nhựa hấp phụ Diaion HP-20
Từ kết quả khảo sát các yếu tố của quá trình chiết xuất được trình bày ở các mục 3.1.2 đến 3.1.9, chúng tôi xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt với các điều kiện sau:
Giai đoạn (1): chiết cỏ ngọt bằng nước nóng , nhiệt độ chiết 65°c, thời gian chiết 4h/mẻ, chiết 1 lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu (w/v) = 1/35.
Giai đoạn (2): Loại tạp chất bằng Ca(OH)2
Giai đoạn (4): Tách glycosid bằng cột Diaion HP-20
Giai đoạn (5): Rửa giải bằng hệ dung môi EtOH-H2Ơ (v/v) 75/25 Giai đoạn (7); cắn được kết tinh 2 lần trong MeOH
Quy trình chiết xuất glycoside từ cỏ ngọt được được mô tả chi tiết như sau: Cân chính xác khoảng 15g dược liệu, chiết bằng nước nóng ở 65°c
trong 4h, tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) = 1/35. Dịch chiết thu được thêm Ca(0 H)2 đến pH=9 và khuấy trong 30 phút ở 45°c. Hỗn dịch thu được đem lọc hút bằng phễu lọc Buchner để loại bỏ kết tủa, hòa tan acid citric vào dịch lọc đến khi thu được dịch chiết nước có pH = 7.
Hấp phụ dịch chiết nước cỏ ngọt đã loại tạp lên cột nhựa Diaion HP-20
với tốc độ 3ml/phút.
Rửa giải cột bằng 200ml hệ dung môi EtOH-HiO (v/v) 75/25.
Gộp toàn bộ dịch rửa giải và cất loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được cắn. Đun hồi lưu cách thủy cắn trong 10 phút với MeOH (tỷ lệ khối lượng cắn/thể tích MeOH = 1/40) rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh trong 24h ở nhiệt độ 0-5°C. Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa nhanh tinh thể bằng Iml MeOH lạnh và đem sấy chân không.
Glycosid thô được đun hồi lưu trong 10 phút với MeOH, (tỷ lệ khối lượng glycoside thô/thể tích MeOH = 1/50),thêm 5% than hoạt, lọc nóng, rửa than bằng Iml MeOH. Dung dịch thu được đem cất loại dung môi, cắn thu được đem kết tinh bằng MeOH. Cân khối lượng tinh thể thu được.
Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt được trình bày ở
3.1.11. Xác định cấu trúc của chất phân lập (Chất CNl)
Tiến hành chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở mục 3.1.10 thu được tinh thể chất CN1.
Tính chất:
CN1 là tinh thể màu trắng, kết tinh trong MeOH, trên SKLM không có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, hiện màu nâu đen sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH và sấy 2 phút ở 100°c.
Nhiệt độ nóng chảy: CNl có nhiệt độ nóng chảy là 196-202°c.
Phổ khối EI-MS [phụ lục 3]
Họp chất CNl có công thức phân tử là CsgHôoOis ứng với pic ion ^■"=805,40.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [phụ lục 1 và 2]
Phổ 'H-NMR chỉ ra sự có mặt của 2 nhóm methyl singlet ở ỗ 0,86 (H20) và 1,13 (His). Hai proton olefmic của một exocyclic đôi ở ô 4,71 và 5,02; 9 nhóm methylen và 2 nhóm methin nằm trong khoảng ỗ 0,77-2,15 đặc trưng cho loại họp chất ent-kauran diterpenoid đã được phân lập từ chi Stevia. Trên phổ ESI-MS của CNl chỉ ra các mảnh ion ở 805,40; 643,40; 481,40 chứng tỏ sự có mặt của 3 nhân hexose. Sự phân mảnh từ m/z 805,40 xuống 659,40 chứng tỏ sự có mặt của cấu trúc deoxyhexose trong phân tử. Sự có mặt của 3 phân tử đường glucose trong CNl được thể hiện trên phổ ’H-NMR với sự có mặt của proton anome ở ô 5,25 ppm (d, J = 8,00Hz); 4,45 ppm (d, J = 7,50 Hz); 4,35 ppm (d, J = 8,00 Hz). Hằng số tương tác J của nó cho thấy chúng ở vị trí Ị3 như các tài liệu đã công bố [19],[33].
Phổ ’^C-NMR chỉ ra sự có mặt của 38C, trong đó có 20 c của khung ent-kauran (steviol) và 18 c của 3 vòng đưòmg. Sự có mặt của c trong steviol
thể hiện ở nhóm cacbonyl trong este ở ỗ 175,58 ppm (C19); >c= bậc 4 ở 153,51 ppm (C,6). 5 Carbon bậc 4 khác là ỗ 46,78 (C4); 56,44 ( C 5 ) ; 84,61 (Cịs); 43,19 (Cg); 40,00 (Cio). Ngoài ra còn có 2 nhóm -CH3; 10 nhóm -C H2
với nhóm =CH2 ở 104,51 ppm ( C 17 ) ; 1 nhóm -C H ở 53,11 ppm. 3 Carbon anome nằm ở: 94,10 ppm (Cr); 96,33 ppm (C2O; 104,55 ppm (C 3O .
Dữ liệu phổ NMR của chất CN1 được trình bày ở phụ lục 1 và phụ lục
2 và được ở bảng 10. Bảng 10: Dữ liệu phổ *H-NMR và ^^C-NMR của chất CNl Vị trí ’H-NMR (ppm) ‘^C-NMR (ppm) 1 0,77 (m, IH); 1,77 (m, IH) 40,95 2 1,39 (m,lH); 1,99 (m, IH) 18,64 3 1,05 (m, 2H) 38,80 4 46,78 5 1,03 (m, IH) 56,44 6 1,77 (m, IH) 19,99 7 1,36 (m, IH) 41,99 8 43,10 9 0,91 (m, IH) 53,11 10 40,00 11 1,70 (m, 2H) 21,16 12 1,47 (m, 2H) 37,30 13 84,61 14 1,53 (m, IH); 2,15 (d; J = 11,50; IH) 46,87
15 2 ,0 6 (d ;J = 13,50; IH) 46,874 16 153,51 17 4,71 (S,1H);5,00 (s, IH) 104,51 18 1,13 (s, 3H) 28,03 19 175,58 20 0,86 (s,3H) 15,10 1’ 5,25 (d; J = 8,00; IH) 94,10 2’ 3,50 (m, IH) 82,57 3’ 3,48 (m,lH) 76,61 4’ 3,37 (m, IH) 70,31 5’ 3,35 (m, IH) 76,91 6’ 3,63 (m, IH); 3,83 (m, IH) 61,00 1” 4,45 (d; J = 7,50; IH) 96,33 2” 3,61 (m, IH) 77,01 3” 3,72 (m, IH) 84,61 4” 3,37 (m, IH) 70,31 5” 3,30 (m,lH) 76,91 6” 3,63 (m, IH) 60,50 6” 3,82 (m, IH) 60,70 1’” 4,35 (d; J = 8,00; IH) 104,55 2” ’ 3,16(d; J = 8,00; IH) 75,25 3’” 3,60 (m, IH) 76,90
4’” 3,15 (m, IH) 72,50
5’” 3,44 (m, IH) 77,61
6’” 3,82 (m, IH) 61,00
Kết luận:
Dựa vào nhiệt độ nóng chảy và dữ liệu phổ MS, NMR, so sánh với dữ liệu đã được công bố trong các tài liệu tham khảo ([13], [16], [17], [19], [33]), chúng tôi đã xác định hợp chất CNl là steviosid có cấu trúc hóa học được trình bày ở hình 8.
Hình 8. Cấu trúc hóa học của CNl: steviosid
OH
3.1.12. Định lượng steviosid chiết được từ cỏ ngọt bằng phương phápHPLC HPLC
Tiến hành chiết xuất Steviosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở mục 3.1.1.10 thu được Steviosid. Định lượng Steviosid chiết được bằng phương pháp HPLC cho thấy steviosid kết tinh lại 2 lần có độ tinh khiết 89% [phụ lục 41.
3.2. BÀN LUẬN
Tổng quan tài liệu cho thấy cỏ ngọt là một loại cây được trồng phổ biến tại nhiều nước trên thế giới với ứng dụng chính là sử dụng làm chất điều vị thay thế đường saccharose trong các loại thực phẩm. Tuy nhiên, trước đây việc sử dụng cỏ ngọt đã gây nhiều tranh cãi vì có ý kiến cho rằng cỏ ngọt có thể gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản trên chuột thí nghiệm. Dựa trên các kết quả nghiên cứu bằng thực nghiệm, mới đây, vào năm 2010, ủ y ban châu Âu về an toàn thực phẩm đã kết luận các steviol glycosid - thành phần chính của cỏ ngọt nếu đạt các yêu cầu kỹ thuật thì không gây ung thư, không gây đột biến, không có bất kỳ tác dụng không mong muốn nào trên hệ phát triển và sinh sản của cơ thể [15]. Điều này có nghĩa là chúng ta có thể yên tâm sử dụng Cỏ ngọt và các chất chiết xuất từ cỏ ngọt trong đời sống.
Tham khảo tài liệu, chúng tôi đã tổng kết được ba phưong pháp chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt là phương pháp của (Bùi Thị Song Sơn), 1996 [4], phương pháp của Giovanetto 1988 [27] và phương pháp của Payzant
1999[26].
Phương pháp của Bùi Thị Song Sơn 1996 [4] có ưu điểm là dễ thực hiện, ít tốn kém với các hóa chất và thiết bị sẵn có trong phòng thí nghiệm. Nhưng nhược điểm của phưoTTig pháp này là sử dụng methanol là dung môi độc hại, giá thành cao, không phù họp với chiết ở quy mô công nghiệp. Hiệu suất chiết theo phương pháp này tương đối thấp.
Phưong pháp của Giovanetto 1988 [27] sử dụng dung môi rẻ tiền, không độc hại là nước và phưoTig pháp này cũng được coi là nền tảng cho việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp trong dịch chiết nước cỏ ngọt. Hiệu suất chiết xuất steviosid cao (8%). Tuy nhiên, steviosid chiết được có độ tinh khiết thấp (75%).
Phương pháp của Payzant 1999 [26] dựa trên cơ sở phương pháp của Giovanetto 1988 nhưng cải tiến bằng cách dịch rửa giải sau khi qua cột trao đổi ion được tiếp tục cho qua cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-7, rửa giải bằng methanol. Tiến hành theo phương pháp này, glycosid chiết được có độ tinh khiết cao hơn so với phưofng pháp của Giovanetto 1988 [27;.
Từ sự phân tích ở trên, chúng tôi đã dự kiến các giai đoạn chính của quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt ở mục 3.1.1 để phát huy những ưu điểm và khắc phục những nhược điểm của phương pháp chiết xuất trước đây. Từ quy trình dự kiến đó, chúng tôi tiến hành khảo sát một số thông số trong quá trình chiết xuất như nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, loại nhựa hấp phụ, hệ dung môi rửa giải cột nhựa, số lần kết tinh lại.. .Kết quả chúng tôi đã lựa chọn được những thông số phù họp và xây dựng được quy trình chiết xuất Steviosid từ cỏ ngọt đã được trình bày ở mục 3.1.10. Đây chính là đóng góp mới của đề tài.
Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy sử dụng dung môi chiết xuất là methanol hoặc methanol - nước cho hiệu suất chiết cao hơn so với chiết bằng nước. Tuy nhiên, methanol là dung môi độc hại, giá thành cao nên để áp dụng vào sản xuất chúng tôi sử dụng dung môi chiết rẻ tiền, không độc hại là nước nóng.
Theo một số nghiên cứu, trong lá cỏ ngọt có carbohydrat (61,93%), protein (11,41%), cellulose (15,52%) tính theo khối lưọng lá khô; ngoài ra còn có các chất khoáng K, Ca, Na, Mg, Cu, Mn, Fe, Zn và một số amino acid [13]. Dịch chiết nước cỏ ngọt có tạp chất protein, gôm, pectin, chất khoáng, chất màu,... Bằng cảm quan cho thấy việc sử dụng Ca(0H)2 đã loại được một lượng tạp đáng kể. Dịch chiết nước trước khi xử lý bằng Ca(0 H)2 có màu nâu đen, sau khi xử lý còn màu vàng cam, sau khi trung tính hóa bằng acid citric thì có màu vàng cam nhạt và trong suốt nhưng trong dung dịch thu được vẫn
còn chất màu và các ion vô cơ có thể là nguyên nhân không kết tinh được glycosid. Do vậy, sử dụng nhựa hấp phụ và nhựa trao đổi ion là cần thiết để loại hoàn toàn các tạp này ra khỏi dịch chiết nước.
Do chưa có điều kiện dùng cột trao đổi ion nên trong quy trình chúng tôi mới chỉ sử dụng cột nhựa hấp phụ để loại tạp chất. Cột nhựa hấp phụ tuy có giá thành cao hơn nhưng lại có khả năng tái sử dụng nhiều lần. Dung môi để rửa giải cột là ethanol - nước cũng là một dung môi ít độc, rẻ tiền.
Quy trình chiết xuất mà chúng tôi xây dựng có ưu điểm là sử dụng các dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại, thân thiện với môi trường nên dễ áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp. Các bước tiến hành đơn giản, dễ thực hiện. Độ tinh khiết của steviosid chiết được là 89%, cao hơn so với phương pháp của Giovanetto nhưng vẫn cần khảo sát phương pháp tinh chế để thu
được stevÌGSid có độ tinh khiết trên 90% thì mới có thể thương mại hóa được.
Giai đoạn tinh chế steviosid vẫn phải sử dụng methanol là dung môi độc hại nên cần nghiên cứu thay thế methanol bằng dung môi ít độc hơn.
CHƯƠNG 4. KỂT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 4.1. Kết luận
Sau thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi thu được một số kết quả như sau:
- Đã khảo sát lựa chọn các yếu tố của quá trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt : phưoTig pháp chiết glycosid, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, tỷ lệ dược liệu /dung môi, số lần chiết xuất, số lần kết tinh lại.
- Đã xây dựng được quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cột nhựa hấp phụ Diaion HP-20.
- Theo quy trình đã xây dựng, từ 15g cỏ ngọt đã chiết và phân lập được một chất ký hiệu là CN1.
- Căn cứ dữ liệu phổ MS và NMR đã xác định CN1 là Steviosid.
- Đánh giá độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC cho thấy steviosid chiết được có độ tinh khiết 89%.
4.2. Đe xuất
- Khảo sát nguồn dược liệu có hàm lượng glycosid cao.
- Nghiên cứu quy trình sử dụng cột nhựa trao đổi ion để nâng cao hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt.
liệu, tập I, tr.212-214.
[2]. Bộ môn thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Thực vật học.
’3]. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Hà Nội, tr.720-721.
4]. Nguyễn Kim cẩn, Nguyễn Hoàng Anh, Lê Nguyệt Nga (2001), '"Phân lập stevỉosid và hàm lượng steviosid từ lả cỏ ngọt trồng ở Việt N a n ỉ\ Công trình nghiên cứu khoa học 1987-2000, Viện dược liệu, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 120-124.
[5]. Nguyễn Kim cẩn, Lê Nguyệt Nga (1998), “Định lượng steviosid trong lá cỏ ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni)”, Tạp chí dược liệu, 3(3), tr.91-92.
[6]. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr.279
7]. Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Thị Minh (1993) “Xác định và chiết tách chất ngọt từ cây cúc ngọt STEVIA REBAƯDIANA BERTONI của Việt Nam”, Tạp chí hóa học, 31(1), tr.39-40.
8]. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Nxb trẻ, tr. 1370-1373.
[9]. Hoàng Văn Phiệt, Hoàng Thanh Hương, Trương Tất Hiếu, Nguyễn Kim Sơn, Đào Đình Kim {1995), Chiết xuât steviosid từ lả cỏ ngọt (Stevỉa rebaudiana bertonỉ), Viện hóa học các họp chất thiên nhiên - Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia.
[10]. Đỗ Thị Phương (2005), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của chiêt phẩm stevỉosỉd từ lả cỏ ngọt trồng ở Việt Nam trên động vật thực nghiệm,
Luận văn thạc sỹ dược học, Trường đại học Dược Hà Nội.
II]. Bùi Thị Song Sơn (1996), Nghiên cứu chiết xuất steviosid tỉnh khiết từ lá cỏ ngọt stevia rebaudỉana (Bert.) Hemsl, Asteraceae, Khóa luận tốt nghiệp' dược sỹ, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường đại học Dược Hà Nội.
12]. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuổc ở Việt Nam, tập 1, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 495-498.
produced from Stevia rebaudiana bertoni plant”, African Journal o f Food Science, vol.4(5), pp. 269-281.
14]. Catani, Steven J. (2009), Stevia-containing tabletop sweeteners and method o f producing same, World Intellectual Property Organization 006208 A2.
15]. European Food Safety Authority (2010), Scientific Opinion on the safety o f steviol glycosides fo r the proposed uses as a fo o d additive, Italy.
[16]. Hitoshi Shibata, Satoru Sonoke, Hideo Ochiai, Hideji Nishihashi, Masaharu Yamada (1990), “Glucosylation of Seviol and Steviol-Glucosides in Extracts from Stevia rebaudiana Bertoni”, Plant Physiol, 1991(95), pp. 152-
156.
[17]. Jan M.C.Geuns, Johan Buyse, Annelies Vankeirsbilck, Elisabeth H.M.Temme, Frans Compemolle, Suzanne Toppet (2006), “Identification of Steviol Glucoronide in Human Urine”, Journal o f Agricultural and food chemistry, 54, pp.2794-2798.
[18]. Jeffrey C.Evans, John J.Hahn, Alan S.Myerson, Timothy Oolman, Troy A.Rhonemus, Kren M.Storo, Christopher A.Tyler (2010), Method o f producing purified rebaudioside A compositions using solvent/antisolvent
crystallization. United States Patent Application Publication 0099857 A l.
[19]. John F. Clos, Grant E.DuBois, and Indra Prakash (2008), “Photostability of Rebaudioside A and Stevioside in Beverages”, Journal o f Agricultural and fo o d chemistry, 56, pp.8507-8513.
[20]. Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (2004), Steviol Glycosides - Chemical and Technical Assessment.
21]. Kitazume, Masato Chiba-shi, Chiba-ken (2003), Sweentener and process fo r producing the same, European Patent 1295533 A l.
A l.
[23]. Malsagov Magomet, Tugan Tomov, Timur Somann, Varuzhan H.Abelyan (2007), Process fo r manufacturing a sweetener and use thereof
United States Patent Application Publication 0082103 A l.
24]. Mel Clinton Jackson, Gordon James Francis, Rober Gordon Chase (2006), High yield method o f producing pure rebaudioside A ”, United States Pantent Application Public 0083838 A l.
25]. Mingfu Yang, Jun Hua, Ling Qin (2008), High-purity rebaudiosid A and method o f extracting same, United States Patent Application Publication 0300402.
[26]. Payzant; John Donald; James Kenneth; Robert Maurice (1999), Method o f extracting selected sweet glycosides from the Stevia rebaudiana plant,
United States Patent 5962678.
[27]. Roger H.Giovanetto (1990), Method fo r the recovery o f stevioside from plant raw material, U.S Patent Number 4892938.
[28]. S.K. Goyal, Samsher, R.K. Goyal (2010), “Stevia (Stevia rebaudiana) a bio-sweetener: a review”, International Journal o f Food and Nutrition”,
61(1), pp.1-10.
[29]. Sampath Kumar, Lincrofl, N.J (1986), Method fo r recovery o f stevioside, United States Patent 4599403.
[30]. Siddhartha Purkayastha, Aventik Markosyan, Magomet Malsagov (2010), Process fo r manufacturing a sweetener and use thereof United States Patent Application Publication 0255171 A 1.
31]. Varuzhan H.Abely, Vahe T.Ghochikyan, Aventik A.Markosyan, Mariam O.Adamyan, Lidia A.Abelyan (2010), Extraction, separation and modification o f sweet glycosides from the STEVIA REBAUDIANA plant,
United States Patent 0134292.
33]. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash (2011), “A new diterpene Glycoside from Stevia rebaudiana”. Molecules 2011, 16, pp.2937- 2943.
[34]. W. M. Hafizuddin, W. Yussof, Mohamad Roji Sarmidi (2003),
Equilibrium and Kinetic Modeling o f the Adsorption o f Stevioside on
Amberlite XAD-7 Beads, Proceedings of International Conference On
Chemical and Bioprocess Engineering, University Malaysia Sabah, Kota Kinabalu.
Phụ lục 3: Kết quả phổ khối (EI-MS) của chất CNl.
00 - a\ - 1. 000\ 1 . 1 3 5 ' 1.345^ 1.489^ 1.442^ 2 . 626| 2 .57 0l 2 .557\ 3 .320\ 2 .563' 1 . 8 3 5 ^ 2 . 8 3 8 '^ 5 . 8 6 7 cn - It>. - w -