Nghiên cứu chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt (stevia rebaudiana (bert ) hemsl ), họ cúc (asteraceae)

- Xem xét số lượng lớn các kết quả dương tính với test da trong nhóm trẻ em bị chàm, lá cỏ ngọt và steviosid có thể chứa một vài họp chất gây dị ứng phổ biến trong thực vật phản ứng chéo

1 Khoa Hóa thực vật -Viện Dược Liệu

2 Bộ môn Dược Liệu

ỊĩR Ư Ờ N a ĐH

HÀ N Ộ I-2011

các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:

TS Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo trong trưcmg, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong có được sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên

Hà Nội, tháng 5 năm 2011

Sinh viên

Lê Thị Thọ

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

Chương 1 TÔNG QUAN 3

1.1 VỀ THỰC VẬT 3

1.1.1 VỊ trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Phân b ố 4

1.1.4 Sinh thái 4

1.2 VỀ HÓA HỌC 4

1.3 ỨNG DỤNG CỦA CẦY c ỏ NG Ọ T 8

1.3.1 Công dụng 8

1.3.2 Tác dụng sinh học 8

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY c ỏ NGỌT 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Thiết bị, hóa chất 17

2.2 NỘI DƯNG NGHIÊN CÚXJ 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 18

Chương 3 THựC NGHIỆM , KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 20

3.1.1 Dự kiến các giai đoạn chính trong quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt 20

3.1.3 Khảo sát khả năng tách glycosid của một số cột nhựa hấp phụ23

3.1.4 Khảo sát hệ dung môi rửa giải cột Diaion HP-20 25

3.1.5 Khảo sát nhiệt độ của quá trình chiết suất 26

3.1.6 Khảo sát thời gian chiết suất 27

3.1.7 Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi của quá trình chiết suất 28

3.1.8 Khảo sát số lần chiết suất 30

3.1.9 Đánh giá khối lượng và độ tinh khiết của CNl trong quá trình tinh ch ế 31

3.1.10 Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20 33

3.1.11 Xác định cấu trúc của chất phân lập (Chất CN1) 36

3.1.12 Định lượng steviosid chiết được từ cỏ ngọt bằng phương pháp HPLC 40

3.2 BÀN LUẬN 41

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ N G ÍỈỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

EFSA - European Food Safety Authority

GFR - Glomerular filtration rate

Glc - Glucose

NOAEL - No Observed Adverse Effect LevelRha - Rhamnose

RPF - Renal plasma flow

SPiR - Spontaneously hypertensive rats

SKLM - Sắc ký lớp mỏng

SPT - Skin Prick Test

STT - Số thứ tự

Xyl - Xylose

bão hòa nước 23Bảng 3 Khảo sát hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt của một số cột nhựa hấp

p h ụ 26Bảng 4 : Sự ảnh hưởng của dung môi rửa giải cột đến hiệu suất chiết glycosid

từ cỏ ngọt 27Bảng 5 Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào nhiệt độ

28Bảng 6 Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian chiếtdược liệu 29Bảng 7 Sự phụ thuộc tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) trong quá trình chiếtdược liệu đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ n g ọ t 31Bảng 8 Sự ảnh hưởng của số lần chiết xuất đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ

n g ọ t 32Bảng 9 Khối lượng CNl thu được sau mỗi lần kết tinh lại 33Bảng 10: Dữ liệu phổ IH-NMR và 13C-NMR của chất C N l 39

Hình 3 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của Bùi ThịSong Sơn 16Hình 4 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt củaGiovanetto 18Hình 5 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt 24Hình 6 Ảnh chụp sắc ký đồ của CNl trong hệ dung môi CHClsiMeOHiHiO (15:8:1), hiện vết bằng dung dịch H 2 S O 4 10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100°c 34Hình 7 Qui trình chiết glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột nhựa Diaion HP-20 37Hình 8 Cấu trúc hóa học của CNl: Steviosid 41

đang ngày càng gia tăng trên toàn thế giới Nguyên nhân là do thói quen ăn nhiều đường và các thực phẩm có nhiều năng lượng nhưng lại ít vận động Vì thế, các nhà sản xuất thực phẩm và đồ uống luôn trong cuộc chạy đua tìm kiếm các chất làm ngọt mà ít có tính dinh dưỡng Việc sử dụng các sản phẩm hóa học tạo vị ngọt có thể được dùng để thay thế đưòng (saccharin, sodium cyclamat, sucralose và phổ biến nhất là aspartam) mặc dù rẻ và tiện lợi nhưng người ta vẫn e ngại ảnh hưởng về lâu dài của chúng đối với sức khoẻ Hiện nay, saccharin đã bị cấm sử dụng tại một số quốc gia, vì bằng thực nghiệm đã chứng minh chất này gây ung thư bàng quang ở chuột Aspartam không nên dùng cho những người bị bệnh Phenylketonuria Chính vì thế, cây cỏ ngọt và các chất chiết xuất từ cỏ ngọt đang ngày càng được nhiều người chú ý đến như là chất điều vị tuyệt vời, có thể thay thế đường, không chứa calo, thích hợp dùng cho cả người bị bệnh tiểu đường và béo phì.

Từ lâu, nhiều quốc gia trên thế giới đã sử dụng cỏ ngọt và các chất chiết từ cỏ ngọt Trung Quốc xem cỏ ngọt như một dược liệu thiên nhiên rất tốt để giúp làm giảm cân, ăn ngon và tiêu hóa tốt Nhật Bản là quốc gia sử dụng cây cỏ ngọt nhiều nhất trên thế giới Mỗi năm kỹ nghệ Nhật tiêu thụ từ

700 tấn đến 1000 tấn lá cỏ ngọt Một khối lượng lớn cỏ ngọt cần phải được nhập thêm từ Hàn Quốc, Đài Loan và Trung Quốc Việc sử dụng cỏ ngọt trên thế giới đã gây nhiều tranh cãi trong thời gian qua vì một số nghiên cứu trước đây cho rằng việc sử dụng steviosid - hoạt chất chính chiết từ cỏ ngọt có thể ảnh hưởng đến khả năng sinh sản trên chuột thí nghiệm Mới đây nhất, ủ y ban châu Âu về an toàn thực phẩm đã đưa ra két luận về sự an toàn của các glycosid chiết từ cỏ ngọt dựa trên rất nhiều dữ liệu và thí nghiệm đã được công nhận [15]

đơn giản và chủ yếu dùng cho xuất khẩu Đây là một loại cây có giá trị kinh tế cao và hiện việc trồng cỏ ngọt đã được mở rộng ra nhiều vùng trên cả nước Việc trồng cỏ ngọt ở Việt Nam có nhiều thuận lợi vì vốn đầu tư ban đầu không lớn, việc chăm sóc không quá khó khăn và cho năng suất cao Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt để thay thế đường đang được các nhà khoa học quan tâm Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu

chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt {Stevia rehaudỉana (Bert.) Hemsl.),

họ Cúc (Asteraceae)” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt

2 Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được

Chi Stevia Cav.

1.1.2 Đăc điểm thưc vât• • •

Tên khoa học; Stevia rebaudiana (Bert.) Hemsl.

Tên Việt Nam: cỏ ngọt, cỏ mật, cúc ngọt

Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6m, có khi đến Im Thân cứng mọc thẳng, có tiết diện tròn, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh Lá mọc đối, hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5-7 cm, rộng 1-1,5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm; cuống lá rất ngắn Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn thân Quả bế, không có mào lông, hạt không có nội nhũ [1], [12'

Mùa hoa: tháng 5-9

nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và một vài tiểu bang miền nam Hoa Kỳ, không có một đại diện nào ở vùng châu Á Tới đầu thập niên

70, Nhật Bản bắt đầu trồng và sử dụng cỏ ngọt Ngày nay thì cỏ ngọt được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á khác như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Indonesia, Đài Loan, Thái Lan, Malaysia c ỏ ngọt cũng được sử dụng nhiều ở các nước Nam Mỹ: ưrugoay, Peru, Hiện nay, cỏ ngọt đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng của Việt Nam: Cao Bằng, Lâm Đồng, Hà Giang, Hà Tây, Thái Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên, [12]

1.1.4 Sinh thái

Cỏ ngọt là cây ưa ẩm và ưa sáng, có thể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kỳ cây con v ố n là cây ở vùng nhiệt đới, cỏ ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng, phát triển tốt vào vụ xuân-hè v ề mùa đông, cây có hiện tượng rụng lá

và hơi bị tàn lụi Cây ra hoa quả nhiều hàng năm Tuy nhiên, người ta vẫn thường áp dụng cách nhân giống bằng cắm cành [1],[12]

1.2 VÈ HÓA HỌC

Lá cỏ ngọt chứa;

- Các ent - kauren diteqDen glycosid: steviosid (2,2-18,5%), rebaudiosid A, B,

c , D, E, F, dulcosid, steviobiosid Các thành phần này có vị ngọt ở các mức

độ khác nhau Nguyễn Kim cẩn và cộng sự đã chiết được stevioside trong lá

cỏ ngọt trồng ở Việt Nam với hàm lượng từ 1,66-4,78% tùy theo khu vực lấy mẫu [5],[12’

- Các labdan diterpen gồm jhanol, austroinulin, 6-0-acetylaustroinulin [12’

- Các triterpen gồm |3-amyrin acetat, lupeol [12’

Các glycosid này chiếm 10-20% khối lượng lá cỏ ngọt khô và có bộ khung cấu trúc được trình bày ở hình 1.

Hình 1 Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid

CHn

Steviol Ri = R2 = H

Cho đến nay đã có 9 steviol glycosid được phân lập từ lá cỏ ngọt được tổng kết ở bảng 1 [1],[12],[20]

đã được xác định rõ các đặc tính vật lý và cảm quan Steviosid và rebaudiosid

A đã được thử nghiệm độ ổn định trong các đồ uống có ga và cả hai chất được xác định là bền với nhiệt và pH [3 r

rebaudiosid c ngọt hon 40 đến 60 lần, dulcoside A ngọt hơn 30 lần [32]

Rebaudiosid A là chất có dư vị ít đắng nhất trong số bốn chất Dubois

và Stephanson đã xác nhận rebaudiosid A ít đắng hơn steviosid và giải thích nguyên nhân có dư vị đắng của steviosid và rebaudiosid A là do những đặc tính vốn có của hai hợp chất này chứ không phải do tạp chất trong quá trình chiết xuất Dư vị đắng có xu hướng tăng cùng với sự tăng nồng độ của cả Steviosid và Rebaudiosid A [32]

Steviosid (13-[(2-0-P-D-glucopyranosyl-a-D-glucopyranosyl) oxy]kaur-16- en-18-oic acid |3-D- glucopyranosyl ester) là hoạt chất chính chiết từ lá cây cỏ ngọt có cấu trúc hóa học được trình bày ở hình 2

Hình 2 Cấu trúc hóa học của steviosid

OH

Q HO'

HO OH

OH

OH

OH

CHo

1 g steviosid tan trong 800ml nước

Tan trong dioxan, hơi tan trong alcol [2],[12]

Hàm lượng steviosid trong cỏ ngọt là 3-20% tùy theo giống và các điều kiện trồng trọt, thu hoạch [12]

và chưa thấy có phản ứng độc hại nào [2’

Người bị bệnh tiểu đường và người béo phì có thể dùng chế phẩm của

cỏ ngọt để thay thế đường [2]

1.3.2 Tác dụng sinh học

1.3.2.1 Tác dung ha đường huyết và tàng tiết insulin

Nghiên cứu in vitro

Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng các steviol glycosid có khả năng kích thích các tế bào tiểu đảo tụy cô lập tiết Insulin, làm tăng số lượng các gen chủ chốt kiểm soát sự tiết insulin và có tác động đến sự giải phóng và truyền tín hiệu insulin [15]

♦♦♦ Nghiên cứu in vivo

1.3.2.2 Tác dung giãn mach và ha huyết áp

<♦ Nghiên cứu in vitro

Các nghiên cứu in vitro cho thấy steviosid ức chế sự co mạch gây ra bởi vasopressin với sự có mặt của calcium [15]

♦♦♦ Nghiên cứu in vivo

-Nghiên cứu trên chuột đực trưởng thành với liều 25mg steviosid/kg thể trọng/ngày (tương đương khoảng lOmg steviol/kg thể trọng/ngày) so với lô chứng sử dụng 16,7 mg glucose/kg thể trọng/ngày thông qua nước uống trong

6 tuần cho thấy tác dụng hạ huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trưong có ý nghĩa của steviosid so với nhóm chứng và không có dấu hiệu tăng đáng kể về trọng lượng cơ thể [15'

-Các nghiên cứu khác trên chuột cao huyết áp tự phát (SHR) và chó lai khỏe mạnh cũng cho thấy tác dụng ngăn chặn sự phát triển của bệnh cao huyết áp trên những con chuột còn nhỏ hay tác dụng hạ huyết áp trên chó của steviosid [15]

-Một vài nghiên cứu khác sử dụng đường tiêm tĩnh mạch và tiêm màng bụng cũng cho thấy khả năng hạ huyết áp của steviosid ở liều từ 25 đến 400 mg/kg thể trọng/ngày (tương đương với liều 10 đến 158 mg steviol/ kg thể trọng/ngày) [15]

♦♦♦ Các thử nghiệm lâm sàng

- Sau 3 tháng sử dụng steviosid (3 lần/ngày với liều 250mg) trên những người bị cao huyết áp từ nhẹ đến trung bình thấy cả huyết áp tâm thu và huyết

áp tâm trương đều giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng [15]

- Ket quả tương tự cũng thu được khi sử dụng steviosid trong vòng 2 năm (với liều 500mg, 3 lần/ngày) [15‘

1.3.2.3 Tác dung trên chức năng thân

♦♦♦ Nghiên cứu ỉn vitro

Một số nghiên cứu in vitro đã cho thấy cả steviol và steviosid đều có ảnh hưởng tới sự vận chuyển các anion ở ống thận [15]

♦♦♦ Nghiên cứu in vivo

- ở chuột cống trắng bình ứiưòng, steviosid làm tăng cả lưu lượng huyết

tưong qua thận (RPF) và tốc độ lọc cầu thận (GFR) Tác dụng tăng GFR là do thuốc làm giãn mạch vào và ra tiểu cầu thận [11]

-Tiêm tĩnh mạch steviosid cho chuột cống trắng cao huyết áp cũng làm tăng cả RPF và GFR Kết quả này cũng xảy ra ở chuột cống trắng bị cao huyết áp do gây mô hình thực nghiệm tổn thương thận [11]

-Trên chuột cống trắng bình thường và cả chuột gây cao huyết áp thực nghiệm, steviosid đều có tác dụng làm hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừnatri [11]

1.3.2.4 Liều dùng an toàn ở người

ủ y ban châu Âu về an toàn thực phẩm (EFSA) đã đưa ra liều dùng được chấp nhận hàng ngày (ADI) đối với các steviol glycosid, được thể hiện qua lượng steviol tương ứng là 5S8mg/kg thể trọng/ngày, tương đương với Pố7mg steviosid/kg thể trọng/ngày [15'

-Các nghiên cứu sử dụng steviosid (độ tinh khiết 95,6%) trong chế độ

ăn của chuột Fischer trong 90 ngày cũng đã đưa ra kết luận: 5% steviosid trong chế độ ăn tương đương 2500mg/kg thể trọng/ngày (tương ứng xấp xỉ 942mg steviol/kg thể trọng/ngày) là mức không quan sát thấy tác hại [15’

ĩ 3.2.7 Khả năng gây đôt biến

Các nghiên cứu cả in vivo và in vitro về khả năng gây đột biến của các steviol glycosid, của steviol và các chất chuyển hóa của steviol đã đưa ra kết luận:

Stevỉosỉd và rebaudiosid A không cho thấy các bằng chứng về khả năng gây đột biến ở cả in vitro và in vivo Stevioỉ và một vài dẫn chất oxi hóa của

nó cho thấy bằng chứng rô ràng về độc tính với vật liệu di truyền ở in vitro, đặc biệt khi có mặt hệ thống hoạt hóa sự chuyển hóa Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự nguy hại với ADN và nhân tế bào ở chuột cống, chuột bạch và

chuột đồng in vivo cho thấy khả năng gây đột biến của steviol không thể hiện

ở liều lên tới 8000 mg/kg thể trọng [15],

1.3.2.8 Đôc tính man và khả năng gây ung thư

Các kết quả nghiên cứu về khả năng gây ung thư của các steviol glycosid vào năm 1985, 1992, 1997 đều cho thấy các steviol glycosid không gây ung thư ở các mô hình thử nghiệm [15'

1.3.2.9 Ảnh hưởng đối với sư phát triển vả sinh sản

Nghiên cứu được thực hiện trên chuột Wistar bao gồm cả chuột đực và cái ở thế hệ Fo, Fi, p2 và những con chuột đang mang thai cho thấy không có tác dụng phụ nào đối với sự phát triển của cơ thể và cơ quan sinh sản cũng như chức năng sinh sản hay bất kỳ ảnh hưởng nào đến bào thai ở chế độ ăn có nồng độ steviosid lên tới 2100mg/kg thể trọng/ngày (tương đương 840 mg steviol/kg thể trọng/ngày) [15'

1.3.2.10 Khả năng gây di ứng của Steviol glycosid

-Đã có hai trưòng họp được báo cáo bị dị ứng có liên quan đến cỏ ngọt: trường hơp thứ nhất là một bé gái 7 tháng tuổi sau khi nhai lá cỏ ngọt và trường hợp thứ hai là một bé trai 2 tuổi sau khi uống nước ấm có pha bột steviosid Phản ứng với lá cỏ ngọt hoặc steviosid được xác nhận bằng test da (SPT) trong cả hai trường hợp Cả hai bệnh nhân này đều bị bệnh chàm dị ứng khó kiểm soát Sau khi kiêng các đồ ăn có steviosid, dấu hiệu chàm dị ứng cải thiện đáng kể và không có phản ứng dị ứng ác tính ở cả hai trường hợp Sau hai tháng kiêng những đồ ăn có steviosid và cỏ ngọt, test da với lá cỏ ngọt và steviosid được thử lại ở 2 trường họp trên đều cho kết quả âm tính [15’

-Theo những quan sát lâm sàng ở trên, một nghiên cứu về khả năng gây

dị ứng của lá cỏ ngọt và steviosid 10% được thực hiện bằng SPT trên 200 em

bé cả trai và gái ở độ tuổi từ 4 tháng đến 2 năm trước và sau khoảng thời gian

2 tháng không sử dụng các loại thực phẩm có steviosid số trẻ em chia thành

4 nhóm: 50 trẻ khỏe mạnh không có tiền sử dị ứng, 50 trẻ bị viêm mũi dị ứng,

50 trẻ bị hen phế quản và 50 trẻ bị chàm dị ứng Không em nào trong số trẻ

em khỏe mạnh có kết quả test da dưong tính; 26% số trẻ em bị viêm mũi dị

ứng, 34% số trẻ em bị hen phế quản và 64% số trẻ em bị chàm dị ứng có phản

ứng với lá cỏ ngọt và steviosid Khoảng thời gian 2 tháng không sử dụng các

thực phẩm có steviosid làm giảm số các phản ứng với lá cỏ ngọt hoặc

steviosid ở những trẻ bị viêm mũi dị ứng (4/50 với lá cỏ ngọt và 3/50 với

steviosid 10%), ở trẻ bị hen phế quản (3/50 với lá cỏ ngọt và 4/50 với

steviosid 10%), ở trẻ bị chàm dị ứng (7/50 với lá cỏ ngọt và 5/50 với steviosid

10%) Sự thay đổi của các triệu chứng viêm mũi, hen và chàm sau 2 tháng

không sử dụng thực phẩm có steviosid đã không được ghi nhận trong báo cáo

[15]

- Xem xét số lượng lớn các kết quả dương tính với test da trong nhóm trẻ em bị chàm, lá cỏ ngọt và steviosid có thể chứa một vài họp chất gây dị

ứng phổ biến trong thực vật (phản ứng chéo) của họ cúc, mặc dù không nhận

được báo cáo nào về tác dụng này Các chuyên gia cũng lưu ý rằng sự giảm

độ nhạy cảm sau khi loại bỏ các thực phẩm có chứa steviosid là một quan sát

thú vị nhưng không cung cấp được một bằng chứng mạnh mẽ cho sự tiến triển

qua trung gian IgE

Tóm lại, ủy ban châu Ấu về an toàn thực phẩm sau khi xem xét tất cả

các dữ liệu nghiên cứu về rebaudiosỉd A và steviosỉd đã đưa ra kết luận các

steviol glycosid đạt các yêu cầu kỹ thuật đề xuất thì không gây ung thư, không

gãy đột biển hoặc có bất kỳ tác dụng không mong muốn nào trên hệ phát triển

và sinh sản của cơ thể [15

1.4 MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY

Quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt được tóm tắt ở sơ đồ hình 3

1.4.2 Phương pháp 2: Phương pháp của Giovanetto 1988

Phương pháp này được coi là nền tảng cho rất nhiều nghiên cứu về sau trong việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp màu trong dịch chiết nước cỏ ngọt [27]

Quy trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ hình 4

1.4.3 Phương pháp 3: Phương pháp của Payzant 1999

Quy trình chiết xuất của Payzant có giai đoạn đầu giống với phương pháp của Giovanetto, tuy nhiên dịch nước thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi cation và anion được tiếp tục cho qua cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-7

và được rửa giải bằng dung dịch methanol Dịch methanol này có chứa trên 95% steviol glycosid của dung dịch thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi ion, sau đó được bay hơi dung môi và tách steviosid bằng phương pháp kết tinh trong methanol [26]

Hình 3 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt

của Bùi Thị Song Sơn[4]

Hình 4 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của

Giovanetto [27]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ

- Cân phân tích PRECISA

- Máy đo điểm chảy STUART

- Máy cất quay BUCHI

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE-500 MHz tại Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia.

Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích; MeOH, EtOH, Chloroform, n-Butanol, Ca(0 H)2, FeCla, Acid Citric monohydrat, nhựa Amberlite XAD-2, nhựa Amberlite XAD-7, nhựa Diaion HP-20, H2SO4 đặc

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u

- Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt theo hướng áp dụng vào sản xuất

- Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt

- Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n- buthanol và cột nhựa hấp phụ

- Khảo sát các thông số của quá trình chiết xuất: nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi

- Hiệu suất chiết xuất tính theo dược liệu khô theo công thức (*):

mA(%) = - X 100 Trong đó: A : Hàm lương phần trăm (%)

♦♦♦ Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập được

- Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được từ cỏ ngọt bằng sắc

ký lóp mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100°c.

- Sử dụng các dữ liệu về điểm chảy, phổ MS và phổ NMR để xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được

♦> Kiểm tra độ tinh khỉết của chất chiết được bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

Chương 3 THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5

Cân khối lượng tinh thể CNl và tính hiệu suất chiết theo công thức (*)

ở mục 2.3

Tiến hành:

Cân chính xác khoảng 40g dược liệu, chiết bằng nước ở 65°c (2 lần X

600 ml), mỗi lần 4h Gộp các dịch chiết nước đem cô bớt dung môi ở 80°c

còn 150 ml, sau đó thêm Ca(OH)2 đến khi dịch chiết có pH = 9 và khuấy trong 30 phút ở 45°c Hỗn dịch thu được đem lọc hút bằng phễu lọc Buchner

đế loại bỏ kết tủa, hòa tan acid citric vào dịch lọc đến khi dung dịch có pH = 7

Dung dịch này đem chiết 2 lần với n-butanol bão hòa nước tỷ lệ thể tích 1:1, gộp các dịch chiết n-butanol, làm khan bằng Na2SƠ4 rồi đem cất quay thu hồi dung môi ở 80°c đến khối lượng không đổi được cắn n-butanol

Cắn n-butanol được đun hồi lưu với MeOH (tỉ lệ khối lượng cắn/thể tích MeOH, w/v = 1/40), để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh trong 24h ở

nhiệt độ 0-5°C Lọc lấy tinh thể bằng phễu lọc Buchner, rửa tinh thể bằng Iml MeOH lạnh và đem sấy chân không Cân khối lượng tinh thể thu được.

Kết quả:

Hiệu suất chiết glycosid tính theo khối lưọfng dược liệu khô được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Hiệu suất chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng

n-butanol bão hòa nước.

Mầu

Khối lượng dươc liêu (g)

Khối lượng cắn butanol(g)

Khối lượng tinh

thể (g)

Hiệu suất chiết (%)

3.1.3 Khảo sát khả năng tách glycosid của một số cột nhựa hấp phụ

Nguyên tắc:

Chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 Giai đoạn (4) tiến hành với cột được nhồi một trong ba loại nhựa Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-7, Diaion Hp-20 Giai đoạn (5) rửa giải cột đã hấp phụ bằng

hệ dung môi thích họp, kiểm tra các phân đoạn dịch rửa giải bằng SKLM với

hệ dung môi là CHCI3 : MeOH : H2O (15:8:1) hiện vết bằng dung dịch H2SO4

10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100°c

Gộp dịch rửa giải và cất loại dung môi thu được cắn cắn này đem kết tinh trong MeOH thu được tinh thể màu trắng hình kim Cân khối lượng tinh thể và tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3

Tiến hành:

- Chuẩn bị mẫu:

Cân chính xác khoảng 15g dược liệu, chiết bằng nước ở 65°c (525ml X 4h) Dịch chiết thu được thêm Ca(OH)2 đến pH=9 và khuấy trong 30 phút ở 45°c Hỗn dịch thu được đem lọc hút bằng phễu lọc Buchner để loại bỏ kết tủa, hòa tan acid citric vào dịch lọc và đến khi thu được dung dịch có pH = 7

- Chuẩn bị cột nhựa hấp phụ:

Tiến hành các thao tác chuẩn bị sau đây với mỗi loại nhựa

Cân khoảng 35g nhựa, rửa sạch bằng nước cất để loại bỏ chất bảo quản, ngâm trong MeOH/24h, rửa lại bằng nước cất và vớt bỏ những hạt nhựa bị nổi, nhồi vào cột thủy tinh có kích thước 2cm X 50cm Rửa cột bằng 300ml nước cất để ổn định cột và loại bỏ hoàn toàn MeOH

- Đưa dịch chiết nước cỏ ngọt đã xử lý lên cột nhựa đã chuẩn bị với tốc độ 3ml/phút

- Rửa giải cột:

Rửa giải cột bằng các hệ dung môi giảm dần độ phân cực Me0 H-H20

(v/v) là 0/100, 25/75, 50/50, 75/25, 85/15 và 100/0 (200ml mỗi hệ dung môi) với tốc độ rửa giải 3ml/phút Kiểm tra các dịch rửa giải bằng SKLM và so sánh với Rf của CNl trong hệ dung môi khai triển CHCI3 : MeOH : H2O (15:8:1)

Gộp dịch rửa giải và cất loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được cắn

Đun hồi lưu cách thủy cắn trong 10 phút với MeOH (tỷ lệ khối lượng cắn/thể tích MeOH = 1/40) rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh trong 24h ở nhiệt độ 0-5°C Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa nhanh tinh thể bằng Iml MeOH lạnh và đem sấy chân không Cân khối lượng tinh thể thu được và tính hiệu suất chiết glycosid

Kết quả hiệu suất chiết glycosid với 3 loại cột nhựa hấp phụ được trình bày ở bảng 3

Bảng 3 Khảo sát hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt của một số cột

nhựa hấp phụ

STT Loại nhựa Hiệu suât (%)

1 Amberlite XAD-2 Không tách được glycosid

Nhăn xét:

Từ bảng 3 cho thấy được sự chênh lệch giữa hiệu suất tách glycosid của

ba loại nhựa là khá lớn Khi sử dụng nhựa XAD-2 thì không thể tách được glycosid ra khỏi dược liệu Quá trình tách glycosid bằng 2 loại nhựa khác là

XAD-7 và Diaion HP-20 thu được kết quả tốt Hiệu suất tách glycosid thu được khi sử dụng nhựa XAD-7 (2,17%) khá cao so với phương pháp chiết bằng n-butanol (1,26%) Khảo sát với nhựa Diaion HP-20 thu được kết quả cao hơn (2,31%) so với nhựa XAD-7 (2,17%) Hơn nữa, bằng cảm quan cho thấy khi sử dụng nhựa Diaion HP-20 thì loại được nhiều tạp màu hofîi.

Vì vậy, trong các quy trình khảo sát tiếp theo chúng tôi tiến hành với cột nhựa Diaion HP-20

3.1.4 Khảo sát hệ dung môi rửa giải cột Diaion HP-20

Tiến hành:

Chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 ở giai đoạn (4)

sử dụng cột Diaion HP-20 ở giai đoạn (5) rửa giải cột nhựa với hai hệ dung môi khác nhau là EtOH-HiO hoặc Me0 H-H20 với độ phân cực giảm dần theo tỉ lệ ROH/H2O (v/v) là 0/100, 25/75, 50/50, 75/25, 85/15 và 100/0 Tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3 Kết quả được trình bày ở bảng 4

Bảng 4 : Sự ảnh hưởng của dung môi rửa giải cột đến

hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt

STT Hệ dung môi Hiệu suất (%)

Nhân xét:#

Nhận thấy hiệu suất chiết glycosid khi sử dụng 2 hệ dung môi MeOH-

H2O và Et0 H-H20 là như nhau với cùng một loại nhựa Diaion HP-20 Tuy nhiên, khi sử dụng dung môi Me0 H-H20 thì MeOH độc hơn rất nhiều, khó được sử dụng ở quy mô lớn Hơn nữa MeOH có giá thành cao Do vậy, chúng

tôi lựa chọn dung môi Et0 H-ỈỈ20 vừa giảm chi phí và thân thiện với môi trường, dễ thực hiện ở quy mô lớn.

Do đó, trong các bước khảo sát tiếp theo chúng tôi sẽ sử dụng hệ dung môi là Et0H-H20 cho quá trình rửa giải cột

3.1.5 Khảo sát nhiệt độ của quá trình chiết suất

Tiến hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 ở giai đoạn (1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt ở nhiệt độ khác nhau (55°c,

65°c, 75°) với khối lượng dược liệu 15g, dung môi chiết là H2O, tỉ lệ dược liệu/ dung môi (w/v) = 1/35, thời gian chiết là 4h ở giai đoạn (4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn (5) rửa giải cột với hệ dung môi Et0H-H20

(v/v) 75/25 Tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3 Kết quả được trình bày ở bảng 5

Bảng 5 Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào nhiệt độ

STT Nhiệt độ chiết Khối lưọng dược

liệu (g)

Khối lượng tinh thể (g)

Hiệu suất chiết (%)

chiết thì độ tan của glycosid tăng, tuy nhiên nếu nhiệt độ tăng cao > 75°c thì

có thể ảnh hưởng đến lượng tạp trong dịch chiết nước dẫn đến việc tách glycosid trên cột khó khăn hơn Do đó, nhiệt độ được lựa chọn để chiết xuất

là 65°c

3.1.6 Khảo sát thời gian chiết suất

Tiến hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5 ở giai đoạn (1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt trong khoảng thời gian khác nhau (3h, 4h, 5h) với khối lưọng dược liệu 15g, dung môi chiết là H2O, tỉ lệ dược liệu/ dung môi = l/35(w/v), nhiệt độ chiết là 65°c ở giai đoạn (4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn (5) rửa giải cột với hệ dung môi EtOH-

H2O (v/v) 75/25.Tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3 Kết quả được trình bày ở bảng 6

Bảng 6 Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian

chiết dươc liêu.• •