana; afilaria; A.khasiana; A.microcarpa;
A.grandiflora; A.bancana
Trang 13GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
1.1.2 Trầm hương:
Trầm hương là sản phẩm đặc biệt được tạo thành từ cây Dó Bầu, có
giá trị kinh tế rất cao và được ưa chuộng nhiều trên thế giới do nhiều điểm ưu việc của nó:
- _ Trong hương liệu, mỹ phẩm: làm chất định hương; điều chế các
loại nước hoa hảo hạng (Sental, Nuitd°Orient, ); làm xà phòng tắm cao cấp,
- Trong dược liệu: do thành phần hoá học có chứa tỉnh dầu, chất Agoron, Benzyl axeton, chất nhựa .; tính vị: vị cay, tính ôn nên là trầm
hương loại thuốc quý hiếm có công dụng chữa nhiều loại bệnh
- Trong Đông y: dùng làm thuốc giải nhiệt; trị đau bụng; trị các chứng độc thuỷ do phong thổ gây nên, làm tiêu chứng chướng mãn; hạ
được nghịch khí;
= Trong Tây y: trầm hương có tính kháng sinh, tạo kháng thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thương) và có tác dụng chữa một số bệnh về tim mạch (đau ngực, suy tim), bệnh hô hấp (hen suyễn), bệnh thần kinh (an thần, trị mất ngủ, giảm đau, trấn tink .); bệnh về tiêu hóa (đau
bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về đường tiết niệu (bí tiểu tiện) - Cac linh vực khác:
*ˆ Sản phẩm biếu tặng trong lĩnh vực ngoại giao
vˆ Chế tác đồ thủ công mỹ nghệ: tượng, vật cảnh, đồ trang trí w Tôn giáo: đốt trong các chùa chiền, đền thờ vào các địp lễ
đặc biệt, làm nhang để đốt vào lúc cúng kiến
*“ˆ Làm giấy quý (vẽ tranh, viết kinh thánh ) * Ướp xác
Trang 14_ GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
1.1.3 Một số phương pháp sản xuất tỉnh dầu:
Muốn dùng tinh dau, người ta tách nó ra khỏi vật liệu thực vật có
chứa các túi tinh dầu bằng các biện pháp khác nhau thích hợp cho từng loại tỉnh dầu về mặt kỹ thuật và về mặt kinh tế
1.1.3.1 Phương pháp ép vật liệu thực vật:
Trường hợp chỉ cần ép vật liệu thực vật cũng đủ phá vỡ màng tế bảo
cho tỉnh dầu chảy ra, hàm lượng tỉnh dầu trong vật liệu tương đối lớn, tỉnh
dầu có giá trị cao, không cần thu hồi thì người ta dùng phương pháp ép vì
nó rẻ tiền Tuy nhiên, ép thì không lấy kiệt tỉnh đầu và kéo theo cả những
chất không bốc hơi như dầu béo, nhựa nên sau đó phải làm sạch tỉnh dầu thu được Phương pháp này dùng để lấy tỉnh đầu từ vật liệu như vỏ chanh
1.1.3.2 Dùng một lỏng hay rắn để trích Ịy tinh dau:
Trong một số trường hợp, đo điều kiện đặc biệt, người ta dùng một lỏng hay rắn để trích ly tinh dầu, rồi sau đó tách tinh dầu ra khỏi lỏng hay
rắn ấy Phương pháp này có một số ứu điểm đặc biệt, có khi bắt buột phải
dùng nó để lấy tỉnh dầu nhưng phức tạp và đắt, nên ít dung Phương pháp này chủ yếu dùng cho tỉnh dầu một số hoa như: hoa nhài, Hoa hồng,
1.1.3.3 Phương pháp chưng cất lôi cuỗn hơi nước:
Phương pháp phổ biến nhất và cũng cho nhiều loại tỉnh dầu nhất là phương pháp cất bằng hơi nước Hơi nước được đưa qua khối vật liệu thực vật, tiếp xúc với tinh dau lam tinh dau bay hoi, hơi ấy được kéo theo lẫn với hơi nước (người ta nói là hơi nước được bão hoà hơi tinh dau) Hén hop hoi
nước và tinh dầu kéo theo như thé được đưa sang bộ phận làm lạnh và
ngưng, ở đó nó ngưng tụ lại Khối ngưng tụ được lắng, tách thành những lớp nước và tỉnh dầu riêng khơng hồ tan vào nhau Vì hơi nước lôi cuốn hơi tỉnh dầu đi nên người ta còn gọi là phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Trang 15
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TONG QUAN
1.1.3.4 Phương phúp trích ly bằng dung môi bốc hơi (ete, ete dẫu
hod, benzene, rwou):
Nguyên tắc là cho vật liệu thực vật vào thiết bị chiết suất ở nhiệt độ 60 — 80°C với dung môi đã được tỉnh chế (để không dé mùi lại cho tinh dầu) Dung mơi hồ tan tỉnh dầu à cả một ít sáp, chất màu, chất Albumin Người ta cho dùng dich bay hơi ở nhiệt độ thấp thì thu được tinh dầu lẫn
sáp, Albumin, chất màu, sau phải làm sạch Phương pháp này đắt vì quá trình, thiết bị phức tạp, cần tay nghề cao của công nhân, giá dung môi lại
đắt nên chỉ dùng cho các vật liệu đắt tiền, cất bằng hơi nước không được hay không tốt, như hoa Acacia, Mimosa, Violette, quả Vanille, rễ Iris, nhựa
Benzoin, |
1.1.3.5 Phương pháp trích ly bằng dung môi không bốc hơi:
Người ta ngâm vật liệu trong mỡ nóng chảy ở 80°C, dé ngudi 1 gid
lại đun nóng chảy để tách bã vật liệu ra Dung môi là mỡ, đầu olive, đầu
pharaphine Phương pháp này trước kia dùng nhiều cho hoa Acacia và một
số hoa khác, hiện nay ít sử dụng
1.1.3.6 Phương pháp trích ly bằng mở lạnh (tớp hoa)
Có một số hoa (nhài, Tuberose) sau khi đã hái còn tiếp tục tạo ra tỉnh
dầu một thời gian nhưng tinh dầu các hoa ấy rất đễ bay hơi nên không thé cho cho qua trinh tao tinh dầu hoàn thành mới lấy Còn nếu cất ngay bằng hơi nước hay nếu trích ly ngay bang các phương pháp vừa nêu trên thì cảnh hoa sẽ bị chết, không tiếp tục tạo ra tỉnh dầu nữa
Để trích ly, người ta sử dụng chất nào hấp thu ngay tỉnh dầu sẵn có,
và hấp phụ dần tinh dầu được tạo ra Chất ấy là mỡ động vật (có thành phần
phù hợp theo kinh nghiệm) Mỡ thực vật không dùng được vì nó gồm các
chất không no dễ bị hư Còn mỡ khoáng vật thì hấp thụ kém, để lại mùi trong tinh dầu Người ta đặt những cánh hoa dưới lớp mỡ và để một thời
gian 24 giờ cho hoa tiếp tục tao tinh dầu, và mỡ-sẽ hấp thụ hết tỉnh dầu ấy
Trang 16
GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN Sau 24 giờ, người ta thay các cánh hoa mới, cứ thế nhiều ngày (hơn 1 — 2 tháng), để mỡ tích tụ được nhiều tỉnh dầu Mỡ lấy ra có thể dùng ngay trong công nghệ mỹ phẩm hoặc có thể dung rượu để hoà tan tinh dau và tiếp tục xử lý them Phương pháp này tốt, nó giữ được nguyên mùi của tỉnh dầu nhưng phức tạp và đắt, nên chỉ dùng cho các hoa cho tỉnh dầu có giá trị cao như: hoa hồng,
1.2CELLULOSE VÀ ENZYME CELLULASE:I®%%? 15.1, 9]
1.2.1 Cellulose:
1.2.1.1 Cellulose trong tw nhién:
Cellulose là hợp chất khá bền vững Trong tự nhiên, chúng không
tồn tại ở dang tinh khiết mà tồn tại ở dạng kết hợp với các chất khác như hemicellulose, pentose, lignin,
Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng đối với con người, vì chúng ta không có ip men cellulase trong ống tiêu hoá; nhưng điều này ngược lại đối với động vật ăn cỏ Tuy nhiên, trong xu hướng thế giới thì ngày nay, các thành phần thực phẩm có chứa nhiều chất xơ cellulose như: | rau, củ, quả đã được tăng lên trong khẩu phần ăn do chúng giúp tiêu hoá
tốt, chống táo bón, giảm béo phì,
1.2.1.2 Cấu tạo của của cellHlose:
Cellulose là một polymer mạch thang được cấu tạo bởi các monomer
là D-B-glucopyranose liên kết với nhau bằng liên kết B-1,4-glucoside Nhờ đó, trong không gian ba chiều, cellulose có cầu trúc mạch thắng (khác với cầu trúc xoắn của tỉnh bột) gồm các vòng pyanose ở dạng cấu trúc xếp lệch nhau góc 180° và nối với nhau qua nguyên tử oxygen
Trang 17
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN HVO H rn CH2DH IN CH20H - HO H C——0 [SH] Hồ TT” Nb M l/ We \ 0H HỆ | H C——0 70 wo 1 h Km dị Ny Ks TC HạO Why CHạoh H : — Hình 1: Cấu trúc Cellulose
Số lượng đơn vị glucose trong một phân tử được biểu thị bang mức
polymer hoá Mức độ polymer hoá cellulose trong tự nhiên có thể đạt tới 10.000 — 15.000 đơn vị glucose Một phân tử cellulose thường có chiều đài từ 5 pm và có khối lượng phân tử rất lớn
Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen, người ta biết rằng cellulose có cầu tạo đạng sợi Các sợi đây này liên kết thành những bó nhỏ øọn là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần
đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình) Các sợi
microfibrin có chiều rộng khoảng 100 — 300 Ae (1 A°= 107 mm) và chiều _ đầy khoảng 40 — 100 A° (Conovalov, 1972)
1.2.1.3 Tính chất hoá học:
- Cellulose có thể hoà tan trong dung dịch Cu(NHa)x(OH); (cupriamin hypelrat) đặc, tan trong dung dịch H;SO¿x đậm đặc
- Khi tac dụng với các chất oxy hoá, mạch cellulose tạo thành hỗn
hợp phức tạp Tính bền hoá học của cellulose sau khi bị oxy hoá, khi bị tây trắng sẽ giảm đi nhiều
- _ Khi tác dụng với kiềm đặc, cellulose tạo thành sản phẩm tương tự ancolat gọi là muối cellulose kiềm, muối này dễ bị thuỷ phân cho ra cellulose ở dạng hydrat cellulose, dạng nảy giống cellulose về
thành phần nhưng kém bền hơn, hút nước hơn, dễ nhuộm hơn
Trang 18
_GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
- - Cellulose còn tác dụng với anhydric acetic tạo sợi điacetat hay tá dụng với acid nitrit tạo ra nitrat cellulose có nhiều trong ứng dụng công nghệ thuốc nỗ
1.2.14 Tính chất vật lý:
- Cellulose 14 chất rắn không màu, không mùi, không vị, không tan trong nước (chỉ phồng lên nếu hấp thụ nước), không tan trong các dung môi hữu cơ, không có trạng thái nóng chảy Khi đun trong chân không thì bị phân huỷ thành glucose
- Cellulose bi phan huy ở nhiệt độ thường hoặc ở nhiệt độ 40 — 50
°C do su thuy phan cellulose béi enzyme cellulase
- Cellulose bi phan huy khi dun néng véi acid hodc kiém ở nồng
do kha cao
- Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chế với
hemicellulose, pectin và lignin Điều này ảnh hưởng đến sự phân huỷ cellulose của enzyme cellulase
1.2.2 Enzyme cellulase:
_— 1.221 Khdi niém chung vé enzyme: e
Enzyme (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có trong tế bào của mọi cơ thê sinh vật Nó không những
làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoá học nhất định trong cơ
thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “invitro” Vì có nguồn gốc từ sinh vật do đó enzyme thường được gọi là xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hoá
học khác Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hoá học rất
khó xảy ra trong điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có
nhiệt độ cao, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh, ) nhưng trong cơ
thê, nó xảy ra hêt sức nhanh chóng, liên tục, và nhịp nhàng với nhiêu phản
Trang 19
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
£
ix
ứng lien hợp khác trong điều kiện hết sức “êm dịu nhẹ nhàng” (37), áp suất thường, không có kiềm mạnh, acid mạnh, ở nồng độ cao,
Co thé thiéu enzyme thi moi chuyén hoa sé dinh chi, sinh vat không thể sống, sinh san, phát triển bình thường được, sự sống của sinh vật sẽ
không tôn tại _
Hiện nay, người ta đã khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme thu được ở dạng tỉnh thể Enzyme ngày nay được ứng dụng ngày
càng rộng rãi và có hiệu quả trong mọi lĩnh vực như: y được, chăn nuôi, thú
y, một số ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm: bia, rượu, tương, chao, nước chấm, nước mắm,
122.2 Enzyme cellulase:
a) Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase:
Cellulase là một nhóm enzyme hoạt động trong việc thuỷ phân -eellulose thành glucose ( Whitaker, 1971 và Emert, 1974) Hệ cellulase -
gồm ba thành phần chính: exoglucanse, endoglucanase va B — glucosidase .- Cellulose 1a polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima,
2002) được sinh tổng hợp chủ yếu tử thực vật với tốc độ ước tính là 4x10!
tân/năm (Parsiegla, 1998) Dựa vào số liệu trên, người ta cho rang cellulase là enzyme chiếm ưu thế nhất trong tự nhiên và được sinh ra chủ yếu từ vi sinh vật (Almin, 1975)
Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nắm
sợi Ngoài ra, cellulase còn có mặt trong các hạt của thực vật bậc cao, hạt lúa mạch, giun đất, sâu róm và ốc sên
Từ hơn 100 năm qua đã có một vài nghiên cứu về enzyme phân giải cellulose trong qua trinh nay mam của thực vật, đó là enzyme phan giải _
vách tế bào thực vật được gọi là cyfase
Trang 20
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TONG QUAN
Bary (1886), mô tả hoạt động của nắm sinh trưởng trên củ cải đường “soi nam phân huỷ vách tế bào và làm mềm mô củ cải giống như củ cải
được nấu”
Karrer và Schubert (1927), đã nghiện cứu sâu về hoạt động của enzyme tir 6c sén trén cellulose tai sinh (to nhan tao)
Reese (1950), đã làm sáng tỏ các bước hoạt động thuỷ phân cellulose của cellulase | Ci | Cellulose | Cx B-glucosidase > ỶỲ cellobiose >| glucose cellulose phản ứng
Đầu tiên, enxoglucanase phá vỡ liên kết Hydrogene trong phân tử cellulose Sau đó, endoglucanase tiếp tục thuỷ phân cellulose thành các phân tử cellobiose và cuối cùng B — glusidase phân cắt cellobiose thành glucose
b) Ung dung enzyme cellulase:
Trong những năm gần đây, người ta đã bắt đầu dung vi sinh vat dé sin xuat enzyme cellulase 6 quy mé công nghiệp và đã ứng dụng rộng rãi các chế phẩm của chúng vào mục đích khác nhau -
- _ Tăng chất lượng sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia xúc:
Trong các thành phần cấu tạo nên vỏ tế bào thực vật thi cellulose là thành phần quan trọng nhất Các nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật,
nếu được them chế phẩm cellulase thì sẽ mềm hơn, dễ tiêu hoá
hơn, do vậy tăng chất lượng và độ hấp thụ thức ăn này
Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như: bắp
cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử
lý cả chè và các loại tảo biễn,
Trang 21
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TONG QUAN
‡ ' ty
Trong sản xuất bia, đưới tác đụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá
Trong sản xuất của agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá
vỡ thành tế bào; đặc biệt là việc sử đụng chế phẩm cellulase để tận thu
_ các phế liệu thực vật đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men
Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có ý nghĩa rất tốt Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm
cellulase có hoạt độ cao
- Tăng hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyên liệu thực
vật:
Nếu có mặt chế phẩm cellulase, nó sẽ tăng cường sự phá huỷ thành -
té bao thực vật (mà chủ yếu là do cellulose tao nên), tạo điều kiện dễ
dàng trích ly các chất bên trong tế bào - Ứng dụng trong xử lý rác thải:
Hiện nay, để xử lý lượng rác thải khổng lồ thải ra mỗi ngày, ở một số nơi, người ta đã bắt đầu sử dụng các chế phẩm enzyme cellulase dé phân huỷ chúng và kết quả là hiệu suất khá cao, giải quyết được các loại rác thải mang bản chất cellulose và tạo ra phân hữu cơ giúp ích cho nông nghiệp
- Ứng dụng trong công nghệ dệt vải:
Giúp sợi vải mềm hơn, đồng thời làm cho thuốc nhuộm tác động dễ
đàng vào vải hơn
- Ung dung trong cac nganh khoa hoc:
Trang 22
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
Cellulase được ứng dụng rộng rãi trong việc phá vỡ thành tế bào của
các tế bào thực vật Đặc biệt là trong nuôi cay mô để tạo ra các tế bào
trần, đây là nguyên liệu để thực hiện sự lai tạo giữa hai tế bào khác nhau
để tạo ra những dòng tế bào có đặc tính của cả hai loại tế bào Hiện nay,
việc sử dụng cellulase trở nên rất phổ biến trong công tác nghiên cứu
chọn giống thực vật
- Ung dung trong thuy phan gỗ và các phế liệu công nghiệp:
Cellulase ứng dụng trong thuỷ phân gỗ và các phế liệu của công nghiệp thành dịch đường làm thức ăn cho gia súc Cellulase có thể thu nhận từ canh trường nuôi cấy nắm mốc và cả vi khuẩn
-_ Một số chế phẩm cellulase được sản xuất:
Cellulaset và Novoenzyme 234 [NO], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR]
CelluPract ® AS/AL, 100: bỗ sung vào thức ăn cho gà con, chứa các - enzyme: xylanase, beta-glucanase, cellulase
CelluPract ® AS/AL 110: bỗ sung vào thức ăn gà giò, gà mái đẻ, các .-
loại gia cầm khác; chứa enzyme: xylanase, beta-glucanase, va cellulase : | CelluPract ® AS/AL 120: bổ sung vào thức ăn cho lợn con; chứa các
enzyme xylanase, beta-glucanase, alpha-amylase va protease
CelluPract ® AS/AL 130:bé6 sung vào thức ăn cho lợn thịt; chứa các
enzyme xylanase, beta-glucanase va cellulase
Enzeco ® cellulase Ces (dang léng), Cellulase cep (dang bột): thu
nhận được từ 7ï richoderma longibrachiafum, sử dụng trong chế biến
thực phẩm
Enzeco ® cellulase CRX và Enzero ® cellulase FG thu nhận được từ
A.niger, sử dụng trong chế biến thực phẩm
Trang 23
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
1.2.2.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulase:
Như chúng ta đã biết, có rất nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose Do đó, hệ vi sinh vật tổng hợp cellulase là khá phong phú
Popov (1875), người đầu tiên tìm thấy những vi sinh vật ky khí có
khả năng này -
| Van Iterson (1903), phát hiện ra khả năng phân giải cellulose của các
vi khuẩn hiếu khí
Tiếp đó, Vinogratxkii (1926, 1952) và Imtcheniexkii (1940, 1951)
đã nghiên cứu kỹ hơn Sau khi quan sát thấy hoạt động của enzyme phân
giải cellulose invitro đầu tiên, một loạt các công trình nghiên cứu về enzyme này được tiễn hành ở các loài vi sinh vật
Khả năng phân giải cellulose ở vi sinh vật phụ thuộc chủ yếu vào thành phần và tính chất của phức hệ cellulase của chúng Cellulase của các
loài vi sinh vật khác nhau thì khác nhau về thành phần các loại enzyme -
trong phức hệ và các thành phần cũng khác nhau về pH, nhiệt độ tối
-ưu, cũng như các đặc tính khác Vì vậy, các nhóm vi khuân và các nhóm
nắm có khả năng sinh tổng hợp cellulase khác nhau, ' thông thường trong điều kiện hiếu khí thì nấm có khả nang sinh téng hgp cellulase cao hon rat nhiều Nhưng ngược lại trong điều kiện ky khí thì khả năng sinh tông hợp
cellulase của vi khuẩn mạnh hơn
Hiện nay, người ta nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase chủ
yếu ở vi khuẩn, xạ khuẩn và nắm mốc
q) Vi khuẩn:
Vi khuẩn sinh ra chủ yếu endoglucanase va_B-glucosidase gan nhu không tao ra exoglucanase
- Vi khuan trong da cé: Ruminococcus albus (Berger, 1963; Curilov,
1971)
Trang 24
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
- Vi khuẩn hiếu khí: Celulomonas persica sp Nov va Cellilomonas iranensis sp.Nov (Elberson, 2000)
- Vi khuén ky khi: Closridium thermocellum, Clostridium
cellulovorans (Murashima, 2002), Clostridium celluloticus
(Parsiegla, 1998) |
b) Xa khuẩn:
Nhiều xạ khuẩn thuộc giéng Streptomyces duoc phát hiện có khả năng sinh cellulase: Streptomyces antibioticus (Enger va Steeper, 1956), Streptomyces thermoviolaceus var pingenes (Fergus, 1969), Streptomyces cellulolyticus sp.Nov (Li, 1997)
c) Nấm mốc:
Nhiều loại nắm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase
thuộc giống Alternaria, Trichoderma, Mbyrothecium, Aspergillus, Pinicillium, Cladosporum,
Trong đó có hai di nam soi 1a Trichoderma va Aspergillus da duge nhiéu nha khoa hoc nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast va Saha, 1997) Giéng T richoderma sinh tông hợp một lượng tương đối lớn endoglucanase và enxoglucanase, nhưng chỉ một lượng ít J-glusidase; trong - khi các ching giéng Aspergillus sinh ra một lượng tương đối lớn
endoglucanase va P-glucosidase, nhưng chỉ một lượng ít exoglucanase
1.3 TRICHODERMA SPP.:
1.3.1 Phân loại và đặc điểm hình thái:
Trichoderma là một trong những nhóm nắm gây nhiều khó khăn
trong công tác phân loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn
còn chưa được biết đầy đủ
Trang 25
GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN
Theo hệ phân loại Natural System 2000, Trichoderma dugec phan loại như sau: - Giới —- : Fungi - Ngành © : Ascomycota - Lớp : Ascomycetes - Lép phu | : Sordariomycetidase - Bộ : Hypocreales - Ho : Hypoccrease
Trichoderma la loai nam bat toàn, sinh sản bằng đính bào tử, nhiệt độ từ 25°C — 30°C Cae ching Trichoderma có tốc độ phát triển rất nhanh,
ở 20°C, khuẩn lạc đạt từ 2 — 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy
Khuan lạc lúc đầu không mầu (môi trường CMC) hay màu trắng (môi trường PGA), sau 3 ngày sẽ có sự hình thành bào tử Khuẩn ty không ,
màu, cuong sinh bào tử sinh nhánh nhiều, cuối nhánh phát triển thành thê
bình mang bảo tử màu xanh, vàng hay sim mau Bao tir thường có hình _,
clip, 3 — 4x2 — 4 wm (D/R = >1,3); hình cầu (D/R < 1,3) nhưng hiếm khi Bào tử thường trơn hay có nhiều mắ nhỏ
1.3.2 Đặc điểm sỉnh lý, sinh hoá:
Trichoderma là loại nằm có phân bố rộng rãi trong đất, rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không sống nội ký sinh với thực vật (Gary J Samuels) Hầu hết cac loai Trichoderma la sống hoại sinh, thường gặp trên xác
bã thực vật, ở những nơi âm ướt, trên phân thú vật
Các loài Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh mẽ với các nắm
khác như loài Trichoderma lignorum ký sinh trên một số loài nấm đất; Trichoderma viride ký sinh trên khuẩn ty của nam Armillariella mella Co ché cia qua trinh nay cho đến nay vẫn chưa được biết một cách rõ rang,
Trang 26
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
nhưng người ta cho rằng nó đối kháng với các loài nắm khác là do khả năng tiết ra chất kháng nắm, sau đó sử dụng các hệ enzyme phân giải hỗn hợp để tiêu huỷ vách tế bảo
Ti richoderma phát triển tốt ở đất acid nhưng nhìn chung chúng đều
phát triển tốt ở bất kỳ pH < 7 -
Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbonhydrat, amino acid đến ammonia
Trichoderma thì thường ưa độ âm hơn Khi đất khô, quần thể Trichoderma bị giảm, song các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về
nhiệt độ và độ âm cũng khác nhau Chẳng hạn, vài chủng Trichoderma
hamatum và Trichoderma pseudokoningii có khả năng sống được ở môi trường sống có độ âm rat cao; Trichoderma viride va Trichoderma polysporum thích hợp ở vùng có nhiệt độ thấp, trong khi 7richoderma
hazianum phan bé 6 ving có khí hậu ấm áp
1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng cia Trichoderma:
1.3.3.1 Vé enzyme:
Trichoderma là một trong những vi nắm đã và đang được nghiên cứu nhiều Chúng có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme nhu: chitinase, glucanase, xylase, lipase, protease, va enzyme ma ching cé kha năng tông hợp đáng quan tâm hơn các loại vi nắm khác hiện nay là cellulase Vì vậy, Trichoderma được biết đến như một loại vi nắm có khả năng phân giải cellulose tốt nhất hiện nay
1.3.3.2 Trong nông nghiệp:
a) Bảo về thực vật:
Ti richoderma được biết là có khả năng kiểm soát sinh học cũng như
khả năng đôi kháng một sô nâầm gây bệnh ở thực vật qua nhiều nghiên cứu
Trang 27
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
‡ Ầ
Theo Emxep V.T (1898), 7r/cboderma không chỉ tiêu diệt nhiều loại nấm bệnh gây trồng trong đất mà còn có vai trò trong quá trình cải thiện | cầu trúc và thành phần hoá học trong đất, đây mạnh sự phát triển của các loại vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất, kích thích sinh trưởng và phát triển cây trồng Các sinh vật đối kháng này không chỉ ức chế các vi sinh vật gây bệnh trong vùng rễ mà những chất kháng sinh do chúng tiết ra (trichodermin, gliotoxin) có thể xâm nhập vào vỏ mô tế bào cay, lam tang tính chống chịu bệnh của cây trồng |
_ Theo Harman và Hayes (1993), đã thử nghiệm dung hợp tế bào trần nhằm tạo ra chủng có khả năng kiểm soát bệnh hữu hiệu
Một số nhà khoa học khác tập trung vào cải biến các tình trạng có
liên quan đến các hoạt động đối kháng
Hiện nay, các chủng Trichoderma đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh hoc thương mại như: chế phẩm Trichodex với
Trichoderma harzinaum là thành phần được sử dụng chống lại sự thối rửa của táo sau thu hoạch; chế phẩm GlioGard với thành phần chính là
Trichoderma virens ngăn chặn sự úng thối cua cay con; :
Trén thé giới, các nước như New Zealand, người ta trộn nhiều chủng
Trichoderma khác nhau đề kiểm soát bệnh trênc ây nho và các cây dạng quả hạch; hay ở Mỹ, người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử Trichoderma lên các hạt giỗng để tăng tính kháng bệnh của cây trồng (Harman et al, 1980) hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt
Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma xử lý đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nắm mốc với phân chuồng hoại mục trước khi bón ruộng 5 — 10 ngày, rồi rãi trên ruộng trước
khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô văn hại bắp b) Cải thiện năng suất cây trồng:
Trang 28
._ GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI i TỎNG QUAN
wh
Khi sử dụng thuốc trừ sâu hay phân bón hoá học lâu ngày sẽ làm cho
2 dat canh tac bi thoai hod, chai sạn, các loại giun đất không phát triển được,
làm hạn chế độ xốp và đồng thời cũng làm cho độ thong khí cần thiết cùa rễ cây bị thiếu hụt Do đó, trên thế giới hiện nay các nước phát triển về nền nông nghiệp có xu hướng sử dụng phân bón hữu cơ sinh học thế hệ mới - thực chất nó là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học,
_ dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Chúng có tác dụng:
- Phòng ngừa các nắm gây bệnh như: thối gốc, héo rũ, và hạn chế các tác nhân nguy hiểm do các nắm gây mục gỗ nhờ khả năng bất hoạt enzyme của các các nắm gây bệnh
- Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng, làm tăng số lượng rễ sâu giúp cây có khả năng chống chịu tốt với hạn hạn
- Vai loai Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và ra hoa như: Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii,
- Cải thiện cầu trúc và thành phần của đất, bảo toàn và ta9ng độ phì nhiêu của đất, đảm bảo dinh đưỡng cho cây trồng
- + Thng sức đề kháng cho cây trồng, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng
- Phân giải cellulose trong tự nhiên mạnh, làm tăng cường chất dinh dưỡng và kích thích sự tăng trưởng cây trồng
1.3.3.3 Trong công nghiệp:
Người ta bổ sung các enzyme protease, amylase, lipase, cellulase, vào thức ăn nhằm hỗ trợ khả năng tiêu hoá
Một số loài được sử dụng để sản xuất nước giải khát dé thay thế một phần nguyên liệu mà chất luợng không thay đổi hay có thể làm tăng thêm hương vi, (Trichoderma roseum, Trichoderma longibarachia)
Trang 29
4, GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN
1.3.3.4 Trong một số lĩnh vực khác:
- _ Xử lý chất thải sinh hoạt đô thị, hay chất thải của các nhà máy —
xí nghiệp
- Y hoc: chinase lam thanh phan thuốc kháng nắm mạnh tránh ngộ
độc và lờn thuốc; a-1,3-glucanase (mutubose) được sử dụng làm nhân tố phòng ngừa và giảm vấn đề về rang miéng;
1.3.4 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của Trichoderma đỗi với môi trường:
Cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định mối nguy hiểm nảo với con người khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có xử lý 7richoderma Một vài báo cáo gần đây cho thấy chúng có thể gây kích ứng mắt và phổi cho các công nhân tiếp xúc trực tiếp với thuốc hay đối với người vào nơi phun thuốc trong thời gian không quá 12 giờ Tuy nhiên, điều này dễ khắc phục nếu những người này được trang bị đầy đủ phương tiện bảo hộ lao động -
Ngoài ra, người ta còn xử lý chế phẩm Trichoderma v6i mét s6 nam không gây bệnh thực vật: như: Aspergillus awamori, Aspergillus - niger, Kệt quả cho thây, với các nằm này, chế phẩm 7?iehoderma không ức chê Như vậy, ché pham Trichoderma con cé tinh chon loc cao
Nhiều thử nghiệm cũng cho thấy Trichoderma không độc cho chim, cá và các động vật hữu nhủ khác Nhìn chung, các chế phẩm sinh học từ vi nắm này không độc, có tính chọn lọc cao và hiệu quả không thua kém chất hoá học sử dụng trong bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng Tuy vậy, tổ chức EPA (Environment Protection Agency) của Hoa Kỳ đang nghiên cứu thêm về các ảnh hưởng của chúng
1.3.5 Ching Trichoderma harzinaum:
Trichoderma harzianum được phân loại như sau:
- Lớp : Deuteromycetes
Trang 30
_GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN -Bộ : Moniliales -Họ : Moniliaceae - Giống: 7richoderma
- Loài : Trichoderma harzianum
Khuẩn lac Trichoderma harzinaum ban đầu có màu lục trắng, sau luc tuoi, luc sim; mat dưới khuẩn lạc không màu, đường kính 6 — 12 um
Giá bào tử trần ngăn cách, phân nhánh 2 — 3 lần, đường kính 4 — 5 um, dai dén khoang 250 pm; thể bình có kích thước 3 - 4x5 — 7 um; thudng
thành cụm 2 — 5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở dọc các nhánh thường đơn
độc Thể bình ở giữa thường dài tới 17 um và có đường kính nhỏ hơn, phần
rộng nhất khoảng 2 — 3 um
Bào tử đính gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẫn, màu lục, không vách ngăn, kích thước 2 — 3 x3 ~ 5 w#m, nhày ở đỉnh thể bình
Trichoderma harzianum không sinh độc tố, có khả năng sinh enzyme chống lại sự gây bệnh của một số loài nắm gây bệnh cho cây trồng: các enzyme thu nhận từ chủng này không gây đột biến vi khuẩn và mô
-_ chuột
Trichoderma harzinaum được tìm thấy ở những vùng ấm áp Theo
các nghiên cứu của Domsch và các cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự
sinh trưởng, phát triển của 7?ichoderma Harzinaum vào khoảng 30C, nhiệt độ tối đa khoảng 36°C Nó cũng có thể phát triển ở nhiệt độ 5°C nhưng sinh trưởng rât chậm và yêu
1.4 THANH PHAN MOI TRUONG NUOI CAY va CAC DIEU KIEN ANH HUONG VI SINH VAT TONG HOP CELLULASE:
1.4.1 Thành phần môi trường nuôi cấy: - WN guon Carbon:
Trang 31
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
a
Theo nguyên lý sinh tổng hợp enzyme cảm ứng, trong môi trường 1 nuôi cấy các vi sinh vật sản sinh enzyme cellulase nhất thiết phải có
cellulose là chất cảm ứng và nguồn carbon
Nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, cám bồi, mùn cưa, bã củ cai,.rom, Tuy vao timg loai Trichoderma ma str dung
môi trừơng có nguồn carbon khác nhau sao cho với nguồn carbon đó khả năng sinh tổng hợp cellulase của nó là cao nhất Vi du nhu: Trichoderma lignorum va Trichoderma konigii được nuôi trên môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tinh enzyme cao nhất
Ngoài ra, chat cảm ứng enzyme cellulase còn là
cellobiozooctaacetat, cam mi, lactose, salixyl
Cac nguồn carbon khac (glucose, cellobiose, acetate, citrate, oxalate,
succinat, và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs) có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp cellulose Trong môi trường với nồng độ glucose thấp rất ít có tác đụng kích thích vi sinh vật sinh trưởng và phát triển, không cảm ứng tông hợp enzyme
Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với vi sinh vật sinh cellulase là muối nitrat Đối với các giéng cia nam bong (Hyphomycetales),
nguồn nitơ tốt nhất là (NH¿);HPO¿ Nói chung, các muối amon ít có tác
dụng nâng cao hoạt lực enzyme này thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì trong môi trường nuôi cấy, các muối này làm acid hố mơi trường Do đó, ức chế quá trình sinh tổng hợp enzyme và có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành
Natri nitrate làm cho môi trường kiềm hoá, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau
đến sinh tổng hợp cellulase Điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng giông, ví dụ như: cao ngô và cao nâm men có tác dụng nâng
Trang 32
' fe * 4s te + 4 _ GVHD: TS Li THE THANH MAL TONG QUAN “4
cao hoạt luc cellulase của vi sinh vật nhưng cao ngô có khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase cao hơn so với cao nắm men
Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase
Tac dung kich thich của các hợp chất này là do sự có mặt của acid amin,
—
các nguyên tổ khoáng và những nhân tố sinh trưởng khác - _ Ngun tơ khống:
Các ngun tố khoáng như Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu có ảnh hưởng rõ đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Trong đó, Zn, Mn, Fe có
tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích
cua Zn 14 0,11 — 0,22 mg/1; Fe là 2 — 10 mg/l; Mn Ia 3,4 — 27,2 mg/l
Ham lượng Fe là yếu tố quan trọng đối với Trichoderma, số lượng Trichoderma sẽ giảm nếu thiếu Fe
Biotin và Thiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme nay
1.4.2 Các yếu tô An hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh
tông hợp enzyme của vi sinh vật:
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh tông
hợp cellulase của Trichoderma: |
- _ Cơ chất và tiền xử lý cơ chất
- Chung vi sinh vat thích hợp
- _ Độ âm của cơ chất; pH; tỷ lệ giống: kiểm soát nhiệt sinh ra trong quá trình trao đổi chất
- - Thời gian nuôi cấy; tỷ lệ tiêu thụ O, va thai CO) 1.4.2.1 Anh huởng của độ Gm:
Hầu hết các quá trình sống của vi sinh vật có liên quan đến nước, do đó, độ âm là một yêu tô quan trọng của môi trường Khi thiêu nước sẽ xảy
Trang 33
-GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI | TONG QUAN
ra hiện tượng loại nước ra khỏi tê bào vi sinh vật, trao đôi chât bị giảm và tê
My bao chét
Trong quá trình sinh trưởng va phat triển của vi sinh vật, tế bào đòi
hỏi phải đâm bảo được lượng nước nhất định, Nếu thiếu nước, khả năng
hoà tan các chất dinh dưỡng sẽ kém, dẫn đến giảm khả năng đồng hoá đinh dưỡng tạo ra enzyme, đồng thời lượng enzyme tạo ra cũng giảm đi Tuy
nhiên, nếu độ âm quá cao sẽ xây ra hiện tượng trương nở tế bào làm giảm
khả năng phát triển của tế bào | |
Độ âm không những ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đôi chất
của tế bào mà còn ảnh hưởng đáng kể đến đặc tính lý hoá của cơ chất Các
cơ chất khác nhau thì có khả năng giữ nước khác nhau
Cùng một loài vi sinh vật nhưng nó có thể sinh trưởng và phát triển mạnh ở độ âm này, nhưng để sinh tổng hợp enzyme tối đa thì ở độ âm khác
Vi du: tốc độ tối ưu của 7⁄ichoderma ở độ âm 60%; nhưng khả năng sinh
tông hợp cellulase tối đa ở độ ẩm thấp hơn, xấp xi 50% (theo Kim, 1985)
| 1.4.2.2 Anh hưởng của pH:
pm pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như khả năng sinh tổng hợp enzyme của chúng Đối với vi sinh vật thì bao giờ cũng có một khoảng pH tối ưu để vận tốc sinh trưởng hay sinh tổng enzyme là cực đại, hoặc theo đúng hướng tạo sản phẩm theo yêu cầu
Khi vi sinh vật sinh trưởng sẽ làm pH của cơ chất thay đổi đáng kể
Do cơ chất được oxi hố khơng hồn tồn, kết quả là acid được sinh ra,
hoặc sự hấp thụ NH, sé lam giảm pH Ngược lại, sự giải phóng NH¿ qua phản ứng loại nhóm amino của urê hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH
Sự thay đôi pH phụ thuộc chủ yếu vào hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật và khả năng đệm của cơ chât rắn Tuy nhiên, pH rât khó kiêm soát
Trang 34
GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN
ị é,
H2 s
trong môi trường lên men bán rắn; pH ban đầu tối ưu cho các loại nấm sợi
l5 là khác nhau, có giá trị thấp nhất là 3 và cao nhất là 8 (Prior, 1992)
1.4.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các
phản ứng hoá học Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế bào
Tế bào thu được nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài, một phần cũng do chúng thải ra do kết quả của hoạt động trao đổi chất Vì vậy, nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển cũng như sinh tông hợp enzyme của vi sinh vật
Trong thực tế sản xuất, người ta dung yếu tế nhiệt độ để điều chỉnh vận tốc phản ứng, và chiều hướng phản ứng để tạo sản phẩm theo mong muốn
Hiện nay, ngành công nghiệp lên men được biết đến là ngành sử :
dụng nguồn vi sinh vật và chuyển hoá vật chất do enzyme vi sinh vật xúc
tác Do đó, nhiệt độ được sử dụng trong quá trình sản xuất phải phù hợp với nhiệt độ sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật và nhiệt độ trong khoảng nhiệt độ tối ưu của vận tốc phản ứng enzyme xúc tác Thông thường sử dụng nhiệt độ trong khoảng 28 — 35°C Tuy vậy, tuỳ từng chung vi sinh vật và từng loại enzyme cần sinh tông hợp mà ta xác định khoảng nhiệt độ phù hợp và tối ưu nhất
1.4.2.4 Anh hưởng của môi trường khí:
Môi trường khí trong lên men bán rắn đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm trong những năm gần đây, chủ yếu là O; và CO¿ Nồng độ của chúng được biểu hiện như áp suất riêng Môi trường khí quan trọng nhất là
khoảng không gian giữa các tiêu phần cơ chất, bởi vì đây là nơi mà sinh
khối sinh trưởng O; khuyếch tán từ khoảng không giữa các hạt cơ chất vào sinh khối, và CO; khuyếch tán từ sinh khối vào khoảng không giữa các hạt
Trang 35
GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI TỎNG QUAN
‡
i
fe *
cơ chất Đáp ứng của vi sinh vật trong lên men bán rắn với môi trường khí a phụ thuộc nhiều vào giống vi sinh vật và cơ chất được sử dụng
Trong một số trường hợp, nồng độ oxy thấp không kìm hãm được sự
sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật mà chủ yếu do nồng độ CO;
cao
Môi trường khí có thể ảnh hưởng đáng kể đến lượng sinh khối và
lượng enzyme tạo ra Trong quá trình lên men bán rắn, oxy của khí quyển đi tự do vào cơ chất bởi vì bề mặt tiếp xúc lớn giữa pha khí, cơ chất và hệ
SỢI
1.4.2.5 Ảnh hưởng của cơ chất và nông độ sản phẩm:
Co chat lignocellulose thường được xay nhỏ (kích thước l- 2 mm) nhằm gia tăng diện tích bề mặt cho nắm sợi tấn công và xâm nhập vào cơ chất
Nguồn cơ chất và nồng độ sản phẩm anh hưởng đến sự sinh trưởng ' và trao đôi chât của vi sinh vật trên môi trường lên men bán răn có thể
được xác định như sau: sự giới hạn về chât dinh dưỡng, sự ức chê do cơ chất, sự ức chế do trao đổi chất và sự ức chế do sản phẩm "
Việc tối ưu hoá các chất dinh dưỡng trong lên men cơ chất rắn tương đối khó, bởi vì có nhiều ảnh hưởng tương tác giữa các chất dinh dưỡng, pH và thế nước Nếu cơ chất không chứa tất cả các chất đinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, ta cần sung trong quá trình chuẩn bị môi trường
1.4.2.6 Ảnh hướng của tf 1é giống:
Tỷ lệ giống cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme Khi các yếu tế trên được cung ứng thì ta cần xác định tỷ lệ giống sao cho phù hợp để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển, và sinh tổng hợp enzyme một cách tối ưu nhất
1.4.2.7 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy:
Trang 36
GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN
tị
Thời gian nuôi cấy tối ưu để nấm sợi thu nhận enzyme là khoảng 36 4 — 60 giờ Quá trình phát triển của nắm mốc trong môi trường bán rắn khi
nuôi bằng phương pháp bề mặt trãi qua các giai đoạn sau: - Giai đoan ]:
si | Giai đoạn này kéo dai 10 — 14 gid ké tir thoi gian bắt đầu nuôi cấy
- Ở giai đoạn này, có những thay đổi sau:
` Nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu
trắng hoặc màu sữa
v Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi, khối môi
trường còn rời rạc
VY Enzyme bit dau được sinh tong hop dan
V Giai doan này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt, không
đưa nhiệt cao quá 30C vì thời gian đầu, giống rất dễ mẫn
cảm với nhiệt
- _ Giai đoạn 2:
Giai đoạn này kéo đài 14 — 18 giờ, giai đoạn này có những thay đổi
như sau: có
*ˆ Toàn bộ bào tử sẽ phát triển thành sợi nam va soi nam bat dau phát triển mạnh Các sợi nấm này tạo thành những mạng sợi chang chit khắp trong môi trường, trong lòng môi trường vˆ Có thể nhìn thấy rõ hoàn toàn các sợi nắm có màu trắng bằng
mắt thường
* Môi trường được kết lại khá chặt; độ âm môi trường giảm dan; nhiệt độ trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40 — 450C
v\ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá
mạnh của nâm sợi
Trang 37
| GVHD: TS LE THI THANH MAI TONG QUAN
v Các loại enzyme được hình thành và enzyme nào có cơ chất HH cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn
* Lượng O; trong không khí giảm và CO; sẽ tăng lên Do đó,
| trong giai doan nay nén thong khi manh va nhiét d6 can được
: duy trì khoảng 29 — 30°C là tốt nhất
* Khi nấm sợi chớm bắt đầu tạo ra bào tử là thời gian enzyme tạo ra nhiều nhất
- Giai đoạn 3:
Giai đoạn này kéo dài khoảng 10 — 20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay đôi cơ bản sau:
* Quá trình trao đôi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại
* Nhiệt độ của môi trường giảm, nhiệt độ duy trì ở 30°C Trong
giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều, do đó, lượng
\ enzyme sẽ giảm Chính vì thế việc xác định thời điểm thu
nhận enzyme là rât cân thiết
Trang 38
PHẢN 2: ¬
VAT LIEU VA PHUONG PHAP
Trang 39GVHD: TS LÊ THỊ THANH MAI VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 VẬT LIỆU CHUNG:
2.1.1 Nắm sợi:
Giống Trichoderma harzinaum xin từ bộ sưu tập giống của phòng Vi
sinh ứng dụng - Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành phố Hồ Chí Minh, được
nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng PGA ở 28°C trong thời gian 5-7 ngày, khi bào tử hình thành đem bảo quản giữ giống ở nhiệt độ 4°C
2.1.2 Co chat:
Thóc được mua từ chợ
Min cua gỗ Dó Bầu lẫy từ cây Dó Bầu 10 năm tuổi xuất xứ từ
Tuy Hoà — Qui Nhơn — Bình Định 2.1.3 Thiết bị dụng cụ:
Phòng đếm hồng cầu, Hirschmann Laborgerate, Đức Kính hiển vi quang học Olympus, Nhật Máy khuấy - Cân phân tích Metteler, Thuy Sĩ Nồi hấp TomMy — SS -325, Nhật Bán Bộ ồn nhiệt Memmert GmbH, Đức Tủ sấy Tủ cấy Chai nước biển Bếp điện
Các dụng cụ thí nghiệm: erlen, bercher, ống pipet, que cấy, bông không thấm, bông thấm nước,
Trang 40
| GVHD: TS LE TH] THANH MAI \ VAT LIEU VA PHUONG PHAP i, TẾ 2.2THỰC NGHIỆM:P-”.%!9.12 8] 2.2.1 Phương pháp mô tả hình thai Trichoderma _harzianum: 2.2.1.1 Giữ giống 2.2.1.1.1 Hoá chất — môi trường và dụng cụ: - Khoai tay: 200 g - Agar :20 g - Glucose :20¢ -_ Nước cất : 1000 ml
- Erlen, dia khuấy, ống nghiệm, que cấy, nồi dun, dao,
khan gac tham nước |
2.2.1.1.2 Các tiễn hành:
Pha chế 200 ml môi trường PGA-
Cân 40 g khoai tây sau khi đã gọt vỏ, rửa sạch và xắt nhuyễn
Dem đun sôi trong 200 ml nước cất khoảng 30 phút Sau đó, đem lọc qua khăn gạc, cho dịch khoai tây nấu vào erlen Tiếp tục, cân 4 g glucose va 4g agar cho vao Dem erlen di hấp khử trùng ở 121°C, 1 atm, 20 phút
Sau khi hấp khử trùng, đỗ môi trường PGA vào ống nghiệm, làm môi trường nghiêng, để nguội rồi lấy ống nghiệm giống cấy sang ống nghiệm này (thực hiện trong điều kiện vô trùng), mục đích để giữ giống tiếp tục
Môi trường PGA còn lại dùng đỗ đĩa và làm phòng âm để quan
sát đại thé và vi thể của Trichoderma harzianum
2.2.1.2 Quan sát đại thể:
Môi trường PGA sau khi hấp khử trùng đem đỗ đĩa (đã hấp khử trùng) Chiều dày mặt thạch khoảng 1 em, để nguội