Bước đâu nghiên cứu ứng dụng nhựa macroporous d101 trong phân lập iridoid từ quả dành dành

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HỮU HUY Mã sinh viên: 1101223 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS D101 TRONG PHÂN LẬP IRIDOID TỪ QUẢ DÀNH DÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HỮU HUY Mã sinh viên: 1101223 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS D101 TRONG PHÂN LẬP IRIDOID TỪ QUẢ DÀNH DÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người thầy - TS Nguyễn Văn Hân, người tận tình bảo, hướng dẫn phương pháp nghiên cứu khoa học, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới DS Vũ Văn Tuấn, DS Trần Trọng Biên, người thầy, người anh bảo tận tình giúp đỡ hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện giúp hoàn thành khóa luận Cuối xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh ủng hộ, khích lệ, giúp đỡ lúc khó khăn để đạt kết ngày hôm Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Lê Hữu Huy MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁCCHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Vài nét Dành dành 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tính vị công 1.1.6 Công dụng 1.2 Iridoid 1.2.1 Tổng quan nhóm hoạt chất Iridoid glycosid 1.2.2 Geniposid 1.3 Một số nghiên cứu phân lập iridoid từ Dành dành 1.4 Nhựa macroporous 1.4.1 Giới thiệu 1.4.2 Phân loại đặc tính nhựa Macroporous 1.4.3 Các ứng dụng nhựa Macroporous hấp phụ 10 1.4.4 Nhựa Macroporous D101 11 Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1 Nguyên vật liệu 12 2.1.2 Thiết bị 12 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.2.1 Nghiên cứu phân lập iridoid toàn phần từ Dành dành sử dụng nhựa Macroporous D101 13 2.2.2 Nghiên cứu phân lập geniposid từ iridoid toàn phần 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp chiết xuất iridoid từ Dành dành 14 2.3.2 Phương pháp xử lý dịch chiết Dành dành 14 2.3.3 Phương pháp xử lý xác định tỉ lệ nhựa Macroporous D101 sử dụng 15 2.3.4 Phương pháp phân lập iridoid từ dịch chiết xử lý 15 2.3.5 Phương pháp phân lập geniposid từ iridoid tinh chế .15 2.3.6 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm 16 2.3.7 Phương pháp bán định lượng iridoid sắc ký lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang TLC Scanning 17 2.3.8 Xác định cấu trúc sản phẩm 18 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Chiết xuất phân lập iridoid toàn phần từ Dành dành 20 3.1.1 Chiết xuất iridoid từ Dành dành 20 3.1.2 Khảo sát xử lý dịch chiết 23 3.1.3 Xác đinh tỉ lệ hạt nhựa sử dụng 25 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol dùng giải hấp phụ iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 26 3.2 Phân lập geniposid từ iridoid toàn phần 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT μL Micro lít Μm Micro mét 13 C NMR Carbon 13 nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 H NMR Proton nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton BV Bed volume Thể tích phần cột ứng với chiều cao nhựa cm Centimet ED50 Effective dose Liều có hiệu 50% số vật thí nghiệm DMSO Dimethyl sulfoxid HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao HSCCC High-Speed Counter-Current Chromatography Sắc ký phân bố tốc độ cao g Gam MS Mass spectrometry Phổ khối mg Mili gam mL Mili lít m Mét IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry Liên minh Quốc tế Hóa học túy Hóa học ứng dụng IR Infrared spectrometry Phổ hồng ngoại TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng v/v Tỉ lệ thể tích h Giờ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Dành dành - Gardenia jasminoides Hình 1.2 Dược liệu chi tử - Dành dành Hình 1.3 Cấu trúc hóa học geniposid Hình 1.4 Hình ảnh nhựa Macroporous D101 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ phân đoạn ngấm kiệt với dung môi 21 ethanol nồng độ khác Hình 3.2 Hình ảnh pic TLC - Scanning 23 Hình 3.3 Sản phẩm phẩm iridoid sau tinh chế theo phương án A 25 Hình 3.4 Hình ảnh sản phẩm thu với nồng độ ethanol 28 rửa giải ethanol 10%(a), ethanol(b), ethanol (c) ethanol 20% Hình 3.5 Hình ảnh chất màu di chuyển trình rửa giải 29 với ethanol 40% Hình 3.6 Sắc ký lớp mỏng iridoid tinh chế geniposid phân lập 31 Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ HPLC mẫu sản phẩm 32 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập iridoi từ Dành 30 dành DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số đặc điểm kỹ thuật nhựa macroporous D101 11 Bảng 2.1 Danh mục dung môi hóa chất 13 Bảng 3.1 Kết đo diện tích pic mỏng sắc ký 22 Bảng 3.2 Kết khối lượng nhiệt độ nóng chảy sản 24 phẩm khảo sát loại tạp trước hấp phụ lên cột nhựa Macroporous D101 Bảng 3.3 Kết rửa giải iridoid từ Dành dành với 27 nồng độ ethanol rửa giải khác Bảng 3.4 Kết phổ IR sản phẩm phân lập 33 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ 13C - NMR geniposid 34 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ 1H – NMR geniposid 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Dành dành mọc hoang trồng nhiều vùng miền Bắc nước ta Tại miền núi, Dành dành thường mọc ven suối Tại đồng bằng, nhân dân thường thường trồng làm cảnh lấy làm thuốc hay để nhuộm bánh trái thành màu vàng (bánh xu xê, thạch) [7] Iridoid thành phần có Dành dành Nó có nhiều tác dụng giảm đau, kháng khuẩn, chống viêm, lợi mật [11], hạ đường huyết [10] Các phương pháp phân lập iridoid có sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao, hệ dung môi, dùng silicagel, sử dụng nhựa macroporous, Trong phương pháp sử dụng nhựa macroporous có nhiều ưu điểm: chi phí thấp, đặc tính chọn lọc tốt tốc độ hấp phụ nhanh chóng, trình tái sử dụng đơn giản Trên sở đó, đề tài “Bước đầu nghiên cứu ứng dụng nhựa Macroporous D101 phân lập iridoid từ Dành dành” thực với mục tiêu: Phân lập iridoid toàn phần từ Dành dành sử dụng nhựa Macroporous D101 Phân lập geniposid từ iridoid toàn phần TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1.Nguyễn Kim Bích cộng (2006), Phân tích xác định đặc điểm hóa học đặc trưng dược liệu phục vụ công tác tiêu chuẩn hóa, Viện Dược liệu - Bộ Y tế, tr.13 - 14 2.Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau đại học, Đại học Dược hà nội 3.Bộ môn Công nghiệp Dược (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, tập 1, Đại học Dược Hà Nội, tr.21 - 23 4.Bộ môn Dược liệu (2004), Bài giảng dược liệu, Tập 1, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.190-197 5.Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt nam, Nhà xuất Y học, tr.354 6.Nguyễn Việt Hà (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn Geniposid từ dành dành (Fructus Gardenia) phục vụ công tác kiểm tra chất lượng thuốc, Luận văn Thạc sỹ dược học, Đại học Dược Hà Nội 7.Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt nam, nhà xuất Y học, tr.225 - 227 8.Trần Thị Ngọc (2006), Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ chế biến đến thành phần hóa học tác dụng sinh học chi tử, Luận văn Thạc sỹ dược học, Đại học Dược Hà Nội 9.Lê Quý Ngưu Trần Như Đức (1995), Phương pháp trị bệnh từ cỏ hoang dại, Nhà xuất Thuận Hóa, tr.369 10.Nguyễn Thị Ngọc Thùy (2008), Nghiên cứu chiết xuất iridoid tác dụng hạ đường huyết vị thuốc chi tử (fructus Gardeniae), Khóa luận Dược sỹ đại học, Đại học Dược Hà Nội 11.Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc Động vật làm thuốc Việt nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr.596-600 Tài liệu Tiếng Anh 12.Endo T Taguchi H (1973), "The Constituents of Gardenia jasminoides Geniposide and Genipin - gentiobioside", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 21(12), pp.2684 - 2688 13.Feng J et al (2014), "Preparative separation of crocins and geniposide simultaneously from gardenia fruits using macroporous resin and reversed ‐ phase chromatography", Journal of separation science 37(3), pp.314 - 322 14.Lelono R A et al (2009), "Isolation of antifungal compounds from Gardenia jasminoides", Pakistan journal of biological sciences: PJBS 12(13), pp.949 - 956 15.Li J et al (2010), "Development of adsorptive (non - ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologically - active natural products from plant sources", Natural product reports 27(10), pp.1493 - 1510 16.Machida K et al (2003), "Studies on the constituents of Gardenia species III New iridoid glycosides from the leaves of Gardenia jasminoides cv fortuneana Hara", Chemical and pharmaceutical bulletin 51(12), pp.1417 1419 17.Mattiasson B et al (2009), "Macroporous polymers: production properties and biotechnological/biomedical applications", CRC Press, pp.211 - 267 18.Tsai T R et al (2002), "Identification and determination of geniposide contained in Gardenia jasminoides and in two preparations of mixed traditional Chinese medicines", Journal of Chromatography A 961(1), pp.83 - 88 19.Xu R et al (2011), "Introduction to Natural Products Chemistry", CRC Press, p.19 20.Zhao C (2007), "Study for the extraction technology of Gardenoside from Gardenia jasminoides [J]", Journal of Henan University (Medical Science), p.13 21.Zhou T et al (2007), "Isolation and purification of iridoid glycosides from Gardenia jasminoides Ellis by isocratic reversed-phase two-dimensional preparative high-performance liquid chromatography with column switch technology", Journal of Chromatography B 858(1), pp.296-301 22.Zhou X Q et al (2007), "A new iridoid glycoside from Gardenia jasminoides", Chinese Chemical Letters 18(10), pp.1221-1223 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ IR geniposid tinh chế Phụ lục 2: 1H - NMR geniposid tinh chế Phụ lục 3: 1H - NMR giãn geniposid tinh chế Phụ lục 4: 1H - NMR giãn geniposid tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 5: 1H - NMR giãn geniposid tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 6: 1H - NMR giãn geniposid tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 7: 13C - NMR geniposid tinh chế Phụ lục 8: 13C - NMR giãn geniposid tinh chế Phụ lục 9: 13C - NMR giãn geniposid tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 10: Phổ MS negative geniposid tinh chế Phụ lục 11: Phổ MS positive geniposid tinh chế Phụ lục 1: Phổ IR geniposid tinh chế Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR geniposide tinh chế Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR giãn geniposide tinh chế Phụ lục 4: Phổ 1H-NMR giãn geniposide tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR giãn geniposide tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR giãn geniposide tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 7: Phổ 13C-NMR geniposide tinh chế Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR giãn geniposide tinh chế Phụ lục 9: Phổ 13C-NMR giãn geniposide tinh chế (tiếp theo) Phụ lục 10: Phổ MS negative geniposid tinh chế Phụ lục 11: Phổ MS positive geniposid tinh chế [...]... n – hexan Trung Quốc 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu phân lập iridoid toàn phần từ quả Dành dành sử dụng nhựa Macroporous D101 Nghiên cứu chiết xuất iridoid từ quả Dành dành Nghiên cứu xử lý dịch chiết Dành dành Nghiên cứu hấp phụ và giải hấp phụ iridoi với nhựa Macroporous D101 14 2.2.2 Nghiên cứu phân lập geniposid từ iridoid toàn phần Nghiên cứu phân lập geniposid, kiểm tra độ sạch và... phụ 400mL dịch chiết xử lý (tương đương 2BV) lên 100g hạt nhựa Macroporous D101 Tương đương 100g được liệu được phân lập iridoid sử dụng 100g nhựa Macroporous D101 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol dùng giải hấp phụ iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 a Mục đích: khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol giải hấp phụ iridoid từ nhựa Macroporous D101 với các nồng độ ethanol 10%, ethanol 20%, ethanol 30%... nhựa ứng với 1BV=200mL), rửa cột với 3BV nước cất  Mẫu 1: rửa giải iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 với dung môi ethanol 10%  Mẫu 2: rửa giải iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 với dung môi ethanol 20%  Mẫu 3: rửa giải iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 với dung môi ethanol 30%  Mẫu 4: rửa giải iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 với dung môi ethanol 40% 27 - Ghi lại thể tích dịch rửa giải... D101 trong ethanol 96% trong 24giờ Sau đó lần lượt ngâm trong dung dịch HCl 5% và NaOH 5% trong 4giờ Rửa sạch nhựa Macroporous D101 đến pH trung tính bằng nước cất Ngâm nhựa trong nước cất [13] Cho nhựa Macroporous D101 đã xử lý lên cột sắc ký b Xác định tỉ lệ hạt nhựa Macroporous D101 sử dụng: - Chuẩn bị cột nhựa Macroporous D101 sử dụng 100g hạt nhựa (1BV tương đương 200mL) - Chuẩn bị 2000mL dịch chiết... Các ứng dụng của nhựa Macroporous hấp phụ Công nghệ nhựa hấp phụ Macroporous lần đầu tiên được sử dụng trong xử lý nước thải, công nghiệp dược, công nghiệp hóa chất, hóa phân tích, thử nghiệm lâm sàng và điều trị cùng nhiều lĩnh vực khác Những năm gần đây nhựa Macroporous đã được sử dụng nhiều trong chiết xuất hoạt chất, tách, phân lập ở Trung Quốc với thảo dược Trong y học cổ truyền Trung Quốc, ứng dụng. .. hấp phụ iridoid sử dụng cột nhựa Macroporous D101: - Thêm dịch chiết đã xử lý lên cột nhựa Macroporous D101 Điều chỉnh tốc độ dòng 2BV/h 16 - Rửa giải với 3BV nước cất qua cột nhựa Macroporous D101 Điều chỉnh tốc độ dòng 3BV/h - Rửa giải iridoid từ cột nhựa Macroporous D101 với ethanol nồng độ thích hợp Điều chỉnh tốc độ dòng 2BV/h Sau mỗi BV dịch rửa giải, định tính iridoid trong dịch sau cột bằng sắc... mẫu tiến hành phân lập với nhựa Macroporous D101: Hấp phụ độc lập dịch chiết không xử lý, xử lý theo phương án A và phương án B lên cột nhựa Macroporous D101 (100g hạt nhựa ứng với 1BV = 200mL) Rửa cột với 3BV nước, tốc độ 3BV/h Rửa giải cột nhựa Macroporous D101 với dung môi ethanol 20%, tốc độ 2BV/h Cất quay dưới áp suất giảm dịch rửa giải đến cắn Sấy cắn ở tủ sấy 60oC trong 3giờ được iridoid thô,... chiết quả Dành dành được cô quay dưới áp suất giảm đến cắn Hòa tan lại thành 200mL với nước cất Dung dịch nước được lắc 3 lần, mỗi lần với 100mL n - hexan Gạn lấy lớp nước, bổ sung thành 400mL với nước cất 2.3.3 Phương pháp xử lý và xác định tỉ lệ nhựa Macroporous D101 sử dụng: a Chuẩn bị cột nhựa Macroporous D101: Cân nhựa Macroporous D101 Ngâm nhựa Macroporous D101 trong ethanol 96% trong 24giờ Sau... công nghệ nhựa Macroporous có nhiều ưu điểm trong nâng cấp công thức y học cổ truyền, thúc đẩy sự phát triển trong các nghiên cứu trong việc hiện đại hóa y học cổ truyền Nhựa Macroporous có các đặc tính chọn lọc tốt, độ bền cơ học cao, và tốc độ hấp phụ nhanh chóng, cũng như quá trình tái sử dụng đơn giản Vì vậy, nhựa Macroporous rất thích hợp sử dụng trong việc tách các hợp chất phân cực thấp từ dung... trong3 giờ, ta được iridoid thô Cân khối lượng iridoid thô - Kết tủa lại iridoid thô trong aceton Hòa tan iridoid thô với 300mL aceton nóng, cất quay dước áp suất giảm đến 100mL, để lạnh 8oC trong 24giờ Lọc lấy tủa, sấy tủa ở tủ sấy 60oC trong 6giờ được iridoid tinh chế Cân khối lượng và đo nhiệt độ nóng chảy iridoi tinh chế c Ta được kết quả bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết quả rửa giải iridoid từ quả Dành dành