Ứng dụng nhựa macroporous d101 trong chiết xuất steviol glycosid từ lá cỏ ngọt (stevia rebaudiana bert )

Đã có một số công trình trong nước nghiên cứu chiết xuất, phân lập các steviol glycosid trong cỏ ngọt, tuy nhiên các biện pháp sử dụng đã cũ và sử dụng nhiều dung môi độc hại.. Những năm

(Stevia rebaudiana Bert.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

(Stevia rebaudiana Bert )

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hân

Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

TS Nguyễn Văn Hân người thầy trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi

trong suốt thời gian thực hiện khóa luận Bằng tất cả kinh nghiệm và sự nhiệt tình, thầy

đã giúp đỡ và truyền cảm hứng cho tôi trên con đường nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Trần Trọng Biên đã luôn quan tâm, giúp đỡ và

chỉ bảo cho tôi, giúp tôi tháo gỡ những khó khăn trong quá trình thực hiện khóa luận Tiếp theo tôi xin chân thành cảm ơn anh Mai Văn Kiên lớp M1K66, bạn Nguyễn Đức Huy lớp M1k67 và em Nguyễn Ngọc Quỳnh lớp A5k69 – những người luôn ở bên giúp đỡ và động viên tôi và trực tiếp giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận một cách suôn sẻ

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các bộ môn và phòng ban, các thầy cô cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt năm năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè – những người đã luôn ủng hộ, động viên và yêu thương tôi trong suốt thời gian vừa qua

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong có được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên

Hà Nội, tháng 5 năm 2017

Sinh viên Trần Thị Bích

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 9

DANH MỤC CÁC BẢNG 10

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về cây cỏ ngọt 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố, sinh thái 2

1.1.3 Thành phần hóa học 2

1.1.4 Tác dụng dược lý 3

1.1.5 Công dụng 3

1.1.6 Các steviol glycosid 4

1.1.7 Một số nghiên cứu về chiết xuất và phân lập steviol glycosid từ cỏ ngọt 6

1.2 Nhựa macroporous 8

1.2.1 Khái niệm 8

1.2.2 Nhựa macroporous D101 9

1.2.3 Phân loại 9

1.2.4 Đặc tính nhựa macroporous 10

1.2.5 Cơ chế hấp phụ 10

1.2.6 Sản xuất nhựa Macroporous 11

1.2.7 Ứng dụng trong phân lập các hoạt chất từ thiên nhiên của hạt nhựa macroporous D101 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 14

1.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Tạo dịch chiết lá cỏ ngọt 15

2.2.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và phản hấp phụ steviol glycosid từ dịch chiết trên cột nhựa D101 16

2.2.3 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế steviol glycosid quy mô mẻ 1 kg lá cỏ ngọt khô 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp định lượng Reubaudiosid A 16

2.3.2 Phương pháp tạo dịch chiết cỏ ngọt 18

2.3.3 Phương pháp phân lập steviol glycosid từ dịch chiết cỏ ngọt 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả thẩm định phương pháp định lượng TLC-scanning 23

3.2 Tạo dịch chiết cỏ ngọt 25

3.2.1 Chiết xuất steviol glycosid từ lá cỏ ngọt 25

3.2.2 Xử lý sơ bộ dịch chiết 26

3.3 Kết quả khảo sát quá trình loại tạp trên nhựa macroporous D101 27

3.3.1 Khảo sát quá trình hấp phụ steviol glycosid từ dịch chiết cỏ ngọt lên nhựa macroporous D101 27

3.3.2 Khảo sát quá trình phản hấp phụ steviol glycosid từ nhựa macroporous D101 28 3.3.3 Kết quả tinh chế steviol glycosid toàn phần 32

3.4 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế steviol glycosid từ mẻ 1 kg lá cỏ ngọt 34

BÀN LUẬN 37

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Đề xuất 40

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Bộ khung của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 4

2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của steviosid (1) và ReA (2) 5

7 Hình 3.3 Kết quả SKLM dịch chiết nước cỏ ngọt 25

9 Hình 3.4 Biểu đồ hiệu suất thu hồi ReA sử dụng các dung môi phản

10 Hình 3.5 Kết quả SKLM trước và sau quá trình phân lập steviol

13 Hình 3.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất và phân lập steviol

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Cấu trúc của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt 5

2 Bảng 1.2 Một số đặc điểm của steviosid và ReA 6

3 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14

4 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tính tích hợp hệ thống 23

7 Bảng 3.4 Kết quả dung lượng hấp phụ ReA của hạt nhựa D101 27

8 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của tốc độ nạp dịch đến dung lượng

9 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ phản hấp phụ

10 Bảng 3.7 Kết quả sự thay đổi hàm lượng ReA trong cắn thô trước

và sau quá trình phân lập steviol glycosid trên hạt nhựa D101 31

12 Bảng 3.9 Kết quả quá trình chiết xuất và tinh chế steviol glycosid

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, việc tiêu thụ saccharose ở mức cao đang gây ra những vấn đề về dinh dưỡng và y tế như: tiểu đường, béo phì, huyết áp, sâu răng…khiến nhu cầu sử dụng các loại đường ăn kiêng đang ngày càng tăng mạnh Điều này đã thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm các loại đường ăn kiêng thay thế cho saccharose, đặc biệt các loại đường

ăn kiêng có nguồn gốc từ thiên nhiên mà điển hình là các steviol glycosid trong cây cỏ ngọt.[25]

Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) và các sản phẩm từ cỏ ngọt đang được sử dụng

rất phổ biến trên thế giới Ở Việt Nam cỏ ngọt được trồng ở nhiều nơi và được sử dụng phổ biến ở dạng cao thuốc hoặc trà [2] Đã có một số công trình trong nước nghiên cứu chiết xuất, phân lập các steviol glycosid trong cỏ ngọt, tuy nhiên các biện pháp sử dụng

đã cũ và sử dụng nhiều dung môi độc hại

Những năm gần đây, nhựa macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên Chúng có nhiều ưu điểm như: Loại bỏ tạp chất, làm giàu hoạt chất, không sử dụng đến các dung môi hữu cơ độc hại, khả năng lặp lại và ổn định tốt, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp Tuy nhiên, việc sử dụng các nhựa macroporous trong quá trình tinh chế - biện pháp thay thế xanh cho các dung môi độc hại đang là một hướng đi tiềm năng mà

ở Việt Nam chưa có công trình nào về cỏ ngọt được thực hiện

Nhằm phát triển hướng đi mới hiệu quả, kinh tế và thân thiện với môi trường,

chúng tôi thực hiện đề tài: ”Ứng dụng nhựa macroporous D101 trong chiết xuất

steviol glycosid từ lá cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.)’’ với 2 mục tiêu sau :

1 Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và phản hấp phụ steviol glycosid trên nhựa macroporous D101

2 Xây dựng được phương pháp chiết xuất steviol glycosid từ dịch chiết lá

cỏ ngọt sử dụng nhựa macroporous D101

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về cây cỏ ngọt

Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley

ở ngọn thân Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ [9], [11]

1.1.2 Phân bố, sinh thái

Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bert.) có nguồn gốc từ Brazin và Paraguay Ngày nay,

cỏ ngọt được trồng và sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Mỹ, châu Âu, Châu Á [3], [18] Từ 1988, cỏ ngọt di thực vào Việt Nam và hiện nay được trồng phổ biến tại nhiều vùng như: Cao Bằng, Lâm Đồng, Hà Giang, Thái Nguyên Cỏ ngọt ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kì cây con Cây cỏ ngọt tỏ ra thích nghi

với điều kiện khí hậu nhiệt đới ở Việt Nam [1], [3], [9]

1.1.3 Thành phần hóa học

Lá cỏ ngọt chứa:

- Các ent – kauren diterpen glycosid hay còn gọi là các steviol glycosid Chúng

là nguồn gốc tạo nên vị ngọt của cỏ ngọt [5], [9], [11] Tùy thuộc vào điều kiện trồng trọt và giống mà tỷ lệ và hàm lượng các thành phần thay đổi [12], [21], [25]

- Các labdan diterpen gồm jhanol, austroinulin, 6 – 0 – Acetylaustroinulin

- Các triterpen gồm β – amyrin acetat, lupeol

- Các thành phần khác gồm các acid amin, β – sitosterol, fructooligosaccharid stigmasterol, tanin, gôm, sterebins A tới H và tinh dầu (0,12 – 0,43%) [8], [9], [21]

 Tác dụng khác

Một số tác dụng khác của các steviol glycosid là khả năng chống ung thư, khả

năng kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa [9], [19]

 Đánh giá mức độ an toàn

Một số đánh giá an toàn của một số chất chiết xuất từ cỏ ngọt đã được thực hiện để xác minh mức độ độc tính, đột biến, gây ung thư và các vấn đề liên quan đến khả năng sinh sản Tất cả các kết quả đều là âm tính Những kết quả này xác nhận các steviol glycosid trong cỏ ngọt an toàn cho con người kể cả khi sử dụng kéo dài [11], [15]

1.1.5 Công dụng

Trong công nghiệp thực phẩm, các steviol glycosid có độ ngọt cao và có nguồn gốc tự nhiên, ổn định ở nhiệt độ lên đến 2000C và trong khoảng pH rộng (2-10), không lên men, thích hợp để sử dụng trong sản xuất bánh kẹo, đường uống trà, cà phê [1], [25]

Trong y học, cỏ ngọt và chiết xuất của nó được dùng cho bệnh nhân bị bệnh đái tháo đường, béo phì, cao huyết áp Ngày nay, người ta còn dùng steviol glycosid để bao bọc các thuốc đắng Ở Việt Nam, cỏ ngọt được dùng đơn độc dưới dạng trà hay kết hợp với các loại thảo mộc khác trong các thang thuốc y học cổ truyền

1.1.6 Các steviol glycosid

Các steviol glycosid dạng bột có màu trắng tới vàng sáng, không có mùi hoặc có mùi nhẹ đặc trưng Các steviol glycosid tan tốt trong nước [16] Các steviol glycosid có hàm lượng và vị ngọt ở mức độ khác nhau Bốn steviol glycosid có hàm lượng cao nhất, được đề cập nhiều nhất trong các tài liệu tham khảo là: steviosid (5-10%), Rebaudiosid (ReA) (2-4%), rebaudiosid C (1-2%), dulcosid A (0,5-1%) [15], [25] Các steviol glycosid ngọt hơn rất nhiều so với đường saccharose Trung bình vị ngọt của chúng gấp 250-300 lần đường saccharose, trong đó 2 thành phần chính là steviosid (gấp 250-300 lần) và ReA (gấp 250-450 lần) [21]

Các steviol glycosid có phần khung aglycon chung (còn được gọi là khung Steviol) và khác nhau chính ở thành phần và số gốc đường gắn vào khung Steviol Cấu tạo của các steviol glycosid được trình bày ở hình 1.1 và bảng 1.1 [5], [15], [16], [21]

Hình 1.1 Bộ khung của các steviol glycosid chiết xuất từ lá cỏ ngọt

Bảng 1.1 Cấu trúc của các steviol glycosid chiết xuất từ cỏ ngọt

Steviosid và ReA là hai thành phần đã được xác định rõ các đặc tính vật lý và cảm quan Đây cũng là 2 thành phần chịu trách nhiệm chính cho vị ngọt của lá cỏ ngọt, chúng chiếm khoảng 90% tổng steviol glycosid [13], [15]

Bảng 1.2 Một số đặc điểm của steviosid và ReA

Steviosid [8], [26] ReA [8]

Tên khoa học

(13[(20 D glucopyranosyl -D-glucopyranosyl) oxy]

-kaur-16-en-18-oic acid, glucopyranosyl ester

-D-(13-[(2-O- -D 3-O- -D-glucopyranosyl- -D-glucopyranosyl) oxy] kaur-16-en-18-oic acid, -D-

ReA là bột vô định hình, màu trắng

Nhiệt độ nóng

1.1.7 Một số nghiên cứu về chiết xuất và phân lập steviol glycosid từ cỏ ngọt

Chiết xuất và phân lập steviol glycosid từ lá cỏ ngọt là lĩnh vực nghiên cứu hoạt động từ rất sớm Trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều đề tài được triển khai

 Trên thế giới

Những nghiên cứu đầu tiên về việc chiết xuất và phân lập các steviol glycosid từ lá

cỏ ngọt được ghi nhận từ rất sớm, đặc biệt các đề tài ứng dụng các loại nhựa macroporous trong quá trình phân lập hoạt chất tinh khiết

Payzant (1999) phát triển phương pháp như sau: dịch nước cỏ ngọt thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi ion được tiếp tục cho qua cột nhựa Amberlite XAD-7 và được phản hấp phụ bằng methanol Dịch methanol chứa trên 95% steviol glycosid của dung dịch thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi ion Cắn khô thu được được hồi lưu rồi kết tinh trong methanol, thu được steviosid Dịch lọc để kết tinh tiếp thu được ReA Kết tinh lại nhiều lần trong methanol thu được ReA tinh khiết đến 95% Nghiên cứu đã phân lập được steviosid và ReA từ hỗn hợp glycosid, tuy nhiên nhược điểm là thời gian tạo steviol glycosid toàn phần quá dài [28]

Patent US7923541 cũng đưa ra một phương pháp phân lập và làm tinh khiết hai hoạt chất chính là steviosid và ReA như sau Bột dược liệu được tiến hành chiết xuất với hỗn hợp ethanol-nước bằng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng liên tục ở 70-80oC hoặc chiết siêu âm Dịch chiết sau khi được lọc loại tạp dưới áp lựa cao sẽ được hấp phụ lên cột nhựa phân cực chọn lọc sau đó phản hấp phụ với ethanol 50-60% Thu được ReA có hàm lượng 65% Dịch phản hấp phụ được tiến hành kết tinh ở -20o

C khuấy liên tục trong 24 giờ thu được ReA 85% Lặp lại quá trình tái kết tinh 1 lần nữa thu được ReA tinh khiết 99% [30]

Liu et al (2011) đề xuất phương pháp phân lập và làm tinh khiết ReA từ hỗn hợp steviol glycosid từ dịch chiết lá cỏ ngọt bằng cách cho dịch chiết cỏ ngọt chạy qua cột nhựa macroporous được trộn vật lý bởi 4 loại nhựa: HPD750, LSA-40, O7C, LX-68M (2:3:2:2) Kết quả thu được ReA từ 40,77% lên 60,53% Hiệu suất thu hồi tổng lên tới 96,34% [23]

 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, cũng đã có những nghiên cứu ban đầu về việc chiết xuất và phân lập steviol glycosid từ lá cỏ ngọt được ghi nhận

Nguyễn Ngọc Sương, Nguyễn Đức Thắng (1996) đưa ra 2 quy trình: chiết với

nước và với n-hexan Quy trình chiết nước như sau: Bột dược liệu được chiết kiệt với nước ở 80°C Cô đặc dịch chiết đã lọc rồi chiết với n-butanol Cô dung môi tới cắn, sau

đó hòa tan cắn trong methanol nóng Kết tinh nhiều lần thu steviosid [6]

Võ Thị Thừa (2010) đưa ra quy trình sản xuất đường từ lá cỏ ngọt: Bột dược liệu hồi lưu 4 lần với ethanol Dịch chiết được cô tới rắn Hòa tan rắn bằng nước nóng, lọc

Loại bỏ mỡ bằng ether dầu rồi cô đặc Chiết steviosid bằng n-butanol bão hòa nước Cất thu hồi n-butanol và cô đặc được rắn steviosid thô Kết tinh lại trong methanol

[10]

Lê Thị Thọ (2011) chiết xuất steviosid theo các bước: Chiết lá cỏ ngọt bằng nước nóng (65ºC/4 giờ, tỷ lệ dung môi/dược liệu (m/v) = 1/35) Loại tạp chất bằng calci hydroxyd Tách steviol glycosid bằng cột Diaion HP-20 Phản hấp phụ bằng hệ dung môi ethanol 75% Cắn được kết tinh 2 lần trong methanol [4]

Trịnh Thị Vân (2014) đề xuất phương pháp chiết xuất và phân lập 2 hoạt chất chính là steviosid và ReA như sau: Bột dược liệu chiết với nước nóng ở 60oC Loại tạp bằng calci hydroxyd, trung hòa bằng acid citric 10% Dịch lọc sau đó được tinh chế với

n-butanol bão hòa nước Cô lấy cắn thô, kết tinh qua đêm trong methanol ở -5oC qua đêm thu được steviol glycosid thô Hòa tan steviol glycosid thô vào methanol nóng Để kết tinh qua đêm thu tủa Lặp lại nhiều lần như trên để thu được steviosid tinh khiết Tiếp tục xử lý nước cái bằng cách cô thu hồi dung môi và để kết tinh ở -5oC qua đêm thu được ReA tinh khiết [8]

1.2 Nhựa macroporous

1.2.1 Khái niệm

Nhựa macroporous là hạt polyme hình cầu, có cấu trúc xốp với các lỗ lớn trên

bề mặt, có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu

để tách các nhóm chất khác nhau [31]

Hình 1.3 Nhựa macroporous D101

1.2.2 Nhựa macroporous D101

Nhựa macroporous D101 (hạt nhựa D101) là hạt nhựa được tạo ra bằng phương pháp trương nở tạo hạt SDBV (poly(styren-divinylbenzen)) Nhựa SDBV được tạo ra bằng phương pháp trùng hợp 2 monome là styren và divinylbenzen Trong đó divinylbenzen là nhân tố tạo liên kết ngang [22], [24]

Hạt nhựa D101 được sử dụng trong đề tài được cung cấp bởi nhà sản xuất Anhui Sanxing Resin Technology Co.,Ltd Hạt nhựa D101 là nhựa macroporous không phân cực, có kích thước hạt 0,3-1,25 mm, diện tích bề mặt trong 500-550 m2/g, đường kính

lỗ xốp trung bình 9-10 mm, có độ xốp 50-60%, tỷ trọng 1-1,07 g/mL, độ ẩm 65-75%, thể tích lỗ xốp 1,18-1,24 mL/g

1.2.3 Phân loại

Dựa vào tính phân cực, nhựa macroporous có thể chia làm 2 loại chính: không phân cực và phân cực Theo độ phân cực lại chia thành phân cực yếu, phân cực trung bình và phân cực mạnh Hiện nay các nhựa macroporous thường được sử dụng gồm: D101, H103, (không phân cực); AB-8, HPD722, (phân cực yếu); ADS-17, LSA-10, (phân cực trung bình); NKA-9, NKA-2, (phân cực mạnh) [7], [17]

1.2.4 Đặc tính nhựa macroporous

Các đặc tính đặc trưng cho khả năng hấp phụ của nhựa macroporous gồm: tổng

diện tích bề mặt (bề mặt trong), đường kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt [22], [27] Diện tích bề mặt hạt thường nằm trong khoảng từ 100 đến 1000 m2/g

Đường kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 nm [22], [27], đường kính lỗ xốp gấp

khoảng 10-20 lần kích thước phân tử chất tan thì sự phân tách là tốt [24] Liu et al

(2011) cũng đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng, hạt nhựa có đường kính lỗ xốp

càng lớn thì độ tinh khiết của ReA càng cao [23]

Độ phân cực của các loại nhựa có thể thay đổi do việc lựa chọn các monome sử

dụng trong quá trình tổng hợp hoặc xử lý hóa học bổ sung sau trùng hợp Sự hấp phụ

của một loại nhựa macroporous phụ thuộc vào cấu trúc hình học của nó và có thể kiểm

soát bằng việc thay đổi các thành phần trong hỗn hợp phản ứng trùng hợp Kết quả là

các chất hóa học khác nhau trên bề mặt hấp phụ [22], [27]

1.2.5 Cơ chế hấp phụ

Việc hấp phụ hoạt chất thiên nhiên lên nhựa macroporous đặc biệt hấp dẫn do các

yếu tố như: thuận tiện, chi phí vận hành thấp, giảm tiêu thụ dung môi và dư lượng hóa

chất thấp trong sản phẩm cuối cùng [22], [27] Tùy thuộc vào bản chất của các

monome tham gia vào phản ứng trùng hợp mà chúng có các cơ chế hấp phụ khác nhau

Cơ chế hấp phụ các glycosid và flavonoid của hạt nhựa D101 được cho rằng do

sự tạo thành liên kết π-π giữa vòng phenyl kỵ nước của hạt nhựa D101 và vòng thơm

của glycoside, flavonoid [22], [27]

Hình 1.4 Liên kết π-π giữa vòng phenyl kỵ nước của nhựa SDBV và vòng thơm

Ngoài ra, đối với các steviol glycosid, người ta còn đưa ra một lập luận về sự phù hợp của việc hấp phụ các steviol glycosid lên hạt nhựa D101 như sau: Hạt nhựa D101

có đường kính lỗ xốp khoảng 13 nm, trong khi các glycosid có cấu trúc khung khoảng

1 nm Việc gắn các gốc đường vào khung Steviol làm tăng đường kính của các glycosid lên đến khoảng 2 nm Như vậy, do có đường kính lỗ xốp gấp khoảng 6 lần nên hạt nhựa D101 khá thích hợp trong việc lưu giữ các đường

Dung môi phản hấp phụ thường sử dụng là ethanol ở các nồng độ khác nhau

1.2.6 Sản xuất nhựa Macroporous

Các phương pháp đã được phát triển để sản xuất các polyme xốp, có kích thước lỗ lớn với hệ thống liên kết ngang lớn

Phương pháp 1: Sử dụng các chất độn (porogen) là các polyme hòa tan Phương

pháp này rất phổ biến nhưng có nhược điểm là khó có thể loại bỏ các polyme hòa tan

ra khỏi các hạt polyme sau quá trình trùng hợp

Phương pháp 2: Sử dụng chất độn là các hợp chất vô cơ để sản xuất nhựa

macroporous Ví dụ: vi cầu poly(glycidyl methacrylat-co-ethylen dimethacrylat) sử dụng calci cacbonat và các chất pha loãng hữu cơ để tạo ra porogen hỗn hợp Vật liệu thu được bằng phương pháp này có kích thước lỗ xốp phân bố rộng, tùy thuộc vào bản chất của porogen

Phương pháp 3: Phương pháp tích tụ hạt nano Phương pháp này gặp khó khăn

trong việc kiểm soát kích thước các lỗ xốp và khả năng tái sử dụng không tốt

Phương pháp 4: Ma và các đồng nghiệp (Zhou et al 2007) phát triển một phương

pháp trương nở tạo hạt nhựa SDBV có kích thước lỗ xốp lên đến 500 nm Các monome giai đoạn đầu bao gồm styren và tác nhân tạo liên kết ngang divinylbenzen, chất hoạt động bề mặt, chất pha loãng, và chất khởi đầu(benzoyl peroxid) Do nồng độ chất hoạt động bề mặt cao, rất nhiều micell đảo ngược được tạo ra ở giai đoạn đầu Sau giai đoạn này, dầu được phân tán trong pha nước, các micell trong những giọt dầu có thể hấp thụ nước từ pha nước và tạo thành một cấu trúc đồng nhất Giai đoạn nước vào

trong các giọt dầu hình thành các lỗ xốp trong hạt polyme Sự trùng hợp và tạo liên kết ngang (highly cross-linked) hình thành trong các giọt monome Kết quả quá trình tổng hợp ra các hạt có cấu trúc cầu, cứng, mờ đục hoặc trắng đục Các tác giả quan sát thấy chất hoạt động bề mặt có vai trò quan trọng trong việc hình thành các lỗ xốp trong hạt nhựa SDBV lớn, còn các lỗ xốp nhỏ liên quan đến bản chất và số lượng chất pha loãng được sử dụng [24]

Quá trình tạo hạt nhựa macroporous đồng thời tạo ra các đặc tính quan trọng đặc trưng cho mỗi loại hạt Vì vậy có thể thông qua việc giải thích sự hình thành của các đặc tính để giải thích cho cơ chế hình thành của nhựa hấp phụ

a Sự gia tăng diện tích bề mặt bên trong

Sự có mặt của các tác nhân tạo liên kết ngang như divinylbenzen tạo ra một mạng lưới liên kết ngang lớn trong nội tại hạt nhựa Đồng thời quá trình tạo liên kết ngang còn làm tăng đáng kể thể tích lỗ xốp của hạt nhựa

b Sự tạo thành hệ thống lỗ xốp

Cơ chế 1: Cấu trúc xốp của hạt nhựa macroporous là do sự có mặt của các chất pha

loãng Các chất pha loãng có thể là polyme trơ hoặc polyme mạch thẳng hoặc chất độn không polyme hóa (porogen) như (toluen, n-heptan, iso-octan và isobutanol) Chất pha loãng thường tan trong các monome nhưng không tan trong pha liên tục của giai đoạn trùng hợp Các phản ứng gãy vỡ khối xốp tạo ra các hạt trong pha lỏng tách pha liên tục Các hạt mới được liên tục tạo thành do sự phân chia liên tiếp của các polyme đang phát triển Việc tích tụ các vi cầu dẫn đến sự hình thành của 1 gel không đồng nhất gồm 2 giai đoạn liên tục: giai đoạn gel và giai đoạn pha loãng Khi loại bỏ các chất pha loãng tự mạng sẽ tạo thành các lỗ rỗng có kích thước từ 1 nm đến 1000 nm ở trạng thái thủy tinh hóa của polyme

Cấu trúc xốp được hình thành khi số lượng chất pha loãng đạt đến giá trị nhất định Bản chất và số lượng chất pha loãng là những yếu tố quan trọng quyết định độ xốp của hạt

 Tăng nồng độ chất pha loãng thì thể tích lỗ xốp tăng

 Thêm chất pha loãng solvat hóa vào một lượng lớn chất tạo liên kết ngang sẽ tạo ra hạt nhựa có thể tích lỗ xốp tương đối thấp, đường kính lỗ xốp nhỏ và có diện tích bề mặt riêng lớn (50-100 m2/g) Ngược lại, sự bổ sung các chất pha loãng không solvat hóa tạo ra hạt nhựa có thể tích lỗ xốp lớn, đường kính lỗ xốp trung bình hoặc lớn, và có diện tích bề mặt khác nhau từ 10-100 m2/g

 Thêm các chất pha loãng như polyme mạch thẳng tạo ra các hạt có đường kính

lỗ xốp cỡ micromet, diện tích bề mặt riêng nhỏ (1-10 m2/g) Cần chú ý rằng những thông số trên có thể thay đổi đáng kể nếu thay đổi nồng độ chất tạo liên kết ngang

Cơ chế 2: Cơ chế tạo cấu trúc xốp bằng phương pháp đông khô Tuy nhiên trạng

thái xốp này không bền và dễ bị sụp đổ khi đun nóng hoặc quá trình de-swell bởi một dung môi như aceton

1.2.7 Ứng dụng trong phân lập các hoạt chất từ thiên nhiên của hạt nhựa macroporous D101

Những năm gần đây, nhựa macroporous được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chiết xuất, phân lập và tinh chế các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên như flavonoid, glycosid, saponin, carotenoid, [7], [22], [27]

Nhựa macroporous có ưu điểm như: khả năng làm giàu các thành phần hoạt chất, loại bỏ một lượng lớn các tạp chất, hạn chế sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, khả năng lặp lại và ổn định tốt, chi phí thấp, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [22], [27] Hạt nhựa D101 đã được Dược Điển Trung Quốc 2010 quy định sử dụng trong phân lập saponin từ Tam thất và flavonoid từ lá Bạch quả

Tuy nhiên, khả năng phân lập của nhựa macroporous phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện tiến hành, vì vậy, cần thiết thực hiện việc nghiên cứu, xác định các điều kiện thích hợp của quá trình hấp phụ và phản hấp phụ trên nhựa macroporous

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Mô tả dược liệu: Lá hình trái xoan hẹp, màu xanh lục vàng, dài từ 2,5 cm đến 4,0

cm, rộng 1,0 cm đến 1,8 cm hai mặt đều có long mịn, mép lá khía răng cưa Mặt trên

lá có 3 gân nổi rõ cùng xuất phát từ cuống lá; gân phụ phân nhánh Vị rất ngọt Đặc điểm nguyên liệu phù hợp với mô tả trong Dược Điển Việt Nam IV [2]

- Xử lí dược liệu: Dược liệu được sấy ở 50 trong 1 giờ và xay dược liệu, rây qua rây 2 mm thành bột dược liệu thô Hàm ẩm dược liệu là 7,65%

 Hạt nhựa macroporous D101

Ngâm nhựa D101 với ethanol 96% trong 24-48 giờ Gạt bỏ lớp váng bẩn trên lớp dung môi Lọc, rửa hạt nhựa D101 nhiều lần với nước cất Ngâm hạt nhựa D101 với nước cất trong 24 giờ Lọc, rửa hạt nhựa D101 bằng nước cất trên phễu lọc Buchner

2.1.2 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ

2.1.2.1 Hóa chất

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

1 Rebaudiosid A 95% (chất chuẩn) Trung Quốc

7 n-buthanol Trung Quốc

2.1.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị

 Hệ thống chiết siêu âm đầu dò Sonics& Materials, Inc ( Mỹ)

 Tủ sấy MEMMERT ( Đức)

 Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BO 2015 ( Đức )

 Cân phân tích Sartorius TE214S ( Đức)

 Máy cất quay chân không Buchi B-490 và R-220 ( Thụy Sĩ)

 Bản mỏng Silicagel GF254 ( MERCH )

 Thiết bị khuấy từ RH basic KT/C ( IKA)

 Thiết bị định lượng: Hệ thống sắc ký lớp mỏng CAMAG Reprostar 3 gồm: camera Hitachi HV-C20 3CCD, phần mềm chụp ảnh VideoStore 2 và phần mềm xử lý hình ảnh VideoScan 1.01 ( Thụy Sỹ)

 Cân xác định hàm ẩm nhanh OHAUS MB25 (Trung Quốc)

 Thiết bị siêu âm Wiseclean, daihan Labtech Co.Ltd ( Hàn Quốc)

Dụng cụ

 Bình thủy tinh chạy sắc ký lớp mỏng

 Màng lọc cellulose acetat 0,45 μm (Satorius)

Tiến hành chiết xuất thu dịch chiết nước lá cỏ ngọt bằng phương pháp ngâm nóng kết hợp sử dụng sóng siêu âm từ thiết bị siêu âm đầu dò Xử lý sơ bộ dịch chiết trước khi tiến hành phân lập steviol glycosid trên cột nhựa D101 bằng cách loại tạp bằng calci hydroxyd và trung hòa lại dịch chiết bằng acid citric 10%

2.2.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ và phản hấp phụ steviol glycosid từ dịch chiết trên cột nhựa D101

Xác định dung lượng hấp phụ ReA của hạt nhựa D101

Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ nạp dịch đến dung lượng hấp phụ ReA của nhựa D101

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản hấp phụ steviol glycosid từ

hạt nhựa D101 bao gồm: dung môi phản hấp phụ và tốc độ phản hấp phụ

2.2.3 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế steviol glycosid quy mô mẻ 1 kg lá cỏ ngọt khô

Sau khi lựa chọn các điều kiện của quá trình chiết xuất cũng như các thông số kĩ thuật liên quan đến việc sử dụng hạt nhựa Macroporous trong quá trình phân lập steviol glycosid, tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế steviol glycosid ở quy mô

mẻ 1 gg lá cỏ ngọt khô

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định lượng Reubaudiosid A

Định lượng ReA trong các mẫu thử bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp

đo mật độ vết (TLC-scanning) Tiến hành như sau :