Định lượng geniposid và đánh giá tác dụng chống đột quỵ não của cao chiết quả dành dành ( gardenia jasminoides ellis)

Đặc biệt, trong bài thuốc Tongluo Jiunao, có chứa chủ yếu là các hoạt chất chiết từ dành dành Gardenia jasminoides Ellis và tam thất Panax notoginseng gần đây được đăng ký phát minh và đ

(GARDENIA JASMINOIDES ELLIS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

(GARDENIA JASMINOIDES ELLIS)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Phạm Thái Hà Văn

2 TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dược học cổ truyền

2 Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và rèn luyện tại giảng đường Đại học Dược Hà Nội, em

đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình và bạn bè

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới những người hướng dẫn trực tiếp đề tài khóa luận cho em:

ThS Phạm Thái Hà Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền - thầy đã tạo điều kiện

tối đa cho em được làm khóa luận tại Viện Dược Liệu và đóng góp những ý kiến quý báu cho em hoàn thành khóa luận này

TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Khoa Dược lý, sinh hóa Viện Dược Liệu - cô

luôn nhiệt tình chỉ bảo và tạo điều kiện tối đa cho em được trực tiếp tham gia thực hiện các thử nghiệm dược lý

TS Hà Vân Oanh – Bộ môn Dược học cổ truyền - cô luôn hết lòng giúp đỡ em

từ lúc bắt đầu tới những lúc gặp khó khăn khi làm khóa luận

TS Lê Thị Xoan – Khoa Dược lý, sinh hóa Viện dược liệu – chị đã giúp đỡ em

trong các thử nghiệm dược lý, cũng như cho em những kinh nghiệm quý báu của người đi trước để thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ Khoa Dược lý, sinh hóa và Khoa Hóa thực vật I - Viện Dược liệu đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và cho em những lời động viên, khích lệ để em có thêm động lực hoàn thành khóa luận

Em cũng chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cùng toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho em những kiến thức quý báu và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho em cho em trong 5 năm học qua

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn giúp đỡ và động viên em trong học tập cũng như trong cuộc sống

Hà nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017

Sinh viên, Tống Thanh Huyền

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ……… ……… … 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đột quỵ não 3

1.1.1 Khái niệm đột quỵ 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ 3

1.1.4 Cơ sở giải phẫu – sinh lý tuần hoàn não 4

1.2 Đột quỵ thiếu máu não cục bộ 6

1.2.1 Sinh lý bệnh đột quỵ thiếu máu cục bộ 6

1.2.2 Mô hình đột quỵ thiếu máu não cục bộ 8

1.2.3 Thuốc điều trị 10

1.3 Tổng quan về quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) 11

1.3.1 Vị trí phân loại 11

1.3.2 Mô tả cây dành dành 12

1.3.3 Phân bố, sinh thái 12

1.3.4 Thu hái, chế biến, bảo quản bộ phận dùng quả dành dành 13

1.3.5 Thành phần hóa học của quả dành dành 13

1.3.6 Tác dụng dược lý 15

1.3.7 Tính vị, công năng 17

1.3.8 Công dụng 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Nguyên liệu 18

2.1.2 Động vật thí nghiệm 18

2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Định lượng geniposid trong cao chiết EtOH quả dành dành bằng phương pháp HPLC 20

2.2.2 Đánh giá tác dụng dược lý 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 30

3.1 Định lượng geniposid trong cao chiết EtOH quả dành dành 30

3.1.1 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử 30

3.1.2 Kết quả định lượng geniposid mẫu chuẩn 31

3.1.3 Kết quả định lượng geniposid trong cao chiết EtOH quả dành dành 32

3.2 Đánh giá tác dụng chống đột quỵ não của cao chiết EtOH 50% quả dành dành 34

3.2.1 Tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh của cao chiết quả dành dành trên chuột phẫu thuật MCAO 34

3.2.2 Xác định mức độ nhồi máu não chuột bằng phương pháp nhuộm 2,3,5 - triphenyltetrazolium chloride (TTC) 37

BÀN LUẬN……… 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………47

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CCA Common carotid artery (Động mạch cảnh chung)

ECA External carotid artery (Động mạch cảnh ngoài)

ICA Internal carotid artery (Động mạch cảnh trong)

MCA Middle cerebral artery (Động mạch não giữa)

DD250 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 250 mg/kg

(Liều thấp) DD500 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 500 mg/kg

(Liều trung bình) DD1000 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 1000 mg/kg

(Liều cao) FDA Food and Drug Administration

ED50 Liều có hiệu quả (effective dose) trên 50% số con vật thí nghiệm EtOH Ethanol

MeOH Methanol

HPLC High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao) i.v Đường tiêm tĩnh mạch

p.o Đường uống

MCAO Middle cerebral artery occlusion

(Thuyên tắc động mạch não giữa) tpA Human tissue-type plasminogen activator

TTC 2,3,5 - triphenyltetrazolium chloride

v/v Thể tích/thể tích

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong đề tài 19

Bảng 2.2 Các lô chuột tiến hành thử tác dụng dược lý 25

Bảng 3.1 Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ geniposid 31

Bảng 3.2 Kết quả định lượng geniposid trong cao 33

Bảng 3.3 Điểm đánh giá tổn thương thần kinh 35

Bảng 3.4 Tỷ lệ % nhồi máu não chuột 37

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Mô hình thiếu máu não 9

Hình 1.2 Quả dành dành 11

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của sắc tố gạch trong quả dành dành 13

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của một số chất iridoid glycoside 14

Hình 2.1 Sợi monofilament có đầu silicon gây tắc mạch 20

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng dược lý của cao chiết EtOH quả dành dành 23

Hình 2.3 Quy trình phẫu thuật MCAO trên chuột 27

Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn geniposid 30

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử 30

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng (diện tích pic) và nồng độ mẫu chuẩn geniposid 32

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn điểm tổn thương thần kinh ngày 6 36

Hình 3.5 Hình ảnh đặc trưng lát cắt não của các nhóm chuột nghiên cứu khi nhuộm bằng TTC Vùng màu trắng chỉ vùng nhồi máu não 38

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % nhồi máu não chuột 38

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đột quỵ (stroke) hay tai biến mạch máu não (cerebrovascular accident) là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 2 trong top 10 nguyên nhân gây tử vong toàn cầu chỉ sau nhồi máu cơ tim theo số liệu thống kê năm 2015 của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [40], là nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu ở người trưởng thành [38] và chiếm khoảng 2 - 4% tổng chi phí chăm sóc y tế toàn thế giới [18] Đột quỵ gồm 2 thể: thiếu máu cục bộ não (ischaemic stroke) hay thuật ngữ lâm sàng là nhồi máu não (infarction) và thể thứ hai là xuất huyết não (haemorragic stroke)

Tại Mỹ, cứ 40 giây lại có 1 trường hợp đột quỵ não cấp và cứ 4 phút lại có 1 trường hợp tử vong do đột quỵ não cấp Mỗi năm, hơn 795.000 người Mỹ có cơn đột quỵ, khoảng 610.000 trong số đó là mắc lần đầu hoặc mới mắc Đột quỵ là nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật, đột quỵ làm giảm khả năng vận động của hơn một nửa số người sống sót sau cơn đột quỵ ở độ tuổi 65 và và hơn 65 Khoảng 87% các ca đột quỵ là đột quỵ thiếu máu não (lưu lượng máu đến não bị tắc nghẽn) Chi phí cho điều trị đột quỵ tại Mỹ là 33 tỷ đô la mỗi năm, bao gồm chi phí của các dịch

vụ chăm sóc sức khỏe, thuốc điều trị, và số ngày nghỉ việc [14]

Tuy nhiên, liệu pháp điều trị đột quỵ não cho đến nay còn rất hạn chế và chưa được tối ưu Hiện nay, tPA (human tissue - type plasminogen activator) là liệu pháp duy nhất được FDA phê chuẩn trong điều trị đột quỵ nhồi máu não với khả năng làm tan cục máu đông và phục hồi sự tưới máu đến vùng não bị thiếu máu Tuy nhiên, tPA có giới hạn phạm vi tác dụng trong vòng 4,5 giờ tính từ thời điểm bắt đầu bị đột quỵ và việc sử dụng các thuốc này cũng mang đến nguy cơ tử vong do xuất huyết não [39] Do đó, xu hướng nghiên cứu, phát triển thuốc có khả năng chống đột quỵ não từ dược liệu an toàn và ít rủi ro hơn là một hướng đi có triển vọng với các nhà nghiên cứu

Quả dành dành, có tên khoa học Gardenia jasminoides Ellis là một loại dược

liệu được trồng phổ biến ở các tỉnh đồng bằng và trung du nước ta Trên thế giới đã

có nhiều nghiên cứu cho thấy quả dành dành có chứa geniposid, thành phần đã được

2

chứng minh là có tác dụng chống chết tế bào theo chu trình (apoptosis), giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu não, chết tế bào thần kinh và cải thiện trí nhớ của chuột thiếu máu não cục bộ Đặc biệt, trong bài thuốc Tongluo Jiunao, có chứa chủ yếu là các

hoạt chất chiết từ dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) và tam thất (Panax notoginseng) gần đây được đăng ký phát minh và được sử dụng trên lâm sàng với

tác dụng bảo vệ thần kinh trong trường hợp bị thiếu máu não cục bộ [11] Tuy nhiên, ở nước ta chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng chống đột quỵ của quả dành dành

Vì vậy, đề tài “Định lượng geniposid và đánh giá tác dụng chống đột quỵ não

của cao chiết quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis)” được thực hiện với

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đột quỵ não

1.1.1 Khái niệm đột quỵ

Định nghĩa đột quỵ của Tổ chức Y tế Thế giới năm 1970: “Các dấu hiệu rối loạn chức năng của não (khu trú hoặc toàn thể) phát triển nhanh, kéo dài trên 24 giờ hoặc dẫn đến tử vong, không xác định nguyên nhân nào khác ngoài căn nguyên mạch máu” [35]

Định nghĩa trên vẫn được sử dụng cho đến thời điểm hiện tại

1.1.2 Phân loại

Theo sinh bệnh học đột quỵ được chia thành [8], [33]:

- Nhồi máu não hay đột quỵ thiếu máu não cục bộ: Xảy ra khi một động mạch cung cấp máu giàu oxy cho não bị tắc nghẽn

+ Xuất huyết nội sọ: Mạch máu bên trong não bị rò rỉ máu hoặc vỡ

+ Xuất huyết dưới nhện: Mạch máu trên bề mặt của não bị rò rỉ máu hoặc vỡ Chảy máu xảy ra ở giữa các lớp trong và các lớp giữa màng bao phủ não

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ

- Tăng huyết áp là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất

- Đái tháo đường

- Bệnh tim

- Tai biến mạch máu não thoáng qua

- Béo phì

4

- Tăng ngưng kết tiểu cầu

- Nghiện rượu

- Nghiện thuốc lá

- Tăng lipid máu

- Tăng acid uric máu (có thể là yếu tố nguy cơ)

- Nhiễm khuẩn

- Yếu tố di truyền và gia đình

- Các yếu tố khác: dùng thuốc tránh thai, chế độ ăn nhiều muối,… [3]

1.1.4 Cơ sở giải phẫu – sinh lý tuần hoàn não

1.1.4.1 Hệ thống động mạch não

 Có 4 động mạch đảm bảo tưới máu nuôi não là 2 động mạch cảnh trong và 2 động mạch đốt sống, trong đó ở mỗi bên phải hay trái có 2 dòng máu, một dòng máu phía trước do động mạch cảnh trong và một dòng phía sau do động mạch đốt sống Động mạch cảnh trong phân ra các nhánh tận, quan trọng nhất là các nhánh động mạch não giữa, động mạch não trước, động mạch mạc trước và động mạch thông sau

Động mạch não giữa đi qua tam giác khứu giác, uốn quanh thùy đảo và chạy ra phía sau vào rãnh Sylvius Khi tắc động mạch não giữa bệnh cảnh phố biến vẫn là liệt nửa người ở tay và mặt rõ hơn ở chân, mất cảm giác nửa người

 Bàng hệ của tuần hoàn não

Mạng nối này chia ra làm 3 phần khác nhau: ngoài sọ, đáy sọ, bề mặt của não Trong đó, mạng nối đáy sọ - đa giác Willis là một hệ thống mạch nối độc đáo, hình thành là một vòng kín gồm các động mạch thông trước và thông sau; từ vòng hình đa giác có tỏa ra các động mạch lớn đi các phía Đây là một vòng tuần hoàn bàng hệ ở đáy sọ nối nhiều nhánh tận của động mạch cảnh trong với nhau và với hệ sống nền qua trung gian các động mạch thông trước và thông sau:

- Động mạch thông trước là mạch nối quan trọng cho phần trước của 2 bán cầu, nối 2 động mạch não trước (tận cùng của 2 động mạch cảnh trong)

Nhờ có hệ thống các mạch nối thiết lập nhiều tầng mà máu có thể thông giữa hệ cảnh ngoài với cảnh trong và sống nền, giữa bán cầu trái với bán cầu phải, giữa khu vực nông của mạch này với mạch khác Tuy nhiên trong điều kiện bình thường thì các bàng hệ hầu như không hoạt động, mỗi động mạch chỉ tưới cho khu vực nó phụ trách, chỉ khi có một tổn thương tắc hẹp, do sự chênh lệch huyết áp (trên chỗ tắc áp huyết bị hạ) máu được tưới từ khu vực có áp lực cao đến khu vực áp lực thấp thông qua đường tuần hoàn bàng hệ

Một số điểm quan trọng cần ghi nhận đã được một số tác giả nhất trí:

- Chỗ tắc càng xa não và càng gần quai động mạch chủ thì khả năng tưới bù càng lớn

- Sự tắc mạch xảy ra càng chậm, hệ thống mạng nối càng hiệu nghiệm [6], [9] 1.1.4.2 Đặc điểm sinh lý tuần hoàn não

 Lưu lượng máu não và cơ chế tự điều hòa cung lượng máu não

- Lưu lượng máu não: Lưu lượng máu não bình thường 700 – 750 ml/phút, bằng

14 – 15% lưu lượng tim bơm cho toàn cơ thể, quy ra đơn vị trọng lượng não là 50 –

55 ml/100 gam/phút Lưu lượng máu não rất hằng định

- Cơ chế tự điều hòa cung lượng máu não:

+ Người bình thường có lưu lượng máu não luôn luôn cố định là 55 ml/100g não/phút Lưu lượng này không biến đổi theo cung lượng tim Khi có huyết áp cao, máu sẽ lên não nhiều thì các cơ trơn thành mạch nhỏ co lại và ngược lại khi huyết

áp hạ các mạch lại giãn ra để máu lên đủ hơn Cơ chế điều chỉnh này sinh ra từ cơ trơn thành mạch tùy thuộc vào huyết áp trong lòng mạch, gọi là hiệu ứng Bayliss Khi HA trung bình thấp dưới 60 mmHg, hoặc cao hơn 150 mmHg cung lượng máu não sẽ tăng hoặc giảm theo cung lượng tim (mất hiệu ứng Bayliss)

6

+ Sự điều hòa về chuyển hóa: Phân áp CO2 trong máu động mạch (PaCO2) nếu tăng sẽ làm giãn mạch làm tăng lưu lượng máu não, nếu giảm thì ngược lại gây co mạch và làm giảm lưu lượng máu não

 Thời gian máu qua não và sự tiêu thụ oxy, glucose

Máu chảy qua não khá nhanh, chỉ chừng 3 giây Máu chảy qua màng não lâu hơn, chừng 9 giây Tốc độ tuần hoàn này phụ thuộc vào áp suất ở động mạch cảnh Lưu lượng oxy tiêu thụ ở não bằng 18% mức tiêu thục oxy toàn cơ thể

Mức tiêu thụ glucose cũng chiếm tỉ lệ tương tự so với toàn thân Não không có

dự trữ glycogen, do đó não rất cần máu tuần hoàn liên tục cung cấp glucose Khi thiếu glucose, các mô khác sử dụng đường tân tạo từ protein và mỡ, là một phương thức tiết kiệm glucose, để dành glucose ưu tiên cho não [6], [9]

1.2 Đột quỵ thiếu máu não cục bộ

1.2.1 Sinh lý bệnh đột quỵ thiếu máu cục bộ

1.2.1.1 Ảnh hưởng của thiếu máu cục bộ ở cấp tế bào

Thiếu máu cục bộ gây tổn thương não bằng cách kích hoạt dòng thác thiếu máu cục bộ, tiến đến sự cạn kiệt oxy hoặc glucose tại đó, gây suy giảm sản xuất hợp chất phosphate năng lượng cao, như ATP Điều này gây ảnh hưởng bất lợi đến các quá trình phụ thuộc năng lượng cần thiết cho mô tế bào sống, và gây ra một loạt các biến cố liên quan đến nhau mà đỉnh điểm là tổn thương và chết tế bào Mức độ thương tổn thường phụ thuộc vào thời gian, mức độ nghiêm trọng và vị trí của thiếu máu cục bộ

Neuron, với vai trò trong việc truyền xung động cần duy trì gradient ion qua màng, do đó đòi hỏi cần cung cấp liên tục glucose và oxy và nó dễ bị ảnh hưởng nhất do thiếu oxy

Các cơ chế gây tổn thương mô/cơ chế bảo vệ tế bào thần kinh là:

- Cạn kiệt dự trữ năng lượng tế bào do suy các ty thể

Điều này càng gây ra cạn kiệt năng lượng và có thể kích hoạt tế bào chết theo chu trình Người ta thấy rằng suy năng lượng không gây chết tế bào ngay lập tức, nhưng 5-10 phút tắc mạch có thể dẫn đến tổn thương não không hồi phục Hầu hết

7

đột quỵ thiếu máu cục bộ thường không gây tắc mạch hoàn toàn, tuy nhiên thời gian kéo dài cũng có thể gây hại do suy giảm gradient ion và tạo các sản phẩm phụ (như acid lactic, hydrogen ion) do chuyển hóa kỵ khí

- Mất chức năng bơm ion màng: Không đủ cung cấp năng lượng mức độ tế bào dẫn đến mất chức năng gradient ion màng gây mất kali trong trao đổi ion với natri, ion clorua và ion canxi, kéo theo nước làm phù nhanh chóng các tế bào thần kinh và

tế bào thần kinh đệm (độc tế bào phù nề)

- Giải phóng dẫn truyền thần kinh kích thích: Glutamate, Synaptosomal liên kết protein 25 (SNAP-25) gây độc

- Sản xuất các gốc tự do và các phản ứng kiểu oxy hóa khử: Gây phá hủy một cơ

số các tế bào và phạm vi ngoài tế bào, trong đó đặc biệt quan trọng là nội mạc mạch máu

- Chết tế bào theo chu trình (Apoptosis): Ngược lại với hoại tử gây chết tế bào trong vùng lõi thiếu máu cục bộ, thì nó xảy ra ở tế bào thần kinh ngoại vi

- Cơ chế bảo vệ thần kinh: Như một hệ thống bảo vệ chống lại chết tế bào theo chu trình và hoại tử tế bào

Cần hiểu biết về các cơ chế này để cứu vãn mô não bị tổn thương do thiếu máu cục bộ Thuốc bảo vệ thần kinh có tác dụng ngăn chặn phản ứng oxy hóa khử, ức chế chết tế bào theo chu trình, hoặc ức chế độc do dẫn truyền thần kinh có thể giúp đạt được mục tiêu này [16]

1.2.1.2 Khái niệm về vùng nửa tối trong thiếu máu não cục bộ

Ở tổn thương thiếu máu cục bộ não có 2 vùng:

- Vùng trung tâm, lưu lượng máu rất thấp 10-12 ml/100g não/phút, các tế bào sẽ chết, gọi là “vùng hoại tử”, khó có khả năng điều trị

- Vùng chu vi giảm lưu lượng máu não dưới 18-20 ml/100g não/phút có khả năng chết trong vòng vài giờ, gọi là “vùng nửa tối” Tế bào thần kinh trong vùng nửa tối chủ yếu là rối loạn chức năng, nhưng có thể phục hồi nếu được tái tưới máu hoặc tự phát hoặc được điều trị kịp thời Sự sống còn của vùng nửa tối là yếu tố

do

- Phù vận mạch: Do hàng rào máu não bị phá vỡ Xảy ra vài giờ đến vài ngày và không thể đảo ngược Nó được đặc trưng bởi tăng tính thấm mao mạch làm cho nước và các phần tử tan trong nước vào não dễ dàng gây tăng áp lực nội sọ [16]

1.2.1.4 Ảnh hưởng của thiếu máu cục bộ trên toàn vẹn cấu trúc của não

- Ngoài các ảnh hưởng có hại trên các tế bào não, thiếu oxy cũng gây ra mất tính toàn vẹn cấu trúc của mô não và mạch máu, một phần thông qua việc sản xuất các protease Mất tính toàn vẹn mạch máu là kết quả của thất bại trong bảo vệ hàng rào máu - não, biểu hiện như phù não và cùng với sự tiến triển thứ cấp của chấn thương não

- Tái cấu trúc mạch: Mức độ hình thành trong vùng nửa tối tương quan với thời gian sống sót của bệnh nhân

- Xu hướng hoạt hóa miễn dịch cơ chế: Trong một số trường hợp có thể là nguyên nhân gây xấu đi tình trạng của bệnh nhân Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy sự ức chế quá trình viêm kiểm soát mức độ tổn thương là một khía cạnh quan trọng trong sự hiểu biết và quản lý đột quỵ [16]

1.2.2 Mô hình đột quỵ thiếu máu não cục bộ

Để hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh sinh của bệnh đột quỵ thiếu máu não cục bộ cũng như là để tìm ra các phương pháp điều trị mới cho thể đột quỵ này, các mô hình

thực nghiệm của căn bệnh này trở thành một công cụ không thể thiếu

9

Có hai loại thiếu máu não là thiếu máu não toàn thể (global ischemia) và thiếu máu não cục bộ (focal ischemia) Thiếu máu não toàn thể là trạng thái hầu hết hoặc toàn bộ não giảm lưu lượng máu về 0 ml/g/min, chỉ vài phút của thiếu máu não toàn thể có thể gây tổn thương không hồi phục được Thiếu máu não cục bộ chỉ gây giảm lưu lượng máu và trong khu vực một động mạch não và nhánh của nó [17], [37] Dưới đây là liệt kê một số mô hình của thiếu máu não [17]:

Hình 1.1 Mô hình thiếu máu não Thuyên tắc động mạch não giữa (MCAO) - Mô hình intraluminal suture

Do đa số các trường hợp đột quỵ thiếu máu não (xấp xỉ 80%) xảy ra tại vùng não được cung cấp động mạch não giữa (middle cerebral artery - MCA) nên có rất nhiều

mô hình đột quỵ được nghiên cứu phát triển tập trung vào động mạch này

Gây tắc động mạch não giữa sử dụng kỹ thuật intraluminal suture là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu về đột quỵ Đây là phương pháp gây tắc động mạch não giữa bằng cách đưa sợi dây phẫu thuật từ động mạch cảnh ngoài (external carotid artery - ECA) và đi qua động mạch cảnh trong (internal

Ưu điểm của kỹ thuật này là tạo ra tổn thương lặp lại, mô phỏng được cả thiếu máu cục bộ tạm thời và vĩnh viễn, tái tưới máu được vị trí thương tổn, can thiệp nhanh, thích hợp cho nghiên cứu dài hạn sau khi gây thiếu máu não, không đòi hỏi phải phẫu thuật xâm lấn sọ não điều có thể ảnh hưởng đến áp suất và nhiệt độ trong

sọ Tuy nhiên, nhược điểm là có tỉ lệ tử vong cao do thiếu máu nghiêm trọng [15], [17]

Đây cũng là mô hình được lựa chọn trong nghiên cứu này của chúng tôi để gây thuyên tắc động mạch não giữa và trên mô hình đó tiến hành các thử nghiệm hành

vi và mô học đánh giá tác dụng phòng chống đột quỵ của quả dành dành

1.2.3 Thuốc điều trị

1.2.3.1 Thrombolysis (Activase)

Cho đến nay, tPA (human tissue-type plasminogen activator) là liệu pháp duy nhất được FDA phê chuẩn trong điều trị đột quỵ nhồi máu não với khả năng làm tan cục máu đông và phục hồi sự tưới máu đến vùng não bị thiếu máu [32]

Tuy nhiên, tPA chỉ có giới hạn phạm vi tác dụng trong vòng 3 giờ được phê chuẩn bởi FDA Hoa Kỳ [39] và 4,5 giờ ở các nước Châu Âu và một số nước khác tính từ thời điểm bắt đầu bị đột quỵ

Việc sử dụng các thuốc này cũng mang đến nguy cơ tử vong do xuất huyết não [32], [39]

1.2.3.2 Edaravon

Edaravon (3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one) là một chất dọn dẹp các gốc hydroxyl và oxit nitric cực mạnh, làm giảm tổn thương thần kinh sau đột quỵ thiếu

11

máu cục bộ, ngăn ngừa chết tế bào theo chu trình [41], chống lại stress oxi hóa và làm giảm phản ứng viêm gây bởi các phản ứng oxy hóa khử Không giống như những chất dọn dẹp các gốc tự do khác, Edaravon có thể dễ dàng vượt qua hàng rào máu – não [25]

Tuy nhiên Edaravon với biệt dược là Radicut hiện mới chỉ nhận được sự chấp thuận điều trị trên lâm sàng tại Nhật Bản từ năm 2001 [25] và vẫn chưa được FDA phê duyệt

1.2.3.3 Bài thuốc Tongluo Jiunao

Bài thuốc từ thảo dược Trung Quốc Tongluo Jiunao, có chứa các hoạt chất từ tam

thất (Panax notoginseng) và dành dành (Gardenia jasminoides Ellis), gần đây đã

được đăng ký phát minh và được sử dụng trên lâm sàng với tác dụng bảo vệ thần kinh trong trường hợp bị thiếu máu não cục bộ [11]

Tuy cơ chế tác dụng của bài thuốc này còn chưa được hiểu rõ hết, nhưng nó góp phần khẳng định vai trò to lớn của dược thảo trong phòng chống đột quỵ não

1.3 Tổng quan về quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis)

Tên khoa học: Gardenia jasminoides Ellis

Tên thường gọi: Chi tử, thủy hoàng chi, mác làng cương (Tày) [10]

Tên nước ngoài: Cape jasmine (Anh) [10]

Hình 1.2 Quả dành dành

(Gardenia jasminoides Ellis)

12

1.3.2 Mô tả cây dành dành

Cây nhỏ thường xanh tốt quanh năm, cao 1 – 2 m, phân nhánh nhiều Cành màu nâu, nhẵn, có khía rãnh dọc Lá mọc đối hay mọc vòng 3, dày, hình khuôn trái xoan, gốc thót lại, đầu tù hoặc hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm đến nâu đen, nhẵn bóng, mặt dưới rất nhạt và có gân nổi rõ; cuống lá rất ngắn; lá kèm to, nhọn, bao quanh thân và cành

Hoa to, mọc đơn độc ở đầu cành, màu trắng hoặc trắng ngà, rất thơm, cuống hoa

có 6 cạnh; đài gồm 6 thùy, thuôn nhọn đầu, ống đài có 6 cánh dọc; tràng có 6 cánh, tròn ở đầu, ống tràng nhẵn; nhị 6, chỉ nhị ngắn, bao phấn tù; bầu 2 ô, noãn rất nhiều Quả hình trứng [10], hình bầu dục [5], hình chén với 6-9 góc, có 2-5 ngăn [7] có đài tồn tại ở đỉnh và cạnh lồi có cánh, khi chín màu vàng, thịt quả màu vàng cam; hạt rất nhiều, dẹt; mùi thơm, vị đắng

Mùa hoa: tháng 3-5; mùa quả: tháng 8-10 [5], [7], [10]

1.3.3 Phân bố, sinh thái

Chi Gardenia Ellis có khoảng 270 loài trên thế giới, phân bố rộng rãi ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á và châu Phi Ở Việt Nam có 21 loài

Dành dành là cây có nguồn gốc ở Trung Quốc và Nhật Bản Ở Việt Nam, cây phân bố phổ biến khắp các tỉnh đồng bằng và trung du nhưng tập trung tại các tỉnh Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An và Hà Tĩnh Dành dành là cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể chịu bóng; thường mọc ở đất ẩm, gần nguồn nước như bờ ao, bờ kênh rạch, hay bờ suối thành bụi lớn, đôi khi gốc ngập chìm trong nước Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng tái sinh sau khi bị chặt

Nguồn dành dành ở Việt Nam tương đối phong phú Lượng dược liệu khai thác hàng năm từ 30 đến 40 tấn Ở Hải Dương và Hưng Yên, nhân dân thường trồng dành dành ở bờ ao, vừa có tác dụng chống sạt lở, vừa thu được quả [1]

13

1.3.4 Thu hái, chế biến, bảo quản bộ phận dùng quả dành dành

Quả, thu hái chín già vào tháng 8 – 10 ngắt bỏ cuống phơi hay sấy nhẹ đến khô Theo Dược điển đông y Trung Quốc năm 1963, quả phải nhúng nước sôi hoặc đêm

đồ chừng nửa giờ, rồi mới lấy ra phơi khô

Dành dành dễ hút ẩm và dễ bị mốc, mọt, cần để dược liệu ở nơi khô ráo [1]

1.3.5 Thành phần hóa học của quả dành dành

- Các acid hữu cơ: Acid picrocinic, acid dicafeoyl – 5- (3- hydroxy – 3- methyl glutaroyl) quinic, acid 3 – cafeoyl – 4 – sinapoyl quinic [1], [10]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của sắc tố gạch trong quả dành dành

- Pectin, clorogenin, tanin, dầu béo (14 - 18%), manitol, β-sitosterol [5], [7], [10]

- Các iridoid glycoside: acid geniposidic, geniposid, 10 - acetyl geniposid, genipingentibiosid, gardosid, sansisid, methyl este của scandosid, methyl este của diacetyl-asperulosid, gardenosid [10], [24], [26]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của một số chất iridoid glycoside

Trong một nghiên cứu về 32 mẫu quả dành dành thu hái ở 6 tỉnh của Trung Quốc, sau khi phân lập riêng geniposid và định lượng bằng HPLC, kết quả thu được hàm lượng geniposid thu được rất khác nhau, trong đó hàm lượng thấp nhất là 14,845 ± 0,321 mg geniposid/g quả dành dành và hàm lượng cao nhất là 56,743 ± 0,789 mg geniposid/g quả dành dành [42]

1.3.6 Tác dụng dược lý

1.3.6.1 Tác dụng lợi mật

- Toji Miwa đã tiến hành thắt đường ống dẫn mật chung của thỏ 1 giờ sau,

crocin liều 0,1 g/kg trọng lượng cơ thể hoặc natri crocetin liều 0,01 g/kg trọng

lượng cơ thể pha trong 5 ml dung dịch muối sinh lý được tiêm vào tĩnh mạch tai và

đo lượng bilirubin trong máu, thu được kết quả crocin và natri crocetin ngăn chặn

sự xuất hiện của bilirubin trong máu ở thỏ bị thắt đường ống dẫn mật chung [31]

- Geniposidic làm tăng bài tiết mật trong tá tràng ở những con chuột nhiễm độc

gan do ứ mật trong gan gây bởi α – naphthy – lisothiocyanate [21]

1.3.6.2 Tác dụng chống viêm

Mô hình gây viêm cấp tính bằng túi khí được tiêm carrageenan là một mô hình

tuyệt vời Người ta đã chứng minh điều trị với geniposid (0,1 mg/túi), và genipin

(0,1 mg/túi) giảm hình thành dịch viêm gây ra bởi carrageenan [26]

16

1.3.6.4 Tác dụng hạ huyết áp

- Trong nghiên cứu của Saori Higashino và cộng sự, crocetin ức chế tăng huyết

áp tâm thu theo tuần tuổi của chuột cống đột quỵ và tăng huyết áp tự phát đáng kể ở liều 25 và 50 mg/kg/ngày Sự ức chế tăng huyết áp này có thể liên quan đến tác dụng chống oxy hoá của crocetin [22]

- Nước sắc và dịch chiết bằng cồn trên mèo, thỏ, chuột cống trắng có tác dụng hạ huyết áp, còn dịch chiết bằng methanol trên ống kính có tác dụng ức chế hoạt tính của men chuyển hóa angiotensin lấy được từ phổi của thỏ [10]

1.3.6.5 Tác dụng đối kháng với xơ cứng động mạch

Bằng cách cho dùng acid geniposidic dài ngày trên những con thỏ được nuôi với

chế độ ăn giàu cholesterol, Yu Gao và cộng sự đã chứng minh acid geniposidic có thể đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và đối kháng tổn thương mạch máu ở giai đoạn sớm của xơ vữa động mạch bằng cách ức chế sự hình thành tế bào bọt và tăng tế bào cơ trơn động mạch rốn, bảo vệ và thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào nguyên thủy [43]

1.3.6.6 Tác dụng gây tiêu chảy

Các chất gardenoside, geniposid đều có tác dụng gây tiêu chảy, trên chuột nhắt

trắng liều có hiệu lực 50% - ED50 của gardenoside là 300 mg/kg và ED50 của

dạng tỷ lệ phần trăm của toàn bộ mô não Nghiên cứu cho thấy Geniposid tiêm tĩnh

mạch đuôi liều trung bình (30 mg/kg) và liều cao (60 mg/kg) làm giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu não ở chuột tới 32.9% và 47 % so với lô bệnh lý [24]

17

- Haiyan Zhang và cộng sự đã chứng minh dịch chiết của quả dành dành (chứa

27% geniposid và 72% glycosid iridoid) liều cao (150 mg/kg) và trung bình (100

mg/kg) đường uống làm giảm đáng kể chết tế bào theo chu trình của neuron và hoại

tử ở vùng hải mã và vỏ não chuột cống trắng, ức chế hoạt động của Nitric Oxide Synthase; dịch chiết quả dành dành có thể làm giảm đáng kể hoạt động của Acetylcholin Esterase Khi sử dụng mô hình mê cung nước Morris có thể thấy dịch chiết quả dành dành đã có một số cải thiện về suy giảm khả năng học tập và trí nhớ gây ra bởi thiếu máu cục bộ não [20]

- Tiêu bản lát cắt vùng hồi hải mã não chuột cống bị thiếu hụt oxy và glucose khi

tiếp xúc với geniposid cho thấy sự cải thiện chết tế bào thần kinh của cả vùng kim

tự tháp và lớp tế bào hạt [29]

- Geniposid cũng đã được chứng minh có tác dụng chống chết tế bào theo chu

trình gây bởi sự giảm oxy huyết trên dòng tế bào H9c2 [23]

Liều dùng: Ngày 6 – 12 g dưới dạng thuốc sắc

Sắc tố của quả dành dành chín không độc, dùng để nhuộm vàng thức ăn như bánh xu xê [10]

Chú ý: bệnh nhân tỳ hư, tiểu đường không dùng dành dành [1]

18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Quả dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) được mua trên thị trường ở Bắc

Ninh, được giám định bởi khoa Tài nguyên – Viện Dược liệu

Quy trình chuẩn bị cao chiết quả dành dành như sau:

100g quả dành dành khô (độ ẩm 5%) được xay nhỏ và cho vào bình cầu 2 lít Chiết nóng hồi lưu 3 lần ở nhiệt độ 95oC, sử dụng dung môi EtOH 50% (Lần 1: 700ml EtOH 50% trong 2 giờ; Lần 2: 500ml EtOH 50% trong 1,5 giờ; Lần 3: 500ml EtOH 50% trong 1 giờ), lọc dịch chiết sau mỗi lần Sau đó dịch chiết được gộp lại bốc hơi dung môi qua đêm trên nồi đun cách thủy đến cắn Cao chiết được sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 50˚C đến khối lượng không đổi, thu được cao chiết khô dùng làm mẫu thử cho nghiên cứu hóa học và dược lý (m = 32,43 g)

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss Albino, giống đực, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng 18 –

20 g, khỏe mạnh được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương Chuột sau khi mua về được nuôi 7 ngày trong phòng chăn nuôi trong điều kiện nhiệt độ duy trì

25 ± 1oC, độ ẩm không khí và ánh sáng thích hợp Chuột được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp Chuột được ăn và uống nước tự do theo nhu cầu

2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị

2.1.3.1 Hóa chất:

3 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Nhật Bản

4 Geniposid chuẩn độ tinh khiết 99,2% Trung Quốc

5 Dung môi chạy HPLC đảm bảo tiêu chuẩn Hàn Quốc

8 Và các hóa chất khác

2.1.3.2 Trang thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu – Nhật Bản gồm bơm

LC – 20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL – 20 AHT, detector UV – VIS, phần mềm Labsolution để truy suất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC

- Cân phân tích Precisab XT 220A, độ chính xác 0,0001 g

- Máy rung siêu âm Power Sonic 405

- Bộ dụng cụ phẫu thuật:

+ Bông tiệt trùng, cồn 96o, dung dịch Betadine sát khuẩn

+ Kim, chỉ khâu vết thương

+ Kéo, 1 panh to, 2 panh nhỏ, 2 kẹp thẳng đầu nhọn, kẹp mạch máu – Đức+ Chỉ lụa cỡ 4-0 và 5-0 – Nhật Bản

+ Kim chuyên dụng kích thước 0,23 x 4 mm

+ Sợi chỉ monofilament cỡ 6-0 được bọc đầu silicon kích thước 0,24-0,26 mm

- Thiết bị ủ ấm thân nhiệt chuột 37oC

- Bộ dụng cụ làm tiêu bản lát cắt não chuột: kéo to, kẹp nhọn to, kẹp đầu tròn, khuôn cắt não chuyên dụng có các rãnh cách nhau 1 mm, dao lam

- Tủ giữ ấm 37oC

20

Hình 2.1 Sợi monofilament có đầu silicon gây tắc mạch

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Định lượng geniposid trong cao chiết EtOH quả dành dành bằng phương pháp HPLC

2.2.1.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc phương pháp HPLC

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu

tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2]

HPLC có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và yêu cầu của công việc Trong khóa luận này kỹ thuật HPLC được sử dụng để định lượng geniposid trong quả dành dành là sắc ký phân

bố pha liên kết – pha đảo [2]

Nguyên tắc định lượng bằng HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng

độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Chiều cao pic dễ đo tuy

21

nhiên chỉ dùng được khi pic hẹp cân đối Diện tích pic được dùng phổ biến và đảm bảo cho kết quả tin cậy

Có 3 phương pháp hay được sử dụng là:

- Phương pháp chuẩn ngoại (đường chuẩn)

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong khóa luận này để định lượng geniposid trong cao chiết EtOH quả dành dành chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử [4]

2.2.1.2 Quy trình định lượng

Chuẩn bị mẫu:

Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau:

- Pha dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 12,5 mg geniposid chuẩn cho vào bình định mức 25 ml, định mức tới vạch bằng MeOH Siêu âm 5 phút Nồng độ dung dịch chuẩn gốc là: