Tiến hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5. ở giai đoạn (1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt trong khoảng thời gian khác nhau (3h, 4h, 5h) với khối lưọng dược liệu 15g, dung môi chiết là H2O, tỉ lệ dược liệu/ dung môi = l/35(w/v), nhiệt độ chiết là 65°c. ở giai đoạn (4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn (5) rửa giải cột với hệ dung môi EtOH- H2O (v/v) 75/25.Tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3. Kết quả được trình bày ở bảng 6.
Bảng 6. Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian chiết dươc liêu.• •
STT Thời gian chiết (h)
Khối lượng dược liệu (g)
Khối lượng tinh thể (g) Hiệu suất chiết (%) 1 3 15,03 0,30 2,27 2 4 15,23 0,31 2,31 3 5 15,01 0,29 2,20 Nhận xét:
Bảng 6 cho thấy khi tăng thời gian chiết từ 3h đến 4h thì hiệu suất chiết thu được tăng lên. Cụ thể là khi thời gian chiết là 3h thì hiệu suất thu được là
2,27% thấp hơn một chút so với việc tăng thời gian chiết lên 4h trong cùng điều kiện chiết suất.
Nhằm nâng cao hiệu suất của quá trình tách glycosid chúng tôi tiếp tục tăng thời gian chiết lên 5h thì thấy hiệu suất của quá trình chiết lại giảm xuống chỉ còn 2,20% thấp hơn nhiều so với khi chiết ở 4h. Điều này có thể do khi tăng thời gian chiết thì lượng tạp trong dịch chiết tăng làm giảm hiệu suất kết tinh glycosid. Thêm vào đó, việc tăng thời gian chiết không thuận lợi cho việc áp dụng vào sản xuất ở quy mô lớn. Do đó với các thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi khảo sát với thời gian chiết là 4h.
3.1.7. Khảo sát tỷ lệ dược lỉệu/dung môi của quá trình chiết suất
Tiến hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5. ở giai đoạn (1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt với tỷ lệ dược liệu/dung môi lần lượt là 1/15, 1/25, 1/35 (w/v), thời gian chiết là 4h, nhiệt độ chiết là 65°c.
ở giai đoạn (4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn (5) rửa giải cột với hệ dung môi EtOH-H2Ơ (v/v) 75/25.Tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3. Ket quả được trình bày ở bảng 7.
Bảng 7. Sự phụ thuộc tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) trong quá trình chiêt dược liệu đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt• • • 9 %/ Đ •
STT Dược liệu/dung môi (w/v) Khối lượng dược liệu (%) Khối lượng tinh thể (g)
Hiệu suất chiết (%) 1 1/15 15,02 0,28 2,12 2 1/25 15,02 0,29 2,20 3 1/35 15,23 0,31 2,31 4 1/40 15,25 0,31 2,31 Nhận xét:
Từ kết quả ở bảng 7, khi tăng tỷ lệ dược liệu/dung môi hiệu suất chiết tăng đáng kể. cụ thể là khi sử dụng với tỷ lệ 1/15 thì hiệu suât chiết thu được là 2,12% thấp hơn khi sử dụng với tỷ lệ 1/25 là 2,20%.
Chúng tôi tiếp tục tăng tỷ lệ dung môi lên tới 1/35 thì hiệu suất chiết tăng lên tới 2,31%, nhưng nếu tăng lên đến 1/40 thì hiệu suất chiết thu được không tăng lên. Điều này có thể do khi tăng lượng dung môi thì lượng glycosid trong dịch chiết tăng lên, tuy nhiên khi tăng đến 1/40 thì làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết gây khó khăn cho việc tách glycosid.
Như vậy, từ kết quả khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi, chúng tôi chọn tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1/35 cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.8. Khảo sát số lần chiết suất
Tiến hành chiết glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở hình 5. ở giai đoạn (1) chúng tôi tiến hành chiết cỏ ngọt với số lần khác nhau (1 lần, 2
lần, 3 lần), thời gian chiêt là 4h, nhiệt độ chiết là 65° c, tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) = 1/35. ở giai đoạn (4) sử dụng cột Diaion HP-20 và ở giai đoạn (5) rửa giải cột với hệ dung môi EtOH-HaO (v/v) 75/25. Tính hiệu suất chiết theo công thức (*) ở mục 2.3. Kết quả được trình bày ở bảng 8.
Bảng 8. Sự ảnh hưởng của số lần chiết xuất đến hiệu suất chiết glycosid
từ cỏ ngọt
Số lần chiết Khôi lượng dược liệu (g)
Khôi lượng tinh thê (g) Hiệu suất (%) Chiêt 1 lân 15,23 0,31 2,31 Chiêt 2 lân 15,23 0,32 2,39 Chiêt 3 lân 15,23 0,32 2,39 Nhận xét:
Theo số liệu ở bảng 8 ta thấy hiệu suất chiết 2 lần so với chiết 1 lần tăng lên 0,08% và khi tiến hành khảo sát chiết lần 3 thì hiệu suất gần như không tăng lên. Như vậy, chỉ cần 1 lần chiết chúng ta cũng có thể thu được gần như hoàn toàn lượng glycosid có trong dược liệu. Do đó trong các quy trình khảo sát tiếp theo chúng tôi chỉ chiết xuất cỏ ngọt bằng nước nóng 1 lần ở giai đoạn (1). Nếu áp dụng vào quy mô sản xuất, có thể chiết xuất lần 2 và dịch chiết lần 2 được sử dụng làm dung môi chiết lần 1 cho mẻ sau (chiết ngược dòng gián đoạn).
3.1.9. Đánh giá khối lượng và độ tinh khiết của CNl trong quá trình tinhchế chế
M ục đích: Đánh giá khối lượng và độ tinh khiết của steviosid sau mỗi lần kết tinh lại.
Tiến hành'.
Glycosid thô chiết được từ 15g dược liệu theo quy trình ở hình 5 được đun hồi lưu cách thủy với MeOH (tỷ lệ steviosid thô/MeOH = 1/50). Thêm 5% than hoạt, đun sôi 10 phút, lọc nóng, rửa than bằng Iml MeOH. Dung dịch thu được đem cất loại dung môi, cắn thu được đem kết tinh bằng MeOH. Cân khối lượng tinh thể CN1 thu được sau kết tinh lại lần 1.
Tiến hành kết tinh lại CN 1 lần 2 bằng MeOH và cân khối lượng tinh thể sau khi kết tinh lại lần 2.
Kết quả:
- Cảm quan: sản phẩm Glycosid thô có màu trắng ngà đến hơi vàng, kết tinh lại lần 1 có màu trắng ngà, kết tinh lại lần 2 thu được sản phẩm có màu trắng tinh.
- Khối lượng Glycosid thu được sau khi kết tinh lại được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9. Khối lưựng CNl thu được sau mỗi lần kết tinh lại
Mầu Khối lượng (g)
Glycosid thô (CN1 ) 0,32
CN1 kết tinh lại lần 1 0,27
Nhận xét; Từ bảng 9 cho thấy CNl sau khi kết tinh lại lần 2 khối lượng giảm ít so với lần 1. Vì vậy, ở quy trình sẽ xây dựng chúng tôi tinh chế glycosid thô bằng cách kết tinh lại 1 ỉần trong MeOH.
Độ tinh khiết của CNl sau mỗi lần kết tinh lại được kiểm tra bằng phương pháp SKLM với hệ dung môi CHCl3:Me0H;H20 = 15:8:1. Kết quả được thể hiện ở sắc ký đồ hình 6.
Hình 6. Ảnh chụp sắc ký đồ của CNl
trong hệ dung môi CHCl3:Me0H:H20
(15:8:1), hiện vết bằng dung dịch H2SO4
10% trong EtOH, sấy 2 phút ở 100“C.
A: Glycosid thô
B: CNl kết tinh lại lần 1 C: CN2 kết tinh lại lần 2
B
Từ sắc ký đồ hình 6 cho thấy Glycosid thô vẫn còn lẫn tạp chất (sắc ký đồ cho 2 vết), sau khi kết tinh lần 1 và lần 2 đã tương đối tinh khiết, trên sắc ký đồ chỉ cho 1 vết.
3.1.10. Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt sử dụng cộtnhựa hấp phụ Diaion HP-20 nhựa hấp phụ Diaion HP-20
Từ kết quả khảo sát các yếu tố của quá trình chiết xuất được trình bày ở các mục 3.1.2 đến 3.1.9, chúng tôi xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt với các điều kiện sau:
Giai đoạn (1): chiết cỏ ngọt bằng nước nóng , nhiệt độ chiết 65°c, thời gian chiết 4h/mẻ, chiết 1 lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu (w/v) = 1/35.
Giai đoạn (2): Loại tạp chất bằng Ca(OH)2
Giai đoạn (4): Tách glycosid bằng cột Diaion HP-20
Giai đoạn (5): Rửa giải bằng hệ dung môi EtOH-H2Ơ (v/v) 75/25 Giai đoạn (7); cắn được kết tinh 2 lần trong MeOH
Quy trình chiết xuất glycoside từ cỏ ngọt được được mô tả chi tiết như sau: Cân chính xác khoảng 15g dược liệu, chiết bằng nước nóng ở 65°c
trong 4h, tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) = 1/35. Dịch chiết thu được thêm Ca(0 H)2 đến pH=9 và khuấy trong 30 phút ở 45°c. Hỗn dịch thu được đem lọc hút bằng phễu lọc Buchner để loại bỏ kết tủa, hòa tan acid citric vào dịch lọc đến khi thu được dịch chiết nước có pH = 7.
Hấp phụ dịch chiết nước cỏ ngọt đã loại tạp lên cột nhựa Diaion HP-20
với tốc độ 3ml/phút.
Rửa giải cột bằng 200ml hệ dung môi EtOH-HiO (v/v) 75/25.
Gộp toàn bộ dịch rửa giải và cất loại dung môi đến khối lượng không đổi thu được cắn. Đun hồi lưu cách thủy cắn trong 10 phút với MeOH (tỷ lệ khối lượng cắn/thể tích MeOH = 1/40) rồi để nguội đến nhiệt độ phòng và kết tinh trong 24h ở nhiệt độ 0-5°C. Lọc lấy tinh thể bằng phễu Buchner, rửa nhanh tinh thể bằng Iml MeOH lạnh và đem sấy chân không.
Glycosid thô được đun hồi lưu trong 10 phút với MeOH, (tỷ lệ khối lượng glycoside thô/thể tích MeOH = 1/50),thêm 5% than hoạt, lọc nóng, rửa than bằng Iml MeOH. Dung dịch thu được đem cất loại dung môi, cắn thu được đem kết tinh bằng MeOH. Cân khối lượng tinh thể thu được.
Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt được trình bày ở
3.1.11. Xác định cấu trúc của chất phân lập (Chất CNl)
Tiến hành chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở mục 3.1.10 thu được tinh thể chất CN1.
Tính chất:
CN1 là tinh thể màu trắng, kết tinh trong MeOH, trên SKLM không có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, hiện màu nâu đen sau khi phun dung dịch H2SO4 10% trong EtOH và sấy 2 phút ở 100°c.
Nhiệt độ nóng chảy: CNl có nhiệt độ nóng chảy là 196-202°c.
Phổ khối EI-MS [phụ lục 3]
Họp chất CNl có công thức phân tử là CsgHôoOis ứng với pic ion ^■"=805,40.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [phụ lục 1 và 2]
Phổ 'H-NMR chỉ ra sự có mặt của 2 nhóm methyl singlet ở ỗ 0,86 (H20) và 1,13 (His). Hai proton olefmic của một exocyclic đôi ở ô 4,71 và 5,02; 9 nhóm methylen và 2 nhóm methin nằm trong khoảng ỗ 0,77-2,15 đặc trưng cho loại họp chất ent-kauran diterpenoid đã được phân lập từ chi Stevia. Trên phổ ESI-MS của CNl chỉ ra các mảnh ion ở 805,40; 643,40; 481,40 chứng tỏ sự có mặt của 3 nhân hexose. Sự phân mảnh từ m/z 805,40 xuống 659,40 chứng tỏ sự có mặt của cấu trúc deoxyhexose trong phân tử. Sự có mặt của 3 phân tử đường glucose trong CNl được thể hiện trên phổ ’H-NMR với sự có mặt của proton anome ở ô 5,25 ppm (d, J = 8,00Hz); 4,45 ppm (d, J = 7,50 Hz); 4,35 ppm (d, J = 8,00 Hz). Hằng số tương tác J của nó cho thấy chúng ở vị trí Ị3 như các tài liệu đã công bố [19],[33].
Phổ ’^C-NMR chỉ ra sự có mặt của 38C, trong đó có 20 c của khung ent-kauran (steviol) và 18 c của 3 vòng đưòmg. Sự có mặt của c trong steviol
thể hiện ở nhóm cacbonyl trong este ở ỗ 175,58 ppm (C19); >c= bậc 4 ở 153,51 ppm (C,6). 5 Carbon bậc 4 khác là ỗ 46,78 (C4); 56,44 ( C 5 ) ; 84,61 (Cịs); 43,19 (Cg); 40,00 (Cio). Ngoài ra còn có 2 nhóm -CH3; 10 nhóm -C H2
với nhóm =CH2 ở 104,51 ppm ( C 17 ) ; 1 nhóm -C H ở 53,11 ppm. 3 Carbon anome nằm ở: 94,10 ppm (Cr); 96,33 ppm (C2O; 104,55 ppm (C 3O .
Dữ liệu phổ NMR của chất CN1 được trình bày ở phụ lục 1 và phụ lục
2 và được ở bảng 10. Bảng 10: Dữ liệu phổ *H-NMR và ^^C-NMR của chất CNl Vị trí ’H-NMR (ppm) ‘^C-NMR (ppm) 1 0,77 (m, IH); 1,77 (m, IH) 40,95 2 1,39 (m,lH); 1,99 (m, IH) 18,64 3 1,05 (m, 2H) 38,80 4 46,78 5 1,03 (m, IH) 56,44 6 1,77 (m, IH) 19,99 7 1,36 (m, IH) 41,99 8 43,10 9 0,91 (m, IH) 53,11 10 40,00 11 1,70 (m, 2H) 21,16 12 1,47 (m, 2H) 37,30 13 84,61 14 1,53 (m, IH); 2,15 (d; J = 11,50; IH) 46,87
15 2 ,0 6 (d ;J = 13,50; IH) 46,874 16 153,51 17 4,71 (S,1H);5,00 (s, IH) 104,51 18 1,13 (s, 3H) 28,03 19 175,58 20 0,86 (s,3H) 15,10 1’ 5,25 (d; J = 8,00; IH) 94,10 2’ 3,50 (m, IH) 82,57 3’ 3,48 (m,lH) 76,61 4’ 3,37 (m, IH) 70,31 5’ 3,35 (m, IH) 76,91 6’ 3,63 (m, IH); 3,83 (m, IH) 61,00 1” 4,45 (d; J = 7,50; IH) 96,33 2” 3,61 (m, IH) 77,01 3” 3,72 (m, IH) 84,61 4” 3,37 (m, IH) 70,31 5” 3,30 (m,lH) 76,91 6” 3,63 (m, IH) 60,50 6” 3,82 (m, IH) 60,70 1’” 4,35 (d; J = 8,00; IH) 104,55 2” ’ 3,16(d; J = 8,00; IH) 75,25 3’” 3,60 (m, IH) 76,90
4’” 3,15 (m, IH) 72,50
5’” 3,44 (m, IH) 77,61
6’” 3,82 (m, IH) 61,00
Kết luận:
Dựa vào nhiệt độ nóng chảy và dữ liệu phổ MS, NMR, so sánh với dữ liệu đã được công bố trong các tài liệu tham khảo ([13], [16], [17], [19], [33]), chúng tôi đã xác định hợp chất CNl là steviosid có cấu trúc hóa học được trình bày ở hình 8.
Hình 8. Cấu trúc hóa học của CNl: steviosid
OH
3.1.12. Định lượng steviosid chiết được từ cỏ ngọt bằng phương phápHPLC HPLC
Tiến hành chiết xuất Steviosid từ cỏ ngọt theo quy trình mô tả ở mục 3.1.1.10 thu được Steviosid. Định lượng Steviosid chiết được bằng phương pháp HPLC cho thấy steviosid kết tinh lại 2 lần có độ tinh khiết 89% [phụ lục 41.
3.2. BÀN LUẬN
Tổng quan tài liệu cho thấy cỏ ngọt là một loại cây được trồng phổ biến tại nhiều nước trên thế giới với ứng dụng chính là sử dụng làm chất điều vị thay thế đường saccharose trong các loại thực phẩm. Tuy nhiên, trước đây việc sử dụng cỏ ngọt đã gây nhiều tranh cãi vì có ý kiến cho rằng cỏ ngọt có thể gây ảnh hưởng đến khả năng sinh sản trên chuột thí nghiệm. Dựa trên các kết quả nghiên cứu bằng thực nghiệm, mới đây, vào năm 2010, ủ y ban châu Âu về an toàn thực phẩm đã kết luận các steviol glycosid - thành phần chính của cỏ ngọt nếu đạt các yêu cầu kỹ thuật thì không gây ung thư, không gây đột biến, không có bất kỳ tác dụng không mong muốn nào trên hệ phát triển và sinh sản của cơ thể [15]. Điều này có nghĩa là chúng ta có thể yên tâm sử dụng Cỏ ngọt và các chất chiết xuất từ cỏ ngọt trong đời sống.
Tham khảo tài liệu, chúng tôi đã tổng kết được ba phưong pháp chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt là phương pháp của (Bùi Thị Song Sơn), 1996 [4], phương pháp của Giovanetto 1988 [27] và phương pháp của Payzant
1999[26].
Phương pháp của Bùi Thị Song Sơn 1996 [4] có ưu điểm là dễ thực hiện, ít tốn kém với các hóa chất và thiết bị sẵn có trong phòng thí nghiệm. Nhưng nhược điểm của phưoTTig pháp này là sử dụng methanol là dung môi độc hại, giá thành cao, không phù họp với chiết ở quy mô công nghiệp. Hiệu suất chiết theo phương pháp này tương đối thấp.
Phưong pháp của Giovanetto 1988 [27] sử dụng dung môi rẻ tiền, không độc hại là nước và phưoTig pháp này cũng được coi là nền tảng cho việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp trong dịch chiết nước cỏ ngọt. Hiệu suất chiết xuất steviosid cao (8%). Tuy nhiên, steviosid chiết được có độ tinh khiết thấp (75%).
Phương pháp của Payzant 1999 [26] dựa trên cơ sở phương pháp của Giovanetto 1988 nhưng cải tiến bằng cách dịch rửa giải sau khi qua cột trao đổi ion được tiếp tục cho qua cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-7, rửa giải bằng methanol. Tiến hành theo phương pháp này, glycosid chiết được có độ tinh khiết cao hơn so với phưofng pháp của Giovanetto 1988 [27;.
Từ sự phân tích ở trên, chúng tôi đã dự kiến các giai đoạn chính của quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt ở mục 3.1.1 để phát huy những ưu điểm và khắc phục những nhược điểm của phương pháp chiết xuất trước đây. Từ quy trình dự kiến đó, chúng tôi tiến hành khảo sát một số thông số trong quá trình chiết xuất như nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi, loại nhựa hấp phụ, hệ dung môi rửa giải cột nhựa, số lần kết tinh lại.. .Kết quả chúng tôi đã lựa chọn được những thông số phù họp và xây dựng được quy trình chiết xuất Steviosid từ cỏ ngọt đã được trình bày ở mục 3.1.10. Đây chính là đóng góp mới của đề tài.
Một số nghiên cứu trước đây đã cho thấy sử dụng dung môi chiết xuất là methanol hoặc methanol - nước cho hiệu suất chiết cao hơn so với chiết bằng nước. Tuy nhiên, methanol là dung môi độc hại, giá thành cao nên để áp dụng vào sản xuất chúng tôi sử dụng dung môi chiết rẻ tiền, không độc hại là nước nóng.
Theo một số nghiên cứu, trong lá cỏ ngọt có carbohydrat (61,93%), protein (11,41%), cellulose (15,52%) tính theo khối lưọng lá khô; ngoài ra còn có các chất khoáng K, Ca, Na, Mg, Cu, Mn, Fe, Zn và một số amino acid [13]. Dịch chiết nước cỏ ngọt có tạp chất protein, gôm, pectin, chất khoáng, chất màu,... Bằng cảm quan cho thấy việc sử dụng Ca(0H)2 đã loại được một