KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HĨA HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT Q TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.) SVTH : VÕ THỊ THU TRANG Bộ mơn : CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Niên khóa: 2004-2008 Tháng 10/2008 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT HOẠT CHẤT GLYCOSIDES TỪ CÂY CỎ NGỌT Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.) Tác giả VÕ THỊ THU TRANG Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu Cấp Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học Giáo viên hướng dẫn Th.S NGUYỄN HỮU ANH TUẤN Tháng 10/2008 i LỜI CÁM ƠN Con thành kính ghi ơn cơng lao sinh thành dưỡng dục cha mẹ, tồn thể gia đình ln bên sống Tôi xin chân thành cảm ơn Th.S Nguyễn Hữu Anh Tuấn tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Xin cám ơn T.S Võ Duy Huấn góp ý giúp tơi giải đáp khúc mắc trình thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh thầy Bộ mơn Cơng Nghệ Hóa Học truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học đại học Cuối xin cám ơn toàn thể bạn bè giúp đỡ, động viên, chia sẻ khó khăn với tơi q trình thực đề tài Thành phố Hồ Chí Minh Võ Thị Thu Trang ii TĨM TẮT Đề tài “Khảo sát q trình tách chiết hoạt chất glycosides từ cỏ Stevia Rebaudiana Bertoni (Bert.)” Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách hoạt chất gây (hệ dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết tỉ lệ DM/NL) lên lượng cao tổng cao BuOH Mục đích: tối ưu thơng số ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách hoạt chất cho nguồn nguyên liệu cỏ Hải Hưng Đây qui hoạch thực nghiệm bốn yếu tố bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu phương án quay bậc hai có tâm Bốn yếu tố khảo sát hệ dung môi chiết (cồn 15, cồn 10, cồn 5), nhiệt độ chiết (65 oC, 70oC, 75oC), thời gian chiết (20 phút, 30 phút, 40 phút) tỉ lệ DM/NL (65, 75, 85) Kết quả: Từ phân tích ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên đáp ứng, thông số tối ưu thiết lập dựa giản đồ tối ưu với sở làm cực đại đáp ứng Điều kiện chiết tách kiến nghị cho nguồn nguyên liệu Hải Hưng hệ dung môi (cồn, nước) 6,51%, nhiệt độ chiết 64,03oC, thời gian chiết 44,45 phút với tỉ lệ DM/NL 55; lượng cao tổng thu 1,84g lượng cao BuOH 0,22g iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cám ơn ii Tóm tắt iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng vii Danh sách hình ảnh – sơ đồ viii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Yêu cầu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan cỏ 2.1.1 Giới thiệu cỏ 2.1.2 Các hợp chất có cỏ 2.1.3 Tình hình sử dụng cỏ nước 12 2.1.4 Tình hình sử dụng cỏ giới 13 2.2 Các cơng trình nghiên cứu cỏ 14 2.2.1 Các nghiên cứu thành phần chất có cỏ 14 2.2.2 Các nghiên cứu chiết tách hợp chất cỏ 15 2.2.3 Các nghiên cứu độc tố cỏ 21 2.2.4 Các hướng nghiên cứu cỏ 22 2.3 Định tính định lượng thành phần có cỏ 23 2.3.1 Sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 23 2.3.2 Sắc ký lớp mỏng TLC 24 2.4 Ứng dụng cỏ 24 2.4.1 Ứng dụng đời sống 25 2.4.2 Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ 25 iv CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 27 3.1 Thiết bị hóa chất .27 3.1.1 Thiết bị .27 3.1.2 Hóa chất .27 3.2 Nguyên liệu 27 3.2.1 Khảo sát độ tro .28 3.2.2 Khảo sát độ ẩm 29 3.3 Qui trình cơng nghệ thực .30 3.4 Phương pháp thí nghiệm 35 3.4.1 Cơ sở khảo sát 35 3.4.2 Bố trí thí nghiệm 35 3.5 Phương pháp đo đạc 37 3.6 Xử lý số liệu 37 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Kết khảo sát nguyên liệu .38 4.1.1 Độ tro 38 4.1.2 Độ ẩm 38 4.2 Kết khảo sát điều kiện chiết 38 4.2.1 Kết phân tích ảnh hưởng yếu tố khảo sát đến lượng cao tổng .41 4.2.2 Kết phân tích ảnh hưởng yếu tố khảo sát đến lượng cao BuOH 45 4.2.3 Nhận xét chung 48 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1 Kết luận .50 5.2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 55 Phụ lục 55 Phụ lục 59 Phụ lục 62 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADI Acceptable Daily Intake ns not stated in original publication CC Column Chromatography HPLC High Pressure Liquid Chromatography TLC Thin Layer Chromatography TJPR Tropical Journal of Pharmaceutical Research EtOAc Ethyl acetate BuOH Butanol DM/NL dung môi /nguyên liệu vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng cỏ .5 Bảng 2.2 Tỉ lệ hợp chất gây có khơ Bảng 2.3 Thành phần cấu trúc hợp chất gây Bảng 2.4 Hàm lượng stevioside rebaudioside A số quốc gia .8 Bảng 2.5 Cường độ gây stevioside rebaudioside A nước 10 Bảng 2.6 Cường độ gây Marumilon 50 loại dung dịch 10 Bảng 2.7 Độ tan nước hợp chất gây .11 Bảng 2.8 Các nghiên cứu khả gây độc chủ yếu hỗn hợp chất stevia từ Nhật Bản 21 Bảng 2.9 Hàm lượng tối đa chất gây từ cỏ thực phẩm 22 Bảng 3.1 Mã hóa yếu tố khảo sát 36 Bảng 3.2 Bố trí thực nghiệm điều kiện khảo sát 36 Bảng 4.1 Kết khảo sát độ tro cỏ 38 Bảng 4.2 Kết khảo sát độ ẩm cỏ 38 Bảng 4.3 Kết khảo sát điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 1) 39 Bảng 4.4 Kết khảo sát điều kiện chiết tách (Thực nghiệm LẦN 2) 40 Bảng 4.5 Tác động yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng 42 Bảng 4.6 Tác động yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao BuOH .46 vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH – SƠ ĐỒ Hình 2.1 Cây cỏ Hình 2.2 Hạt giống cỏ Hình 2.3 Hoa cỏ Hình 2.4 Cỏ khô Hình 2.5 Cơng thức cấu tạo steviol Hình 2.6 Mơ hình đánh giá tương quan hậu vị Hình 2.7 Cỏ trồng theo mùa vụ Paraguay 13 Hình 2.8 Các sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ cỏ 26 Hình 3.1 Mẫu cỏ trước sau xử lý 28 Hình 3.2 Bảo quản cỏ 28 Hình 3.3 Cỏ đun hồi lưu với dung môi chiết .32 Hình 3.4 Hỗn hợp chiết lọc chân không loại phần bã rắn 32 Hình 3.5 Cơ quay chân khơng loại dung mơi 32 Hình 3.6 Cao tổng .33 Hình 3.7 Lắc với EtOAc .33 Hình 3.8 Lọc tách lấy pha lỏng .33 Hình 3.9 Cô quay chân không loại EtOAc 34 Hình 3.10 Lắc với BuOH bão hòa nước 34 Hình 3.11 Cơ quay chân khơng loại BuOH 34 Hình 4.1 Mơ hình thể tính tương thích yếu tố lên cao tổng 41 Hình 4.2 Mơ hình bề mặt đáp ứng cao tổng biểu diễn theo thời gian chiết, nhiệt độ chiết hệ dung môi .42 Hình 4.3 Tương tác yếu tố lên lượng cao tổng .43 Hình 4.4 Mơ hình thể tính tương thích yếu tố lên cao BuOH 45 Hình 4.5 Mơ hình bề mặt đáp ứng cao BuOH biểu diễn theo thông số khảo sát điều kiện chiết 46 Hình 4.6 Tương tác yếu tố lên lượng cao BuOH 47 viii Hình 4.7 Ảnh hưởng yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng cao BuOH .49 Hình 4.8 Tối ưu hóa yếu tố khảo sát lên đáp ứng cao tổng cao BuOH 49 Sơ đồ 2.1 Qui trình tách chiết chất từ cỏ Nhật Bản 17 Sơ đồ 2.2 Qui trình tách chiết hỗn hợp chất từ cỏ Paraguay .18 Sơ đồ 2.3 Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ Việt Nam 19 Sơ đồ 2.4 Qui trình tách chiết stevioside từ cỏ làm chất chuẩn Việt Nam 20 Sơ đồ 3.1 Qui trình khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện chiết .31 ix Phụ lục 2: Cấu trúc hợp chất không gây ngọt[11] Phụ lục 2.1: Cấu trúc labdane-type diterpenes cô lập từ cỏ 59 Phụ lục 2.2: Cấu trúc triterpenes sterols cô lập từ cỏ 60 Phụ lục 2.3: Cấu trúc flavonoids cô lập từ cỏ 61 Phụ lục 3: Kết xử lý số liệu JMP 4.0 Phụ lục 3.1: Response Cao tong Least Square Fit Actual by Predicted Plot cao tong Actual 1.8 1.76 1.72 1.68 1.68 1.70 1.72 1.74 1.76 1.78 1.80 cao tong Predicted P F F 0.1525 Max RSq 0.9076 1.82 Parameter Estimates Term Intercept he dung moi(-1,1)&RS nhiet chiet(-1,1)&RS thoi gian chiet(-1,1)&RS ti le(-1,1)&RS he dung moi(-1,1)*nhiet chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) nhiet chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) he dung moi(-1,1)*ti le(-1,1) nhiet chiet(-1,1)*ti le(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*ti le(-1,1) he dung moi(-1,1)*he dung moi(-1,1) nhiet chiet(-1,1)*nhiet chiet(-1,1) thoi gian chiet(-1,1)*thoi gian chiet(-1,1) ti le(-1,1)*ti le(-1,1) Estimate 1.73 0.005625 -0.006042 0.008125 0.0002083 0.0015625 -0.005313 -0.008438 -0.003438 0.0134375 -0.015938 0.0056771 0.0000521 -0.000573 0.0056771 Std Error 0.004391 0.001553 0.001553 0.001553 0.001553 0.001902 0.001902 0.001902 0.001902 0.001902 0.001902 0.001647 0.001647 0.001647 0.001647 t Ratio 393.95 3.62 -3.89 5.23 0.13 0.82 -2.79 -4.44 -1.81 7.07 -8.38 3.45 0.03 -0.35 3.45 Prob>|t|