Định lượng geniposid và đánh giá tác dụng chống đột quỵ não của cao chiết quả dành dành ( gardenia jasminoides ellis)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TỐNG THANH HUYỀN MSV: 1201262 ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG ĐỘT QUỴ NÃO CỦA CAO CHIẾT QUẢ DÀNH DÀNH (GARDENIA JASMINOIDES ELLIS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI =====*o0o*o0o*o0o*===== TỐNG THANH HUYỀN MSV: 1201262 ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG ĐỘT QUỴ NÃO CỦA CAO CHIẾT QUẢ DÀNH DÀNH (GARDENIA JASMINOIDES ELLIS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Phạm Thái Hà Văn TS Phạm Thị Nguyệt Hằng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền Viện Dược liệu HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập rèn luyện giảng đường Đại học Dược Hà Nội, em nhận nhiều giúp đỡ từ thầy cô, gia đình bạn bè Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người hướng dẫn trực tiếp đề tài khóa luận cho em: ThS Phạm Thái Hà Văn – Bộ môn Dược học cổ truyền - thầy tạo điều kiện tối đa cho em làm khóa luận Viện Dược Liệu đóng góp ý kiến quý báu cho em hoàn thành khóa luận TS Phạm Thị Nguyệt Hằng – Khoa Dược lý, sinh hóa Viện Dược Liệu - cô nhiệt tình bảo tạo điều kiện tối đa cho em trực tiếp tham gia thực thử nghiệm dược lý TS Hà Vân Oanh – Bộ môn Dược học cổ truyền - cô hết lòng giúp đỡ em từ lúc bắt đầu tới lúc gặp khó khăn làm khóa luận TS Lê Thị Xoan – Khoa Dược lý, sinh hóa Viện dược liệu – chị giúp đỡ em thử nghiệm dược lý, cho em kinh nghiệm quý báu người trước để thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán Khoa Dược lý, sinh hóa Khoa Hóa thực vật I - Viện Dược liệu nhiệt tình giúp đỡ, bảo cho em lời động viên, khích lệ để em có thêm động lực hoàn thành khóa luận Em chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội trang bị cho em kiến thức quý báu tạo điều kiện học tập tốt cho em cho em năm học qua Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ động viên em học tập sống Hà nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Sinh viên, Tống Thanh Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………… ……………………………………… … CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đột quỵ não 1.1.1 Khái niệm đột quỵ 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Các yếu tố nguy 1.1.4 Cơ sở giải phẫu – sinh lý tuần hoàn não 1.2 Đột quỵ thiếu máu não cục 1.2.1 Sinh lý bệnh đột quỵ thiếu máu cục 1.2.2 Mô hình đột quỵ thiếu máu não cục 1.2.3 Thuốc điều trị 10 1.3 Tổng quan dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) 11 1.3.1 Vị trí phân loại 11 1.3.2 Mô tả dành dành 12 1.3.3 Phân bố, sinh thái 12 1.3.4 Thu hái, chế biến, bảo quản phận dùng dành dành 13 1.3.5 Thành phần hóa học dành dành 13 1.3.6 Tác dụng dược lý 15 1.3.7 Tính vị, công 17 1.3.8 Công dụng 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên liệu 18 2.1.2 Động vật thí nghiệm 18 2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Định lượng geniposid cao chiết EtOH dành dành phương pháp HPLC 20 2.2.2 Đánh giá tác dụng dược lý 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 30 3.1 Định lượng geniposid cao chiết EtOH dành dành 30 3.1.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử 30 3.1.2 Kết định lượng geniposid mẫu chuẩn 31 3.1.3 Kết định lượng geniposid cao chiết EtOH dành dành 32 3.2 Đánh giá tác dụng chống đột quỵ não cao chiết EtOH 50% dành dành 34 3.2.1 Tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh cao chiết dành dành chuột phẫu thuật MCAO 34 3.2.2 Xác định mức độ nhồi máu não chuột phương pháp nhuộm 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) 37 BÀN LUẬN……………………………………………………………………… 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………47 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CCA Common carotid artery (Động mạch cảnh chung) ECA External carotid artery (Động mạch cảnh ngoài) ICA Internal carotid artery (Động mạch cảnh trong) MCA Middle cerebral artery (Động mạch não giữa) DD250 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 250 mg/kg (Liều thấp) DD500 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 500 mg/kg (Liều trung bình) DD1000 Lô chuột MCAO xử lý với mẫu thử liều 1000 mg/kg (Liều cao) FDA Food and Drug Administration ED50 Liều có hiệu (effective dose) 50% số vật thí nghiệm EtOH Ethanol MeOH Methanol HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) i.v Đường tiêm tĩnh mạch p.o Đường uống MCAO Middle cerebral artery occlusion (Thuyên tắc động mạch não giữa) tpA Human tissue-type plasminogen activator TTC 2,3,5 - triphenyltetrazolium chloride v/v Thể tích/thể tích i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng đề tài 19 Bảng 2.2 Các lô chuột tiến hành thử tác dụng dược lý 25 Bảng 3.1 Kết phụ thuộc diện tích pic nồng độ geniposid 31 Bảng 3.2 Kết định lượng geniposid cao 33 Bảng 3.3 Điểm đánh giá tổn thương thần kinh 35 Bảng 3.4 Tỷ lệ % nhồi máu não chuột 37 ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Mô hình thiếu máu não Hình 1.2 Quả dành dành 11 Hình 1.3 Công thức cấu tạo sắc tố gạch dành dành 13 Hình 1.4 Công thức cấu tạo số chất iridoid glycoside 14 Hình 2.1 Sợi monofilament có đầu silicon gây tắc mạch 20 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng dược lý cao chiết EtOH dành dành 23 Hình 2.3 Quy trình phẫu thuật MCAO chuột 27 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu chuẩn geniposid 30 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử 30 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính tín hiệu đáp ứng (diện tích pic) nồng độ mẫu chuẩn geniposid 32 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn điểm tổn thương thần kinh ngày 36 Hình 3.5 Hình ảnh đặc trưng lát cắt não nhóm chuột nghiên cứu nhuộm TTC Vùng màu trắng vùng nhồi máu não 38 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % nhồi máu não chuột 38 iii ĐẶT VẤN ĐỀ Đột quỵ (stroke) hay tai biến mạch máu não (cerebrovascular accident) nguyên nhân gây tử vong đứng thứ top 10 nguyên nhân gây tử vong toàn cầu sau nhồi máu tim theo số liệu thống kê năm 2015 Tổ chức Y tế giới (WHO) [40], nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu người trưởng thành [38] chiếm khoảng - 4% tổng chi phí chăm sóc y tế toàn giới [18] Đột quỵ gồm thể: thiếu máu cục não (ischaemic stroke) hay thuật ngữ lâm sàng nhồi máu não (infarction) thể thứ hai xuất huyết não (haemorragic stroke) Tại Mỹ, 40 giây lại có trường hợp đột quỵ não cấp phút lại có trường hợp tử vong đột quỵ não cấp Mỗi năm, 795.000 người Mỹ có đột quỵ, khoảng 610.000 số mắc lần đầu mắc Đột quỵ nguyên nhân hàng đầu gây tàn tật, đột quỵ làm giảm khả vận động nửa số người sống sót sau đột quỵ độ tuổi 65 và 65 Khoảng 87% ca đột quỵ đột quỵ thiếu máu não (lưu lượng máu đến não bị tắc nghẽn) Chi phí cho điều trị đột quỵ Mỹ 33 tỷ đô la năm, bao gồm chi phí dịch vụ chăm sóc sức khỏe, thuốc điều trị, số ngày nghỉ việc [14] Tuy nhiên, liệu pháp điều trị đột quỵ não hạn chế chưa tối ưu Hiện nay, tPA (human tissue - type plasminogen activator) liệu pháp FDA phê chuẩn điều trị đột quỵ nhồi máu não với khả làm tan cục máu đông phục hồi tưới máu đến vùng não bị thiếu máu Tuy nhiên, tPA có giới hạn phạm vi tác dụng vòng 4,5 tính từ thời điểm bắt đầu bị đột quỵ việc sử dụng thuốc mang đến nguy tử vong xuất huyết não [39] Do đó, xu hướng nghiên cứu, phát triển thuốc có khả chống đột quỵ não từ dược liệu an toàn rủi ro hướng có triển vọng với nhà nghiên cứu Quả dành dành, có tên khoa học Gardenia jasminoides Ellis loại dược liệu trồng phổ biến tỉnh đồng trung du nước ta Trên giới có nhiều nghiên cứu cho thấy dành dành có chứa geniposid, thành phần chứng minh có tác dụng chống chết tế bào theo chu trình (apoptosis), giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu não, chết tế bào thần kinh cải thiện trí nhớ chuột thiếu máu não cục Đặc biệt, thuốc Tongluo Jiunao, có chứa chủ yếu hoạt chất chiết từ dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) tam thất (Panax notoginseng) gần đăng ký phát minh sử dụng lâm sàng với tác dụng bảo vệ thần kinh trường hợp bị thiếu máu não cục [11] Tuy nhiên, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống đột quỵ dành dành Vì vậy, đề tài “Định lượng geniposid đánh giá tác dụng chống đột quỵ não cao chiết dành dành (Gardenia jasminoides Ellis)” thực với mục tiêu sau: Định lượng thành phần geniposid cao chiết cồn dành dành phương pháp HPLC Đánh giá tác dụng bảo vệ thần kinh theo hướng chống đột quỵ cao chiết cồn dành dành mô hình chuột gây tắc động mạch não - Lô DD500 (Chuột MCAO xử lý với cao dành dành liều 500 mg/kg (p.o)) có điểm tổn thương thần kinh thấp lô bệnh lý vào ngày (P5-2 = 0,019) ngày (P5-2 = 0,026), khác biệt lô có ý nghĩa thống kê - Lô DD1000 (Chuột MCAO xử lý với cao dành dành liều 1000 mg/kg (p.o)) có điểm tổn thương thần kinh thấp lô bệnh lý vào ngày (P6-2 = 0,038), khác biệt lô có ý nghĩa thống kê 3.2.2 Xác định mức độ nhồi máu não chuột phương pháp nhuộm 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sau ngày gây đột quỵ phương pháp MCAO, thể tích nhồi máu não xác định phương pháp nhuộn TTC Kết đo thể tích nhồi máu não trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn bảng 3.4: Bảng 3.4 Tỷ lệ % nhồi máu não chuột Lô Tỷ lệ % nhồi máu não chuột Sinh lý (n = 6) 0,00% Bệnh lý (n = 8) 41,02% ± 5,78% (###) Chứng dương (n = 7) 18,21% ± 7,63% (*) DD 250 (n = 6) 34,96% ± 7,54% DD 500 (n = 8) 27,48% ± 7,20% DD 1000 (n = 6) 39,14% ± 8,38% ### P ≤ 0,001 so sánh với lô chứng sinh lý * P ≤ 0,05 so sánh với lô chứng bệnh lý 37 Hình 3.5 Hình ảnh đặc trưng lát cắt não nhóm chuột nghiên cứu nhuộm TTC Vùng màu trắng vùng nhồi máu não Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ % nhồi máu não chuột Đồ thị biểu diễn dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn với ### p ≤ 0,001 so sánh với lô chứng sinh lý, * p ≤ 0,05 so sánh với lô chứng bệnh lý không điều trị 38 Nhận xét: Kết hình cho thấy, chuột gây đột quỵ phương pháp làm tắc MCA sau ngày tích nhồi máu não lên đến 40% thể tích bán cầu não - Lô chứng sinh lý không cho thấy thương tổn nhuộm phương pháp TTC - Lô chứng dương Edaravon cho thấy tác dụng làm giảm rõ rệt thể tích nhồi máu não so với lô chứng bệnh lý mô hình (P3-2 = 0,037) - Cả lô DD250, DD500, DD1000 cho kết tỷ lệ % nhồi máu não chuột khác biệt ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p > 0,05) Nhận thấy cao chiết dành dành liều 250 mg/kg, 500 mg/kg 1000mg/kg (p.o) chưa thể tác dụng giảm tỉ lệ % nhồi máu não chuột sau ngày phẫu thuật MCAO 39 BÀN LUẬN Xác định geniposid cao chiết dành dành phương pháp HPLC Kết cho thấy có mặt geniposid cao chiết EtOH dành dành Các lần định lượng HPLC khác dung dịch thử chuẩn bị từ cao chiết dành dành, hàm lượng geniposid mẫu thử quy trình xử lý mẫu điều kiện sắc ký có độ lặp lại tốt (RSD < 2%) Từ cho thấy hệ thống HPLC ổn định, có độ xác cao cho kết đáng tin cậy tiến hành phân tích hàm lượng geniposid cao chiết dành dành Hàm lượng geniposid cao chiết EtOH dành dành sử dụng để đánh giá tác dụng dược lý chống đột quỵ chuột thực nghiệm 11,79% Geniposid biết đến chất cao chiết dành dành có tác dụng chống chết tế bào theo chu trình, hoại tử vùng hải mã vỏ não, giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu não chuột, ức chế hoạt động Nitric Oxide Synthase, giảm đáng kể hoạt động Acetylcholin Esterase [20], [21], [24] Chính vậy, kết phần trăm Geniposid cao chiết dành dành sử dụng để tính liều cho phần nghiên cứu tác dụng dược lý Đánh giá tác dụng chống đột quỵ não cao chiết dành dành (Gardenia jasminoides Ellis) Mô hình thuyên tắc động mạch não (MCAO) - Mô hình intraluminal suture Hiện giới có nhiều mô hình sử dụng để nghiên cứu thuốc có tác dụng chống đột quỵ não Trong phải kể tới mô hình thuyên tắc động mạch não MCAO - intraluminal suture MCAO - intraluminal suture lần thực Koizumi cộng vào năm 1986 chuột cống Nhóm Koizumi sử dụng sợi 40 phẫu thuật nylon, kích cỡ 4-0 có đầu phủ silicon (đường kính 0,25-0,30 mm) cho tỷ lệ đạt nhồi máu thành công 93% [17] Như trình bày phần tổng quan, mô hình MCAO có ưu điểm gây thiếu máu cục vĩnh viễn thoáng qua vùng não cung cấp máu MCA Sợi monofilament đưa vào gốc MCA làm cản trở dòng máu cung cấp vào động mạch Có thể chủ động gây mô hình thiếu máu não tạm thời vĩnh viễn rút sợi monofilament khỏi mạch máu cách chủ động 60 phút tắc nghẽn động mạch não gây tổn thương có tính lặp lại vùng thể vân tân vỏ não [34] Làm thông mạch cách bỏ sợi monofilament mô trạng thái phục hồi mạch máu não tự nhiên điều trị người Mô hình sử dụng rộng rãi phòng thí nghiệm thần kinh giới để đánh giá tác dụng thuốc hay liệu pháp điều trị thiếu máu não cục đột quỵ não thiếu máu não cục [24], [28] Tuy nhiên Việt Nam mô hình chưa nghiên cứu triển khai nhiều để đánh giá tác dụng thuốc, dược liệu có tiềm điều trị đột quỵ não Theo hiểu biết chúng tôi, mô hình MCAO chuột nhắt trắng triển khai nước ta lần Viện dược liệu Các nghiên cứu thử tác dụng theo hướng chống đột quỵ não dược liệu khác trước thực phương pháp MCAO Viện dược liệu cho tỷ lệ sống sót chuột khoảng 80% làm tắc MCA 60 phút cho kết nhuộm TTC sau 24h, vùng nhồi máu não chiếm khoảng 40% thể tích bán cầu [28] Vì phương pháp phù hợp để đánh giá tác dụng chống đột quỵ với tỷ lệ sống sót cao kinh nghiệm triển khai mô hình tính sẵn có Viện dược liệu nên tiếp tục sử dụng mô hình MCAO - intraluminal suture nghiên cứu tác dụng chống đột quỵ dành dành 41 Tuy nhiên trình triển khai mô hình nhận thấy mô hình có số nhược điểm sau: - Tỷ lệ tử vong chuột lần thực nghiệm cao Nguyên nhân gây tử vong chuột là: (1) Kỹ thuật không áp dụng cho động vật tỉnh táo, phải sử dụng thuốc gây mê Pentobarbital Natri, gây tai biến chết chuột liều thuốc mê (2) Chuột bị xuất huyết nhện đứt mạch máu ICA nội sọ [17] với tỷ lệ 12% [19] Thực tế, sử dụng dây có kích cỡ 0,27 mm, chuột có tỷ lệ tử vong lớn chuột sống sót tích nhồi máu cao đột biến so với chuột MCAO khác Mặc dù, sử dụng sợi đầu silicon, giảm tỷ lệ xuất huyết nhện so với dùng sợi dây có đầu đốt - Khả lặp lại nhồi máu bị ảnh hưởng yếu tố khác Chẳng hạn kích thước đầu silicon gây tắc động mạch não [17], định chuột bị tổn thương não nặng kích thước lớn hay không bị tổn thương não kích thước nhỏ Đầu silicon sử dụng làm thủ công kích thước không đồng đều; thêm vào đó, mạch máu chuột khác nên biết kích thước đầu silicon tối ưu để gây tắc động mạch não chuột Chứng dương Edaravon Edaravon, chất có hoạt tính dọn dẹp gốc tự mạnh, chấp nhận sử dụng Nhật Bản nhiều trị đột quỵ tắc mạch máu não cấp tính thử nghiệm lâm sàng nhiều quốc gia khác [25] Trong nghiên cứu năm 2016 tác dụng bảo vệ thần kinh Tam thất chống lại tổn thương thiếu máu não cục chuột nhắt trắng, TS Lê Thị Xoan cộng sử dụng nhóm chứng dương Edaravon thu kết tốt tác dụng 42 Edaravon chuột gây đột quỵ MCAO [28] Điều khuyến khích tiếp tục sử dụng Edaravon đề tài với vai trò chứng dương để đánh giá mô hình MCAO xây dựng để phần so sánh với tác dụng dược liệu nghiên cứu Tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh Mục đích cuối điều trị đột quỵ cải thiện sức khoẻ thể bệnh nhân thuốc can thiệp cần không bảo vệ mô não thúc đẩy phục hồi, mà cần phục hồi chức toàn diện Điều dẫn đến nhà nghiên cứu đột quỵ đánh giá hành vi thường xuyên nghiên cứu họ, làm cho trở thành khía cạnh quan trọng nghiên cứu đột quỵ [17] Đánh giá tổn thương thần kinh tiến hành theo phương pháp Menzies cộng (1992) Chuột bị tổn thương não trái ảnh hưởng đến thần kinh não trái có biểu vận động nửa người đối bên (bên phải) bất thường Tổn thương thần kinh não trái nghiêm trọng biểu liệt nửa người bên phải thể rõ tương đương với điểm tổn thương thần kinh chuột lớn Chúng thực đánh giá tổn thương thần kinh vòng ngày sau phẫu thuật MCAO Khoảng thời gian giúp cho đánh giá cách toàn diện thay đổi điểm tổn thương thần kinh chuột thấy chuyển biến tích cực lô thuốc Từ kết đánh giá tổn thương thần kinh cho thấy: - Lô chứng bệnh lý có điểm tổn thương thần kinh cao so với lô chứng sinh lý (P ≤ 0,001) Kết cho thấy đề tài thành công áp dụng mô hình MCAO - intraluminal suture phương pháp Menzies để đánh giá điểm tổn thương 43 - Lô chứng dương Edaravon có điểm tổn thương thần kinh thấp so với lô chứng bệnh lý vào ngày thứ ngày thứ (P ≤ 0,05) Như Edaravon thể vai trò chứng dương tác dụng giảm tổn thương thần kinh chuột phẫu thuật MCAO - Lô thuốc liều trung bình DD500 có điểm tổn thương thần kinh thấp so với lô chứng bệnh lý vào ngày thứ ngày thứ (P ≤ 0,05) lô thuốc liều cao DD1000 có điểm tổn thương thấp so với lô chứng bệnh lý ngày (P ≤ 0,05) Vậy dịch chiết EtOH 50% dành dành liều trung bình liều cao có vai trò việc cải thiện tổn thương thần kinh chuột phẫu thuật MCAO Theo sinh lý bệnh đột quỵ thiếu máu não cục bộ, chết tế bào theo chu trình (apoptosis) xảy tế bào thần kinh ngoại vi [16], bao gồm tế bào thần kinh vận động Đã có nhiều chứng cao chiết dành dành thành phần geniposid cao chiết có tác dụng ức chế apoptosis [20], [23] Edaravon chứng minh tác dụng [41] Chúng đặt vấn đề liệu có phải tác dụng góp phần vào việc cải thiện điểm tổn thương thần kinh chuột phẫu thuật MCAO Điểm tổn thương thần kinh lô thuốc không cải thiện ngày sau phẫu thuật MCAO mà đến ngày thứ - liều trung bình ngày – liều cao cao chiết dành dành có chuyển biến tích cực Vậy nên đề xuất nghiên cứu tác dụng chống đột quỵ dành dành nên kéo dài thời gian uống thuốc chuột có quan sát dài ngày để có đánh giá toàn diện tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh Xác định mức độ nhồi máu não chuột phương pháp nhuộm 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride (TTC) Muối Tetrazolium 2,3,5 - triphenyltetrazolium chloride (TTC) sử dụng làm thị hóa học enzyme oxy hoá khử ti thể Bằng cách nhận điện tử, TTC chuyển thành chất formazan màu đỏ, tan chất béo, cho thấy có mặt 44 chức ty thể Ngược lại, ty thể bị tổn thương, TTC không biến đổi thành chất màu formazan Dựa tính chất này, TTC trở thành chất điểm thuận tiện để phát tổn thương lát cắt mô Đây phương pháp phổ biến sử dụng nghiên cứu đột quỵ thiếu máu não cục cho kết đáng tin cậy [17] Từ kết tỷ lệ phần trăm nhồi máu não cho thấy: - Lô chứng bệnh lý có tỷ lệ phần trăm nhồi máu não tăng đáng kể so với lô chứng sinh lý tổn thương nhuộm phương pháp TTC Điều lần cho thấy đề tài thành công áp dụng mô hình MCAO intraluminal suture - Lô chứng dương edaravon làm giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu não so với lô chứng bệnh lý, kết phù hợp với kết công bố nghiên cứu trước [28] - Lô thuốc cao chiết EtOH 50% dành dành liều thấp (250 mg/kg), liều trung bình (500 mg/kg) liều cao (1000 mg/kg) chưa thể rõ tác dụng giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu so với nhóm bệnh lý Trong nghiên cứu Jun Wang cộng sự, geniposid chiết xuất từ dành dành dùng liều 30 mg/kg 60 mg/kg thể tác dụng giảm tỷ lệ phần trăm nhồi máu não chuột 24h sau phẫu thuật MCAO Mức liều geniposid tinh chế nghiên cứu gần tương đương với liều geniposid cao chiết cồn dành dành sử dụng liều thấp liều trung bình (với hàm lượng geniposide cao chiết cồn dành dành 11,79%) [24] Tuy nhiên, đường đưa thuốc (i.v) ngày sử dụng thuốc (ngay sau phẫu thuật MCAO) nghiên cứu khác với nghiên cứu Tác dụng phụ thuộc liều liều trần tác dụng dành dành 45 Từ kết đánh giá tổn thương thần kinh cho thấy cao chiết dành dành liều thấp DD250 chưa thể tác dụng thiện tổn thương thần kinh chuột từ ngày 0-6 sau phẫu thuật MCAO Trong liều trung bình DD500 liều cao DD1000 thể tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh khoảng thời gian đánh giá Như tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh chuột bị đột quỵ dành dành có phụ thuộc vào liều Từ kết đo phần trăm nhồi máu não gợi ý phần cao chiết dành dành liều cao DD1000 có mức độ nhồi máu không giảm so với liều trung bình DD500 Khi đánh giá mức độ tổn thương thần kinh, nhận thấy lô DD1000 cải thiện điểm tổn thương thần kinh vào ngày thứ 6, lô DD500 từ ngày thứ Trong trình quan sát, phát lô DD1000 (n = 6) có chuột bị tiêu chảy tác dụng tiêu chảy geniposid gardenosid dành dành ghi nhận [1] Chúng đoán tiêu chảy ảnh hưởng lên khả hồi phục thể trạng chuột Vậy nên, thấy tăng liều cao chiết dành dành đến mức không làm tăng tác dụng chống đột quỵ mà làm tăng tác dụng phụ Đây kết luận bước đầu tác dụng phụ thuộc vào liều liều trần tác dụng dành dành, cần có thêm nghiên cứu sâu nhận định với xác định cụ thể liều trần dành dành 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Trong cao chiết EtOH 50% dành dành có có mặt geniposid với hàm lượng geniposid định lượng theo phương pháp HPLC 11,79% - Cao chiết EtOH dành dành với liều trung bình 500 mg/kg liều cao 1000 mg/kg có tác dụng giảm tổn thương thần kinh chuột phẫu thuật gây đột quỵ thiếu máu não cục phương pháp gây thuyên tắc động mạch não (MCAO) - intraluminal suture Kiến nghị: - Tinh chế Geniposid để thử tác dụng bảo vệ thần kinh theo hướng chống đột quỵ mô hình MCAO so sánh tác dụng với dịch chiết dành dành có hàm lượng Geniposid tương đương - Đây bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống đột quỵ não dành dành, cần tiến hành thêm đề tài để nghiên cứu chế tác dụng dành dành với thời gian sử dụng cao chiết dành dành dài - Thử tác dụng dành dành số mô hình khác: tăng cường trí nhớ, giải lo âu, 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích, tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.168-200 Bộ Y tế (2005), Hướng dẫn điều trị, tập 1, NXB Y học Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, tr.84-104 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Y học, Hà Nội, tr.706-707 Nguyễn Văn Đăng (2006), Tai biến mạch máu não, NXB Y học, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (1996), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.242-244 Mc Phee (2008), Chẩn đoán điều trị y học đại, tập 2, NXB Y học, tr.359 Trường Đại học Y Hà Nội - Bộ môn Sinh lý học (2006), Sinh lý học, tập 1, NXB Y học, Hà Nội, tr.241-245 10 Viện Dược Liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr.303-312 Tài liệu Tiếng Anh 11 Alesheikh P et al (2015), "Chinese herbal formula Tongluo Jiunao injection protects against cerebral ischemia by activating neurotrophin 3/tropomyosinrelated kinase C pathway", Neural regeneration research, 10(3), pp.445-450 12 Bergonzi MC et al (2012), "Identification and quantification of constituents of Gardenia jasminoides Ellis (Zhizi) by HPLC-DAD–ESI–MS", Elsevier, 134, pp.1199-1204 13 Carmona M et al (2006), "Crocetin Esters, Picrocrocin and Its related compounds present in Crocus sativus stigmas and Gardenia jasminoides Fruits Tentative identification of seven new compounds by LC-ESI-MS", Agricultural and food chemistry, 54, pp.973-979 14 Centers for Disease Control and Prevention (2016), Stroke Facts 15 Chiang T, Messing RO, Chou WH (2011), "Mouse model of middle cerebral artery occlusion", JoVE, (48), pp.2761 16 Deb P, Sharma S, Hassan KM (2009), "Pathophysiologic mechanisms of acute ischemic stroke: An overview with emphasis on therapeutic significance beyond thrombolysis", Elsevier, 17(3), 197-218 17 Dirnagl U (2010), Rodent Models of Stroke, vol 47, Neuromethods 18 Donnan GA et al (2008), "Stroke", 317, pp.1612 19 Fluri F, Schuhmann MK, Kleinschnitz C (2015), "Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research", Dovepress, 9, pp.3445-3454 20 Haiyan Zhang et al (2016), "Learning and memory improvement and neuroprotection of Gardenia jasminoides (Fructus gardenia) extract on ischemic brain injury rats", Ethnopharmacology, 196, pp.225–235 21 Hao Chen et al (2016), "Geniposidic acid protected against ANIT- induced hepatotoxity and acute intrahepatic cholestasis, due to Fxr - mediated regulation of Bsep and Mrp2", Ethnopharmacology, 179, pp.197-207 22 Higashino S et al (2014), "Crocetin, a Carotenoid from Gardenia jasminoides Ellis, protects against hypertension and cerebral thrombogenesis in stroke-prone spontaneously hypertensive rats", Phytotherapy research, 28, pp.1315-1319 23 Jiang You-Qin et al (2016), "Geniposide prevents hypoxia/reoxygenationinduced apoptosis in H9C2 cells: improvement of mitochondrial dysfunction and activation of GLP-1R and the PI3K/AKT signaling pathway", Cellular Physiology and Biochemistry, 39, pp.407-421 24 Jun Wang et al (2012), "Geniposide reduces inflammatory responses of oxygen-glucose deprived rat microglial cells via inhibition of the TLR4 signaling pathway", Springer, 37, pp.2235-2248 25 Kiyoshi Kikuchi et al (2011), "Beneficial effects of the free radical scavenger Edaravone (Radicut) in Neurologic diseases", Journal of Neurology & Neurophysiology 26 Koo Hye-Jin et al (2006), "Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin", Ethnopharmacology, 103(3), pp.496-500 27 Kristián T, Siesjö BK (1996), "Calcium - related damage in ischemia", Life Sciences, 59(5/6), pp.357-367 28 Le Thi Xoan et al (2016), "Neuroprotective effect of panax notoginseng against ischemic neuronal injury in mice", Journal of Medicinal Materials, 21(3), pp.169-174 29 Lee P et al (2006), "Geniposide from Gardenia jasminoides attenuates neuronal cell death in oxygen and glucose deprivation-exposed rat hippocampal slice culture", Pharmaceutical Society of Japan, 29(1), pp.174176 30 Menzies SA, Hoff JT, Betz AL (1992), "Middle cerebral artery ocdusion in rats: a neurological and pathological evaiuation of a reproducible model", Neurosurgery, 31, pp.100-107 31 Miwa T (1954), "On the effect of the active principle and extract of fructus gardeniae on the bile secretion of rabbits, blood bilirubin and peripheral lymph bilirubin of common bile-duct ligated rabbits", Jap J Pharmacol, 4, pp.69-81 32 Natalie T Cheng, Anthony S Kim (2015), "Intravenous thrombolysis for acute ischemic stroke within hours versus between and 4.5 hours of symptom onset", 5(3), pp.101–109 33 National institute of health (2017), Types of Stroke, USA 34 Odilo Engel et al (2011), "Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model", JoVE, (47) 35 Sacco RL et al (2013), "An Updated Definition of Stroke for the 21st Century", American Heart Association, 44, pp.2064-2089 36 Takhtajan A (2009), Flowering Plants, Springer Science, pp.516 37 Traystman RJ (2003), "Animal Models of Focal and Global Cerebral Ischemia", ILAR Journal, 44(2), pp.85-95 38 Truelsen T, Begg S Mathers C (2000), The global burden of cerebrovascular disease, Global Burden of Disease 39 U.S Food and Drug Administration (2015), ACTIVASE 40 World Health Organization (2015), The top 10 causes of death 41 Yanwei Li et al (2017), "Edaravone protects against hyperosmolarityinduced oxidative stress and apoptosis in primary human corneal epithelial cells", PLOS 42 Yin F et al (2015), "Quality Control of Gardeniae Fructus by HPLC-PDA Fingerprint Coupled with Chemometric Methods", Chromatographic Science, 53(10), pp.1685-94 43 Yu Gao et al (2014), "Anti-atherosclerotic effect of geniposidic acid in a rabbit model and related cellular mechanisms", Pharmaceutical Biology, 53(2), pp.280-285 ... =====*o0o*o0o*o0o*===== TỐNG THANH HUYỀN MSV: 1201262 ĐỊNH LƯỢNG GENIPOSID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG ĐỘT QUỴ NÃO CỦA CAO CHIẾT QUẢ DÀNH DÀNH (GARDENIA JASMINOIDES ELLIS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... máu não cục [11] Tuy nhiên, nước ta chưa có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng chống đột quỵ dành dành Vì vậy, đề tài Định lượng geniposid đánh giá tác dụng chống đột quỵ não cao chiết. .. Đánh giá tác dụng chống đột quỵ não cao chiết EtOH 50% dành dành 34 3.2.1 Tác dụng cải thiện tổn thương thần kinh cao chiết dành dành chuột phẫu thuật MCAO 34 3.2.2 Xác định