cỏ ngọt
Để xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt, chúng tôi dự kiến quy trình sẽ gồm các giai đoạn chính được trình bày ở sơ đồ hinh 5.
3.1.2. Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n- butanol bão hòa nước
Nguyên tắc:
Chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5.
Cân khối lượng tinh thể CNl và tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3.
Tiến hành:
Cân chính xác khoảng 40g dược liệu, chiết bằng nước ở 65°c (2 lần X 600 ml), mỗi lần 4h. Gộp các dịch chiết nước đem cô bớt dung môi ở 80°c
còn 150 ml, sau đó thêm Ca(OH)2 đến khi dịch chiết có pH = 9 và khuấy trong 30 phút ở 45°c. Hỗn dịch thu được đem lọc hút bằng phễu lọc Buchner đế loại bỏ kết tủa, hòa tan acid citric vào dịch lọc đến khi dung dịch có pH = 7.
Dung dịch này đem chiết 2 lần với n-butanol bão hòa nước tỷ lệ thể tích 1:1, gộp các dịch chiết n-butanol, làm khan bằng Na2SƠ4 rồi đem cất quay thu hồi dung môi ở 80°c đến khối lượng không đổi được cắn n-butanol.
Cắn n-butanol được đun hồi lưu với MeOH (tỉ lệ khối lượng cắn/thể tích MeOH, w/v = 1/40), để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh trong 24h ở
nhiệt độ 0-5°C. Lọc lấy tinh thể bằng phễu lọc Buchner, rửa tinh thể bằng Iml MeOH lạnh và đem sấy chân không. Cân khối lượng tinh thể thu được.
Kết quả:
Hiệu suất chiết glycosid tính theo khối lưọfng dược liệu khô được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Hiệu suất chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n- butanol bão hòa nước.
Mầu Khối lượng dươc liêu (g) Khối lượng cắn butanol (g)
Khối lượng tinh thể (g) Hiệu suất chiết (%) 1 40,05 4,01 0,44 1,25 2 40,27 4,07 0,45 1,27 3 40,13 4,02 0,44 1,25 TB 40,15 4,03 0,44 1,26 Nhận xét:
Nhìn vào bảng trên nhận thấy phương pháp chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-butanol cho hiệu suất thấp, hơn nữa sử dụng dung môi n- butanol rất độc hại, giá thành cao do đó việc chiết với n-butanol không thể tiến hành ở qui mô lớn. Vì vậy, trong các quy trình chiết xuất về sau chúng tôi không tiến hành giai đoạn chiết glycosid bằng n-butanol.
3.1.3. Khảo sát khả năng tách glycosid của một số cột nhựa hấp phụ
Nguyên tắc:
Chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5. Giai đoạn (4) tiến hành với cột được nhồi một trong ba loại nhựa Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-7, Diaion Hp-20. Giai đoạn (5) rửa giải cột đã hấp phụ bằng hệ dung môi thích họp, kiểm tra các phân đoạn dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi là CHCI3: MeOH : H2O (15:8:1) hiện vết bằng dung dịch H2SO4
10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100°c.
Gộp dịch rửa giải và cất loại dung môi thu được cắn. cắn này đem kết tinh trong MeOH thu được tinh thể màu trắng hình kim. Cân khối lượng tinh thể và tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3.
Tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu:
Cân chính xác khoảng 15g dược liệu, chiết bằng nước ở 65°c (525ml X 4h). Dịch chiết thu được thêm Ca(OH)2 đến pH=9 và khuấy trong 30 phút ở 45°c. Hỗn dịch thu được đem lọc hút bằng phễu lọc Buchner để loại bỏ kết tủa, hòa tan acid citric vào dịch lọc và đến khi thu được dung dịch có pH = 7.
- Chuẩn bị cột nhựa hấp phụ:
Tiến hành các thao tác chuẩn bị sau đây với mỗi loại nhựa.
Cân khoảng 35g nhựa, rửa sạch bằng nước cất để loại bỏ chất bảo quản, ngâm trong MeOH/24h, rửa lại bằng nước cất và vớt bỏ những hạt nhựa bị nổi, nhồi vào cột thủy tinh có kích thước 2cm X 50cm. Rửa cột bằng 300ml nước cất để ổn định cột và loại bỏ hoàn toàn MeOH.
- Đưa dịch chiết nước cỏ ngọt đã xử lý lên cột nhựa đã chuẩn bị với tốc độ 3ml/phút.
- Rửa giải cột:
Rửa giải cột bằng các hệ dung môi giảm dần độ phân cực Me0 H-H20
(v/v) là 0/100, 25/75, 50/50, 75/25, 85/15 và 100/0 (200ml mỗi hệ dung môi) với tốc độ rửa giải 3ml/phút. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng SKLM và so sánh với Rf của CNl trong hệ dung môi khai triển CHCI3 : MeOH : H2O (15:8:1)
Gộp dịch rửa giải và cất loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được cắn.
Đun hồi lưu cách thủy cắn trong 10 phút với MeOH (tỷ lệ khối lượng cắn/thể tích MeOH = 1/40) rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh trong 24h ở nhiệt độ 0-5°C. Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa nhanh tinh thể bằng Iml MeOH lạnh và đem sấy chân không. Cân khối lượng tinh thể thu được và tính hiệu suất chiết glycosid.
Kết quả hiệu suất chiết glycosid với 3 loại cột nhựa hấp phụ được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Khảo sát hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt của một số cột nhựa hấp phụ
STT Loại nhựa Hiệu suât (%)
1 Amberlite XAD-2 Không tách được glycosid
2 Amberlite XAD-7 2,17
3 Diaion HP-20 2,31
Nhăn xét:
Từ bảng 3 cho thấy được sự chênh lệch giữa hiệu suất tách glycosid của ba loại nhựa là khá lớn. Khi sử dụng nhựa XAD-2 thì không thể tách được glycosid ra khỏi dược liệu. Quá trình tách glycosid bằng 2 loại nhựa khác là
XAD-7 và Diaion HP-20 thu được kết quả tốt. Hiệu suất tách glycosid thu được khi sử dụng nhựa XAD-7 (2,17%) khá cao so với phương pháp chiết bằng n-butanol (1,26%). Khảo sát với nhựa Diaion HP-20 thu được kết quả cao hơn (2,31%) so với nhựa XAD-7 (2,17%). Hơn nữa, bằng cảm quan cho thấy khi sử dụng nhựa Diaion HP-20 thì loại được nhiều tạp màu hofîi.
Vì vậy, trong các quy trình khảo sát tiếp theo chúng tôi tiến hành với cột nhựa Diaion HP-20.