Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng dược lý của cao chiết EtOH hương nhu tía Hình 3.1 Săc ký đồ mẫu chuẩn acid ursolic 630µg/ml 35 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử so sánh vớ
Trang 1BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HÀ THỊ THẢO MSV : 1101469 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID URSOLIC VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG TRÍ NHỚ
CỦA CAO HƯƠNG NHU TÍA
(OCIMUM SANCTUM L.)
TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HÀ THỊ THẢO MSV: 1101469
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ACID URSOLIC VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG TRÍ NHỚ
CỦA CAO HƯƠNG NHU TÍA
(OCIMUM SANCTUM L.) TRÊN
1 Khoa Dược lý-Sinh hóa -Viện Dược liệu
2 Khoa Hóa thực vật 1 -Viện Dược liệu
HÀ NỘI - 2016
Trang 3LỜI CẢM ƠN Trong thời gian nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình, em
đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình từ các tập thể cá nhân
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Lê Thị Xoan - Khoa
Dược lý, sinh hóa - Viện Dược liệu là người thầy, người chị luôn nhiệt tình chỉ
bảo, hướng dẫn cũng như tạo mọi điều kiện cho em được trực tiếp tham gia
thực hiện các thử nghiệm dược lý
Em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Vũ Văn Điền đã tạo điều kiện cho em
tham gia làm khóa luận tại Viện Dược liệu và luôn hết lòng giúp đỡ, đóng góp
những ý kiến quý báu để em hoàn thành khóa luận này
Em chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của TS Nguyễn Văn
Tài, Thạc sĩ Nguyễn Thu Trang - Khoa Hóa thực vật I và các anh chị Khoa
Dược lý, sinh hóa - Viện Dược liệu trong quá trình em thực hiện khóa luận trên
Viện Dược liệu
Em chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cùng toàn thể các thầy
cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho em những kiến thức quý
báu, tạo mọi điều kiện học tập tốt nhất cho em trong suốt 5 năm học qua
Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đã luôn động
viên và giúp đỡ em trong học tập cũng như trong cuộc sống
Mặc dù bản thân đã rất cố gắng trong lần đầu nghiên cứu khoa học nhưng
do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của em không tránh khỏi
những thiếu sót Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các
bạn
Hà Nội, Ngày 05 tháng 05 năm 2016
Hà Thị Thảo
Trang 4MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3
1.1.Tổng quan về hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 3
1.1.1 Vị trí phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm thực vật 3
1.1.3 Phân bố, sinh thái 4
1.1.4.Thành phần hóa học 4
1.1.5 Tác dụng dược lý 7
1.1.6 Tính vị, công năng 12
1.1.7 Công dụng 12
1.2 Tổng quan về chứng sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer 12
1.2.1 Các khái niệm 13
1.2.2 Phân loại 14
1.2.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer 15
1.2.4 Các thuốc sử dụng trong điều trị 16
1.2.5 Hạn chế của các thuốc điều trị Alzheimer hiện nay 17
1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu thuốc tác động lên nhận thức và trí nhớ theo hướng điều trị Alzheimer và các thể SSTT 18
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Đối tượng nghiên cứu 21
2.1.1 Nguyên liệu 21
2.1.2 Động vật thí nghiệm 21
2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị 22
2.2 Phương pháp nghiên cứu 23
Trang 52.2.1 Định lượng acid ursolic trong cao chiết EtOH hương nhu tía bằng
phương pháp HPLC 23
2.2.2 Đánh giá tác dụng dược lý 27
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35
3.1 Định lượng acid ursolic trong cao chiết EtOH hương nhu tía 35
3.1.1 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử 35
3.1.2 Kết quả định lượng acid ursolic 36
3.2 Đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết EtOH 70 0
hương nhu tía trên chuột suy giảm trí nhớ bằng loại bỏ thùy khứu giác
4.2 Tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết EtOH trên chuột bị
suy giảm trí nhớ bằng cách loại bỏ thùy khứu giác (OBX) 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51
Trang 6DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AChE Enzym Acetylcholinesterase
Aβ 42 Amyloid β-protein 42
Chuột OBX Chuột phẫu thuật loại bỏ thùy khứu giác
HPLC High Performance Liquid Chromatography
ICD-10 International Classification of Desease 10th
(phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10)
DSM-IV Diagnostic and Statistical manual of Mental Disoedus
(chuẩn đoán và thống kê bệnh tâm thần lần IV) OBX Olfactory Bulbectomy of mice
(thùy khứu giác trên chuột) Chuột OBX Chuột phẫu thuật loại bỏ thùy khứu giác
IC50 Nồng độ ức chế 50%
HN400 Lô chuột OBX xử lý với mẫu thử liều 400mg/kg
HN200 Lô chuột OBX xử lý với mẫu thử liều 200mg/kg
p.o
i.p
Đường uống Đường tiêm phúc mạc MeOH
EtOH
Methanol Ethanol
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Kết quả nghiên cứu hàm lượng acid ursolic trong 8
loài thuộc chi Ocimum L ) ở phía Bắc Brazil
7
Bảng 2.2 Các lô chuột tiến hành thử tác dụng dược lý 28
Bảng 3.1 Kết quả sự phụ thuộc giữa diện tích pic và nồng độ
Trang 8Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng dược lý của
cao chiết EtOH hương nhu tía
Hình 3.1 Săc ký đồ mẫu chuẩn acid ursolic 630µg/ml 35
Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu thử so sánh với mẫu chuẩn acid ursolic 35
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu
đáp ứng (diện tích pic) và nồng độ mẫu chuẩn acid
Hình 3.6 Biểu đồ cột so sánh tỷ lệ phần trăm diện tích não thất
bên các lô chuột ở vị trí Bregma -1,70
43
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, Sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà lão khoa trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong bối cảnh tuổi thọ trung bình ngày càng cao, số người mắc bệnh này ngày càng nhiều [6] Các thuốc hóa dược mới đã và đang được nghiên cứu tuy nhiên
cơ chế bệnh sinh phức tạp đã khiến cho việc nghiên cứu thuốc gặp nhiều khó khăn và kém toàn diện [12] Vì thế, xu hướng nghiên cứu, phát triển thuốc điều trị có khả năng tăng cường trí nhớ từ dược liệu là một hướng đi có triển vọng cùng với các thuốc hóa dược trong điều trị sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng
Hương nhu tía (HNT) còn gọi là é tía, có tên khoa học Ocimum sanctum
L (Ocimum tenuiflorum L.) là một loại dược liệu được trồng và sử dụng rộng
rãi ở nước ta Theo kinh nghiệm dân gian hương nhu tía được dùng để hạ sốt, chữa cảm, nhất là cảm nắng, say nắng, nhức đầu, đau bụng, đi ngoài, phù thũng [8] Bên cạnh đó hương nhu tía còn được biết đến với hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và đặc biệt có tác dụng trên tâm thần kinh [11], [19],[15],[47]
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng chống stress, oxy hóa của hương nhu tía, cũng như một số công bố về tác dụng cải thiện trí nhớ, nhận thức của hương nhu tía Đó là những cơ sở khoa học cho thấy tiềm năng của loài dược liệu này theo hướng tác dụng tăng cường trí nhớ ứng dụng trong hỗ trợ và điều trị sa sút trí tuệ nói chung và Alzheimer nói riêng ở Việt Nam Về thành phần hóa học ngoài thành phần chính là tinh dầu hương nhu tía còn được biết đến là một dược liệu giàu acid ursolic - một chất có nhiều tác dụng điều trị trong đó đáng chú ý là tác dụng trên tâm thần kinh [26],[27] Tuy nhiên ở nước
Trang 10ta chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng acid ursolic trong hương nhu tía cũng như tác dụng của hương nhu tía trên trí nhớ
Vì những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Nghiên cứu định
lượng acid ursolic và tác dụng tăng cường trí nhớ của cao hương nhu tía (Ocimum sanctum L) trên chuột thực nghiệm” với mục tiêu sau:
1 Định lượng acid ursolic trong cao chiết hương nhu tía
2 Đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết hương nhu tía trên
chuột thực nghiệm
Để thực hiện các mục tiêu trên đề tài tiến hành những nội dung chính sau:
1 Định lượng acid ursolic trong cao chiết EtOH 70% hương nhu tía bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
2 Xây dựng mô hình động vật bị suy giảm trí nhớ bằng cách loại bỏ thùy khứu giác (OBX) Trên mô hình này đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao hương nhu tía qua thử nghiệm hành vi (mê lộ chữ Y cải tiến) và sự thay đổi kích thước não thất bên
Trang 11CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)
1.1.1 Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại Takhtajan
Hương nhu tía thuộc:
Tên khoa học: Ocimum sanctum L (Ocimum tenuiflorum L.)
Tên thường gọi: hương nhu tía, é đỏ, é tía
Tên nước ngoài: Mon’basil, sacred basil, holy basil, tulsi…
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây nhỏ sống hàng năm hay sống dai, cao đến gần 1m Thân, cành màu đỏ
tía, có lông mịn Lá mọc đối, có cuống dài, hình mác hoặc thuôn, dài 2 - 5 cm,
rộng 1 - 3 cm, mép khía răng cưa, hai mặt màu tím tía, có lông mềm [1],[8]
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm xim phân nhánh, lá bắc nhỏ, hoa
màu trắng hay tím tía, xếp thành từng vòng 5 - 6 hoa trên một cụm hoa, đài hoa
dài 3 - 5 mm, thùy trên hình mắt chim, thùy đưới hình dùi dài hơn, những thùy
Hình 1 Hương nhu tía
(Ocimum sanctum L.)
nguồn: khoa Tài nguyên
Trang 12bên rất ngắn; tràng hoa có cánh hơi lượn sóng ở mép; nhị 4 vượt ra ngoài tràng [8]
Quả bế tư, gần hình cầu, hơi dẹt, màu nâu nhạt hoặc đỏ có đốm đen nhỏ nằm trong đài tồn tại Mùa hoa quả: tháng 5 - tháng 7 [8]
1.1.3 Phân bố, sinh thái
Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới Châu Á, được trồng rải rác ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm rau gia vị
Ở Việt Nam hương nhu tía được trồng trong các vườn gia đình hoặc trong các cơ sở chữa bệnh theo y học cổ truyền Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, nhiệt độ trung bình năm 23 - 300C; lượng mưa 1800 - 2600 mm/năm Ở các vùng núi cao có khí hậu cận nhiệt đới và hơi lạnh, không thấy trồng [8]
Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, đến cuối mùa thu hay đầu đông thì tàn lụi Cây ra hoa quả nhiều Quả chín tự mở, hạt rơi xuống đất và nảy mầm sau 5 - 6 tháng Cây trồng dễ dàng bằng hạt [1],[8]
1.1.4.Thành phần hóa học
1.1.4.1 Hàm lượng tinh dầu và thành phần hóa học của tinh dầu
Phần trên mặt đất chứa tinh dầu Hàm lượng tinh dầu khi cây bắt đầu có hoa đến lúc ra hoa là 1,08 - 1,62% [8] Dược điển Việt Nam IV quy định hàm lượng tinh dầu không dưới 0,5% (tính theo dược liệu khô)…
Thành phần tinh dầu trong cây gồm các nhóm chất sau:
+ Nhóm methyleugenol: thứ lá tía (A) 72,7%, thứ lá xanh (B) 70,9% methyleugenol 2,5% [8]
+ Cả 3 thứ (A,B,C) đều chứa caryophylen 17,3% (A); 20,4% (B); 6,7% (C)
Trang 13Hương nhu tía ở Việt Nam chứa 30 - 40% eugenol Tinh dầu hương nhu tía
chứa α-pinen; sabinen; β-pinen; mycren; 1,8-cineol; linalol; camphor; borneol;
citral; eugenol; methyleugenol; terpinen; β-carophylen…Các thành phần chính
là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và β-carophylen Các thành
phần này giống như thành phần cây hương nhu tía Ấn Độ… [1]
Eugenol Methyleugenol
1.1.4.2 Các thành phần khác
Ngoài thành phần chính là tinh dầu hương nhu tía còn chứa các hợp chất
khác như flavonoid, saponin, tanin, poly phenol [31]
Theo H.Skaltsa và cộng sự,(1999), hương nhu tía chứa các hợp chất poly
phenol, flavonoid: apigenin; apigenin-7-glucuronid; luteolin-7-glucuronid;
orientin; acid galic; acid cafeic; acid galic methylester [37]
Acid ursolic và acid oleanolic là thành phần chính và quan trọng có hàm
lượng cao trong hương nhu tía thuộc nhóm saponin triterpenoid [31]
Theo USP 36:
+ Lá HNT ≥ 0,5% triterpen (Ursolic + Oleanolic)
+ Sản phẩm từ HNT: ≥2% triterpenoid
Trang 14
Acid ursolic Acid oleanoic
+ Năm 2008, Silva và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng acid
ursolic trong lá của 8 loài thuộc chi Ocimum ở phía Bắc của Brazil bằng phương
pháp phân tích HPLC Nghiên cứu đã chỉ ra O.sanctum L là loài có hàm lượng
acid ursolic trong lá cao nhất (lên đến 2,02%) trong các loài thuộc chi Ocimum
L [13] Kết quả nghiên cứu định lượng được trình bày ở Bảng 1
+ Nguyễn Ngọc Hiếu đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của
hương nhu tía Kết quả xác định các nhóm chất hữu cơ cơ bản trong hương nhu
tía bằng phản ứng hóa học cho thấy cành, lá hương nhu tía có chứa: saponin
triterpenoid, flavonoid, coumarin, acid hữu cơ, tinh dầu, phytosterol Kết quả
nghiên cứu cũng xác định sự có mặt acid ursolic trong hương nhu tía bằng
SKLM cũng như bước đầu xây dựng quy trình chiết tách acid ursolic từ hương
nhu tía Tuy nhiên đề tài này chưa thực hiện quá trình định lượng acid ursolic
[4]
HO
H
Trang 15Bảng 1 Kết quả nghiên cứu hàm lượng acid ursolic trong 8 loài thuộc
chi Ocimum L phía Bắc Brazil [13]
STT Loài thuộc chi Ocimum L Hàm lượng acid ursolic(%)
Trong hai thập kỷ qua, tác dụng dược lý của O sanctum L Đã được chứng
minh bằng các nghiên cứu tiền lâm sàng trên các mô hình động vật và trong các
thử nghiệm in vitro Một số tác dụng đáng chú ý được báo cáo sau đây:
1.1.5.1 Tác dụng kháng khuẩn
Trong nghiên cứu của Singh và cộng sự cho thấy hàm lượng axit linoleic
trong tinh dầu O.sanctum L có thể đóng góp cho hoạt động kháng khuẩn của
nó Các thành phần trong tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn đối với các
chủng vi khuẩn nhạy cảm sau: Staphylococcus aureus, Bacillus pumius và
Pseudomonas aeruginosa [40]
Trang 16Nghiên cứu của Geeta và cộng sự chỉ ra rằng dịch chiết nước của Ocimum
sanctum L ở liều 60 mg/kg cho thấy đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn so
với chiết xuất cồn với chủng Klebsiella, E coli, Proteus, Vibrio cholerae khi
nghiên cứu bằng phương pháp khuếch tán thạch [43]
Ở Việt Nam tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu hương nhu tía đã được
nghiên cứu bằng đo đường kính vòng vô khuẩn: với Bacillus mycoides có vòng
vô khuẩn 22 mm; B.subtilis (60 mm); E.coli (15 mm); Klebsiella sp (12 mm);
Staphylococus aureus (20 mm) (Bộ Y tế - Công trình nghiên cứu khoa học y
dược 1997 - 1989) [8]
1.5.1.2 Tác dụng chống viêm giảm đau hạ sốt
Dạng dịch chiết bằng methanol và dạng nhũ tương được điều chế từ cao
chiết hương nhu tía đã được thử nghiệm về tác dụng chống viêm, giảm đau hạ sốt
Về tác dụng chống viêm :
Các dạng bào chế đều ức chế phù gan bàn chân chuột cống trắng do
carragenin gây nên trên mô hình viêm cấp tính và ức chế sự hình thành dịch rỉ viêm, tổ chức hạt trong mô hình gây viêm mãn tính do tiêm crotom Tác dụng chống viêm của dịch chiết và nhũ tương với liều 500 mg/kg có tác dụng tương
đương natri salicylat với liều 300 mg/kg [20]
Singh trong nghiên cứu của mình đã báo cáo rằng hiện nay axit linoleic
trong tinh dầu của O sanctum L có khả năng ức chế cả cyclooxygenase và
lipoxygennase trên con đường chuyển hóa acid arachidonic, từ đó có tác dụng chống viêm [36]
Về tác dụng giảm đau
Trang 17Tác dụng giảm đau của chiết xuất cồn lá của O sanctum L (50, 100 mg/
kg (i.p) và liều 50, 100, 200 mg/kg (p.o) đã được thử nghiệm trên chuột sử dụng
acid acetic băng để gây đau thắt Kết quả cho thấy dịch chiết O Sanctum L
giảm số lần đau thắt [20]
1.5.1.3 Tác dụng chống oxy hóa
Khả năng chống oxy hóa của tinh dầu của O sanctum L được đánh giá
bằng cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dựa vào hàm lượng hypoxanthin xanthin oxidase Trong mô hình hypoxanthin xanthin oxidase khảo nghiệm, khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ là tác dụng
từ O sanctum L (IC 50 = 0,46 ml/ml) [28]
Trong một nghiên cứu khác dịch chiết nước của O sanctum L làm tăng
đáng kể hoạt động của enzym chất chống oxy hóa như superoxid dismutase, catalase so với nhóm đối chứng [14]
1.5.1.4 Tác dụng hạ đường huyết
Ghosap và cộng sự đã làm làm sáng tỏ những cơ chế có thể trong tác dụng
hạ đường huyết của hương nhu tía Nghiên cứu chỉ ra rằng O.sanctum L giảm nồng độ cortisol và glucose trong huyết thanh Do đó O sanctum L Có khả
năng điều chỉnh nồng độ corticosteroid gây ra bệnh đái tháo đường [14]
Trong một nghiên cứu khác đã nhận thấy ảnh hưởng của O.sanctum trên
ba enzyme quan trọng của quá trình chuyển hóa carbohydrat là: glucokinase (GK), hexokinase (HK) và phosphofructokinase (PFK) [44]
1.5.1.4 Tác dụng trên tâm - thần kinh
Dịch chiết EtOH của lá O sanctum L kéo dài thời gian bị mất phản xạ do
pentobarbital ở chuột, giảm thời gian phục hồi và tác dụng có hại của sốc điện
và co giật gây ra bởi pentylenetetrazol [32]
Trang 18Một số nghiên cứu về tác dụng chống trầm cảm, lo âu của hương nhu tía
được công bố:
- Chatterjee M và cộng sự đã chứng minh rằng: ở liều 200 mg/kg dịch chiết cồn từ hương nhu tía có tác dụng chống trầm cảm trên chuột nhắt (giảm thời gian bất động trên thử nghiệm treo đuôi chuột và thử nghiệm chuột bơi cưỡng bức) [38]
- Cao chiết Methanol của O sanctum L ở liều 400 mg/kg (i.p) làm tăng
thời gian bơi của chuột trong thử nghiệm chuột bơi cưỡng bức cho thấy tác dụng kích thích hệ thống thần kinh trung ương và chống căng thẳng [42]
- Trong một nghiên cứu của B.Swathi và cộng sự đã chỉ ra rằng Ocimum
sanctum L ở nồng độ 0,25% có thể được sử dụng như là chất bổ sung tự nhiên
để cải thiện phản ứng miễn dịch và tăng nồng độ cortisol hơn trong điều kiện stress gây ra bởi nhiệt trong chăn nuôi gà thịt [41]
- Bằng cách định lượng Acetylcholin và hoạt độ Acetylcholinesterase ở các vùng khác nhau của não chuột bị stress bởi tiếng ồn, nghiên cứu cho thấy cao chiết EtOH 70% của hương nhu tía với liều 100 mg/kg có tác dụng bảo vệ các
mô não trước tác động có hại gây stress bởi tiếng ồn [34]
Một số nghiên cứu về tác dụng cải thiện trí nhớ, nhận thức của hương nhu tía:
Trên thế giới:
- Sử dụng mô hình gây thiếu máu não trên chuột nhắt, Yanpallerwar và cộng sự đã chứng minh rằng dịch chiết cồn từ lá hương nhu tía làm giảm peroxid hóa lipid và SOD (superoxid dismutase) và TSH (total sulhydryl groups) cùng những biến đổi về mô học gây ra thiếu máu não – một trong những nguyên nhân gây suy giảm trí nhớ [46]
Trang 19- Dịch chiết nước của Ocimum sanctum L Có tác dụng tăng cường trí nhớ
trên mô hình chuột gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin, diazepam và do lão hóa [31]
- Nghiên cứu của Girdhan và cộng sự cũng cho thấy dịch chiết nước (300
và 500 mg/kg) và dịch chiết EtOH (300 và 500 mg/kg) của lá hương nhu tía có tác dụng chống suy giảm trí nhớ , ức chế Acetylcholinesterase và làm tăng cường miễn dịch trên chuột cống gây mất trí nhớ bằng sốc điện, atropin và cyclosporin liều cao [45]
- Kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy viên nang 300mg cao chiết EtOH
lá hương nhu tía có tác động tích cực lên các thông số nhận thức nhất định như trí nhớ ngắn hạn, mức độ tập trung khi so sánh với giả dược [38]
Ở Việt Nam:
Tác giả Trần Phi Hoàng Yến và cộng sự đã sử dụng mô hình gây suy giảm trí nhớ bằng Trimethylmin (TMT) để đánh giá tác dụng bảo vệ khả năng học tập và ghi nhớ của cao chiết toàn phần lá hương nhu tía trên chuột nhắt trắng Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết EtOH toàn phần lá hương nhu tía ở liều uống 50 mg/kg và 100 mg/kg thể hiện khả năng bảo vệ sự suy giảm khả năng học tập và ghi nhớ qua mô hình Mê lộ nước Moris và tác dụng này có liên quan đến hệ cholinergic, làm tăng hàm lượng Acetylcholin và giảm hoạt tính Acetylcholinesterase trong vùng hải mã não chuột [9]
Những nghiên cứu trên về tác dụng của hương nhu tía trên tâm - thần kinh
là cơ sở cho việc nghiên cứu tác dụng dược lý các mẫu thử với những dung môi chiết khác nhau và những bộ phận khác nhau của hương nhu tía đối với tác dụng tăng cường trí nhớ
Trang 201.1.6 Tính vị, công năng
Hương nhu tía có vị cay, mùi thơm, tính ấm, quy vào hai kinh: phế, vị, có tác dụng phát hãn (làm ra mồ hôi), thanh nhiệt, tán thấp, hành thủy, giảm đau [8]
1.1.7 Công dụng [8]
Hương nhu tía được dùng làm thuốc trong phạm vi kinh nghiệm dân gian
để hạ sốt, chữa cảm, nhất là cảm nắng, say nắng, nhức đầu, đau bụng, đi ngoài, nôn mửa, phù thũng Ngày dùng 6 – 12 gam dưới dạng thuốc sắc hoặc thuốc
hãm
Eugenol, chiết từ hương nhu tía, được dùng trong nha khoa và là nguyên liệu để tổng hợp vanilin
Ở Ấn Độ, nước hãm của lá hương nhu tía được dùng chữa đau dạ dày ở trẻ
em và sốt rét Dịch ép từ lá chữa nôn mửa và giun móc vì trong dược liệu có thymol phối hợp với mật ong gừng và dịch ép tỏi làm thuốc lợi đờm, chữa viêm phế quản, ho ở trẻ em Dịch ép từ lá còn chữa rắn độc cắn
Ở Myanma, nước sắc của lá hương nhu tía chữa đầy hơi và tiêu chảy ở trẻ
em, hạt chữa bệnh thận, nước hãm từ lá chữa viêm đường hô hấp và rối loạn kinh nguyệt
1.2 Tổng quan về chứng sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer
Già hóa dân số là hiện tượng mang tính toàn cầu Ở Việt Nam già hóa dân
số đang diễn ra nhanh chóng Theo số liệu tổng điều tra dân số năm 2009, Việt Nam có 7,7 triệu người già ( ˃ 60 tuổi), chiếm hơn 9% tổng dân số Do già hóa dân số nên mô hình bệnh tật cũng thay đổi, với sự gia tăng nhanh chóng của các bệnh mạn tính, các bệnh thoái hóa, trong đó có SSTT với thể điển hình là Alzheimer Sa sút trí tuệ thực sự là một thảm họa với người cao tuổi gây suy
Trang 21giảm trí nhớ và nhiều lĩnh vực nhận thức khác ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động hằng ngày và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân
Hiện chưa có phương pháp nào thực sự có hiệu quả trong điều trị chứng sa sút trí tuệ nói chung và bệnh Alzheimer nói riêng Các phương pháp điều trị bằng thuốc kết hợp với chăm sóc chỉ có thể làm chậm sự tiến triển của bệnh Hơn nữa các thuốc đang được sử dụng để điều trị bệnh lý này còn nhiều tác dụng không mong muốn, giá thành cao, thời gian điều trị lâu dài, gây ảnh hưởng tới sức khỏe cũng như gia tăng gánh nặng kinh tế cho bệnh nhân và gia đình
1.2.1 Các khái niệm
Theo phân loại bệnh quốc tế lần thứ 10 –ICD10: “Chứng sa sút trí tuệ
(F00-F03) là một hội chứng lâm sàng do bệnh của não, thường có tính chất
mãn tính hay tiến triển, trong đó có sự suy giảm của nhiều chức năng vỏ não, bao gồm cả trí nhớ, tư duy, định hướng, tính toán, năng lực học tập, ngôn ngữ
và phán xét”
Hội chứng sa sút trí tuệ hay gặp ở bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và
trong các bệnh khác là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát ảnh hưởng tới não bộ
Theo thống kê sa sút trí tuệ là rối loạn phổ biến hàng thứ 2 trong các rối
loạn tâm thần ở người cao tuổi, trong đó Alzheimer là bệnh đứng hàng đầu
trong các nguyên nhân gây sa sút trí tuệ: 50% - 60% các trường hợp sa sút
tuệ là do bệnh Alzheimer, 10% - 15% các trường hợp sa sút trí tuệ là có sự phối
hợp giữa bệnh Alzheimer và bệnh mạch máu não Bệnh Alzheimer gặp ở 5% người trên 60 tuổi và tỷ lệ này cứ 5 năm lại tăng lên gấp đôi Trong các nghiên cứu lâm sàng khác nhau tỉ lệ bệnh nhân rối loạn trí nhớ và nhận thức chuyển sang sa sút trí tuệ hàng năm từ 6% đến 25% [12]
Các tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh SSTT bao gồm (DSM-IV, 1994)
Trang 22+ Giảm trí nhớ (giảm khả năng học thông tin mới và nhớ lại các thông tin
+Những thiếu hụt này không xảy ra trong cơn sảng
Trí nhớ là lĩnh vực nhận thức bị ảnh hưởng nhiều nhất trong SSTT Có ba
loại trí nhớ: trí nhớ tức thì (immediate), trí nhớ gần (recent memory), và trí nhớ
xa (remote memory) Trong bệnh Alzheimer, giảm trí nhớ là triệu chứng đầu tiên được ghi nhận Ở giai đoạn đầu của bệnh Alzheimer, bệnh nhân thường có giảm trí nhớ gần, tức là các thông tin mới thu nhận bị quên trước các thông tin
đã thu nhận từ quá khứ Bệnh nhân có thể nhớ rõ các sự kiện từ nhiều năm trước xong không nhớ nổi các sự kiện xảy ra 5 phút trước đó [5],[6]
1.2.2 Phân loại
1.2.2.1: Phân loại sa sút trí tuệ
Các rối loạn tạo thành chứng sa sút trí tuệ được phân loại và xác định trên
cơ sở các yếu tố gây bệnh khác nhau và những con đường sinh lý khác nhau Trong một số tài liệu, chứng sa sút trí tuệ được phân loại thành các typ hoặc
các dạng Các typ phổ biến của chứng sa sút trí tuệ gồm [5],[12]
- Sa sút trí tuệ bệnh Alzheimer (Dementia in Alzheimer disease)
- Sa sút trí tuệ bệnh mạch máu (Vascular dementia)
- Sa sút trí tuệ do thể Lewy (Lewy body dementia)
Trang 23- Sa sút trí tuệ thùy trán - thái dương, gồm cả bệnh Pick (Frontotemporal dementia, Pick’ disease)
- Sa sút trí tuệ do các nguyên nhân có thể đảo ngược khác như: nhiễm độc mãn tính (do rượu hoặc do thuốc), thiếu vitamin, bệnh tâm thần …
1.2.3 Cơ chế bệnh sinh của bệnh Alzheimer
Cho đến nay người ta đã thừa nhận Alzheimer là một bệnh thoái hóa não
do nhiều nguyên nhân gây ra, không đồng nhất về mặt di truyền, phát sinh và tiến triển theo những cơ chế không hoàn giống nhau giữa các bệnh nhân Tuy nhiên người ta đã đưa ra một giả thuyết để liên kết vai trò tất cả các thành tố cơ bản trong bệnh nguyên [5]
Với giả thuyết này, Amyloid đóng một vai trò cốt lõi Các yếu tố căn nguyên tuy rất đa dạng xong đều có một tác động đồng quy vào quá trình chuyển hóa của protein tiền chất Amyloid để tạo ra một sản phẩm là protein Aβ
42 acid amin Sự lắng đọng kết tập Aβ 42 sẽ tạo ra các mảng lão suy, các đám rối sợi thần kinh… dẫn đến chết nơron, mất synap và các phản ứng viêm tổ chức thần kinh [5]
Các tổn thương đặc hiệu này sảy ra ở các khu vực khác nhau của não đặc biệt là vỏ não thùy trán, nền não trước và hồi hải mã thùy thái dương… Tổn thương các vùng này sẽ dẫn đến sự thiếu hụt các chất dẫn truyền thần kinh đặc biệt là Acetylcholin (chất được coi là có vai trò cơ bản trong rối loạn sinh hóa não, gây suy giảm nhận thức và trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer) Sự suy giảm lượng Acetylcholin này tương ứng với mức độ trầm trọng của bệnh sa sút trí tuệ trên lâm sàng Các chất dẫn truyền thần kinh khác cũng thấy bị rối loạn trong não bệnh nhân Alzheimer (tuy không đặc hiệu) [5]
Trang 241.2.4 Các thuốc sử dụng trong điều trị
1.2.4.1 Thuốc ức chế Acetylcholinesterase
Acetylcholinesterase là một enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa thủy phân của chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholine, từ đó làm ngưng lại hoạt động của chúng tại khe synap cholinergic ở cả thần kinh trung ương và ngoại
vi Tuy nhiên khi có chất đối kháng cholinesterase liên kết với enzym này sẽ làm ngăn cản quá trình thủy phân Acetylcholin và nó có thể thực hiện được vai trò dẫn truyền thần kinh (mã hóa trí nhớ) của mình Việc giữ cho chu kì hoạt động của Acetylcholin ổn định trong não sẽ giúp duy trì khả năng ghi nhớ và nhận thức [5],[12]
Vì vậy thuốc ức chế Acetylcholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh SSTT khác Nhóm thuốc này đã được chứng minh là có hiệu quả hơn giả dược (placebo) trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh Alzheimer và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được
sử dụng ở giai đoạn bệnh nhẹ hay trung bình Hiện nay thuốc trong nhóm này đang được sử dụng trong điều trị nhằm làm chậm tiến triển của bệnh gồm:
donepezil (Aricept), rivastigmin (Exelon), glantamin(Remynyl), tacrin [3],
[5],[6],[12]
1.2.4.2 Thuốc ức chế glutamat (Memantin)
Memantin là chất kháng thụ thể N - methyl – D - aspartat (NMDA), ức chế tác dụng của gluatamat ở vị trí này, cải thiện dẫn tryền synap và ngăn cản giải phóng canxi có thể có tác dụng bảo vệ thần kinh Trong thực hành memantin được chỉ định trong các giai đoạn Alzheimer từ trung bình đến nặng [3],[5],[6], [12]
Trang 251.2.5 Hạn chế của các thuốc điều trị Alzheimer hiện nay
Về hiệu quả điều trị
Chứng sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer là hậu quả của những thoái hóa không hồi phục thần kinh não bộ Các thuốc điều trị hiện tại không có hiệu quả kéo dài tuổi thọ, chữa khỏi bệnh, tạm dừng hoặc đảo ngược quá trình sinh lý bệnh Hai nhóm thuốc chính đang được sử dụng là thuốc ức chế cholinesterase
và thuốc tác dụng trên hệ glutamat dựa trên giả thuyết cơ chế bệnh sinh của Alzheimer Tuy nhiên cơ chế bệnh sinh chính của bệnh Alzheimer đến nay chưa được xác định rõ ràng và giả thuyết này chỉ là một phần trong rất nhiều con đường dẫn đến việc tế bào thần kinh bị phá hủy [12]
Về tương tác thuốc và tác dụng không mong muốn
Nhóm ức chế cholinesterase: tác dụng không mong muốn thường do các
tác dụng kích thích cholinergic quá mức và phụ thuộc vào liều như: buồn nôn, nôn tiêu chảy, đau bụng, chóng mặt, nhức đầu, tiết nước bọt, đổ mồ hôi, mệt mỏi mất ngủ, kích động… Trong đó nôn, buồn nôn, tiêu chảy được báo cáo nhiều nhất [39] Tacrin gây nhiễm độc gan sau khoảng 3 tháng ở 30 - 40% số
bệnh nhân và trở lại bình thường sau ngừng thuốc [5]
Trang 26Tương tác thuốc trong nhóm ức chế cholinesterase có thể gặp như: donepezil và glantamin chuyển hóa qua hệ Cytocrom P450, enzym CYP3A4, nên chúng có nguy cơ gây tương tác với các thuốc ức chế hoặc gây cảm ứng trên hệ enzym này: carbamazepin, dexamethason, phenobarbital… Ngoài ra, các thuốc nhóm còn có thể gây tương tác thuốc với các nhóm: thuốc chống loạn thần, các azol chống nấm, nhóm ức chế thụ thể H2, các thuốc tác dụng lên acetylcholin khác [18]
Nhóm ức chế glutamat: tác dụng không mong muốn: táo bón, lú lẫn,
chóng mặt, đau đầu, ảo giác, ho và cao huyết áp [10]
1.2.6 Một số mô hình nghiên cứu thuốc tác động lên nhận thức và trí nhớ theo hướng điều trị Alzheimer và các thể SSTT
Dựa trên cơ chế bệnh sinh các mô hình hiện đại nghiên cứu về thuốc điều trị sa sút trí tuệ lần lượt ra đời:
- Mô hình đầu tiên phải được kể đến là mô hình đánh giá khả năng ức chế
hoạt tính enzym AChE Đơn giản nhất là phương pháp in vitro, nhưng phương pháp in vivo hoặc ex vivo cho kết quả chính xác hơn [9],[23],[45]
- Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị Alzheimer, bằng cách gây độc tế bào bằng protein β-amyloid hoặc glutamat Thuốc điều trị Alzheimer sẽ có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh [25]
- Trên mô hình động vật
+ Người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh Alzheimer như chuột Tg 2576, PSAP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Tuy nhiên chi phí để mua chuột chuyển gen là tương đối cao [22]
Trang 27+ Một số mô hình gây mất trí nhớ cho chuột bằng hóa chất như tiêm scopolamin bằng đường phúc mạc, hoặc truyền colchicin vào não chuột cống cũng được sử dụng [25]
+ Bên cạnh đó các mô hình phẫu thuật gây mất trí nhớ cho chuột cũng được nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng để nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ của thuốc và dược liệu Trong đó, mô hình gây suy giảm trí nhớ do thiếu máu não cục bộ bằng cách thắt hai động mạch cảnh đồng thời gây hạ huyết áp bằng cách rút máu đuôi chuột và mô hình phá bỏ thùy khứu giác (OBX) là hai
mô hình được sử dụng rộng rãi
- Mô hình gây suy giảm học và nhớ trên chuột bằng cách loại bỏ thùy
khứu giác (Olfactory Bulbectomized mice) – OBX
+ OBX là mô hình thực nghiệm hiện đại được các phòng thí nghiệm về thần kinh trên thế giới sử dụng rộng rãi để đánh giá tác dụng của thuốc hay liệu pháp điều trị trên những chứng rối loạn nhận thức và trí nhớ bao gồm cả Alzheimer [23],[24]
+ Có nhiều bằng chứng cho thấy sự tương đồng giữa chuột OBX và các biểu hiện của Alzheimer nói riêng và suy giảm nhận thức nói chung như:
Sự suy giảm khứu giác cấp tính không chỉ xuất hiện ở giai đoạn sớm của Alzheimer mà còn quan sát được ở bệnh rối loạn nhận thức mức
độ nhẹ [3],[7]
Thêm vào đó thực nghiệm đã cho thấy cắt bỏ thùy khứu giác cũng làm tăng biểu hiện gen quy định protein tiền chất của β - amyloid do đó làm tăng nồng độ β - amyloid trong não [23],[24],[35]
Trong mô hình OBX người ta còn thấy được sự thoái hóa của vùng hải
mã và hệ cholinergic ở loài gặm nhấm theo đó gây ra sự suy giảm trí nhớ, nhận thức [23],[24],[35]
Trang 28+ Đây cũng là mô hình được lựa chọn trong nghiên cứu này của chúng tôi
để gây suy giảm trí nhớ và trên mô hình đó tiến hành các thử nghiệm hành vi
và mô học đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết hương nhu tía
Trang 29CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
- Nguồn nguyên liệu: Mẫu hương nhu tía được thu hái tại Nghệ An và giám
định đúng tên khoa học là Ocimum sancum L tên đồng nghĩa Ocimum
tenuiflorum L bởi Khoa tài nguyên - Viện Dược Liệu
- Xử lý và lưu mẫu tại Khoa tài nguyên - Viện Dược Liệu
- Mẫu thử được chọn là: cao khô chiết EtOH 70% hương nhu tía
Quy trình chuẩn bị mẫu thử như sau:
Dược liệu tươi hương nhu tía phần trên mặt đất được sấy khô ở 500C sau
đó xay nhỏ kích thước 2 - 5 mm Khối lượng dược liệu khô (m = 100 gam) Chiết nóng hồi lưu 3 lần sử dụng dung môi EtOH 70% (Lần 1: 1 lít EtOH 700
trong 2 giờ ; Lần 2: 800 ml EtOH 700 trong 1,5 giờ; Lần 3: 800 ml EtOH 700trong 1 giờ) Sau đó dịch chiết được gộp lại bốc hơi dung môi và làm khô nước dưới áp suất giảm tới độ ẩm 4,7% được cao khô dùng làm mẫu thử cho nghiên cứu hóa học và dược lý (m = 12,7 gam)
2.1.2 Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng Swiss albino 6 tuần tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng trung bình 28 - 30 g được cung cấp bởi Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương
- Chuột sau khi mua về được nuôi trong phòng chăn nuôi trong điều kiện
độ ẩm, độ thông khí và ánh sáng thích hợp, được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn
do Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương cung cấp, thức ăn và nước uống tự do theo nhu cầu của chuột
Trang 302.1.3 Hóa chất, trang thiết bị
Hóa chất, dung môi
Bảng 2 Hóa chất sử dụng trong đề tài
STT Hóa chất Nguồn gốc
2 Natri pentobarbital Wako, Nhật Bản
3 Thuốc thử Cresyl violet acetat Sigma St.louis, MO, USA
4 Acid ursolic chuẩn (98%) Sigma St.louis, MO, USA
5 Dung môi chạy HPLC đảm bảo
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Shimadzu- Nhật Bản gồm bơm
LC - 20AD, bộ tiêm mẫu tự động SIL - 20AHT, detector UV - VIS, phần mềm Labsolution để truy suất hình ảnh và số liệu trên máy HPLC
- Cân phân tích Precisab XT 220A, độ chính xác 0,0001g
- Máy rung siêu âm Power Sonic 405
- Hệ thống định vị hộp sọ chuột - Nhật Bản
- Phần mềm phân tích kết quả thử nghiệm hành vi Any Maze của hãng Stoeling Mỹ cung cấp
Trang 31- Máy cắt tiêu bản chuyên dụng (dùng cắt tiêu bản não chuột)
- Mê lộ chữ Y cải tiến: Tự thiết kế theo cấu trúc của hãng Ugo Basile
- Các dụng cụ thủy tinh khác: cốc có mỏ, bình định mức, pipet của phòng Hóa thực vật 1 – Viện dược liệu
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Định lượng acid ursolic trong cao chiết EtOH hương nhu tía bằng phương pháp HPLC
2.2.1.1 Nguyên tắc
Nguyên tắc phương pháp HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector [2]
HPLC có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và yêu cầu của công việc Trong khóa luận này
kỹ thuật HPLC được sử dụng để định lượng acid ursolic trong hương nhu tía là sắc ký phân bố pha liên kết - pha đảo [2]
Trang 32- Phương pháp ngoại chuẩn (chuẩn hóa nhiều điểm- đường chuẩn)
- Phương pháp nội chuẩn
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khóa luận này để định lượng acid ursolic trong cao chiết EtOH hương nhu tía chúng tôi sử dụng phương pháp ngoại chuẩn Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả mẫu chuẩn và mẫu thử đều đựơc tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích hoặc chiều cao pic của mẫu thử với diện tích hoặc chiều cao pic của các mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ các chất trong mẫu thử [2]
2.2.1.2 Quy trình định lượng
Chuẩn bị mẫu: vì acid ursolic tan tốt trong MeOH nên MeOH được lựa chọn
để pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử
- Chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn với nồng độ khác nhau:
+ Pha dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 6,3 mg ( thực tế cân 6,4 mg) acid ursolic chuẩn (98%) cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan trong MeOH, siêu âm 15 phút, thêm MeOH tới vạch, lắc đều Nồng độ dung dịch chuẩn gốc là: