Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế miễn dịch của lá cây chay

Các chất này có thể thuộc một trong hai nhóm : nhóm có tác dụng hổi phục tăng cường tình trạng suy giảm miễn dịch hoặc nhóm có tác dụng ức chế tình trạng đáp ứng quá mức bình thường quá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO IỊỘ Y TẾ

TRƯỜNC, ĐẠI I1ỌC D ược HẢ NỘI

DS N G ô Q U Ố C ANH

NGHIÊN CỨU TIIÀNII PHầ N h ó a h ọ c VÀ TÁC DỤNG ỨC CHế MIỄN DỊCH CỦA LÁ CÂY Ch AY

( Artocarpus tonkinensis A.Chev., Moraceae )

Luận văn Thạc sĩ Dược học Chuyên ngành : Dược liệu - Dược học cổ truyền

Mã số : 3 02 03

Người 1 lương dãn: IHỈS.TSKH T R ầ N v ă n s u n g

HÀ NỘI - 2000

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

P G S T S K H TRẦN VĂN SUNGViện Hoá, Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc Gia

đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, luôn luôn quan tâm, động viên và đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi trên con đường nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tói các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá và phòng Miễn dịch - Viện Công nghệ Sinh học, trung tâm KHTN và CNQG đã hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Đổng thời tồi cũng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới GS TS PHAN THỊ PHI PHI và các cán bộ nghiên cứu thuộc Labo Sinh học và bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, trường Đại học Y Hà Nội đã hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS PHẠM THANH KỲ, PGS TS PHẠMQUANG TÙNG đã đọc và góp những ý kiến quí báu để hoàn thiện bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS PHẠM QUANG TÙNG, PGS TS BÙI KIM LIÊN và các thầy cô giáo ở phòng Đào tạo sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới những người thân trong gia đinh và bạn bè đã luôn luôn giúp đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này

Hà Nội, ngày 25 tháng 2 năm 2000

NGÔ QUỐC ANH

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ề 1

CHƯƠNG I - TỔNG Q U A N 3

1.1 MỘT SỐ NÉT VỀ M Ễ N DỊCH HỌC VÀ THUỐC’ ú c CHẾ MIỄN DỊCH 3

1.2 CÂY CHAY , MỘT D ư ợ c LIỆU CÓ TÁC DỤNG ú c CHẾ MEEN d ịc h 9

CHƯƠNG n - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 22 2A ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ú ư 2 2 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 23

CHƯƠNG m — KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 NGHIÊN c ú u THÀNH PHAN HOÁ h ọ c v à ho ạ t t í n h s in h h ọ c : c ủ a d ịc h C H Ế T NƯỚC 2 8 3.2 NGHIÊN c ú u THÀNH PHAN HOÁ h ọ c v à ho ạ t t í n h s in h h ọ c : c ủ a d ịc h CHIẾT METHANOL 80% 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ N G H Ị 52

TÀI LIỆU THAM K H Ả O 54

ĐẬT VẤN ĐỂ

Một trong những đóng góp quan trọng của miễn dịch học đối với Y học là việc phát hiện ra các chất điều hoà miễn dịch Các chất này có thể thuộc một trong hai nhóm : nhóm có tác dụng hổi phục tăng cường tình trạng suy giảm miễn dịch hoặc nhóm có tác dụng ức chế tình trạng đáp ứng quá mức bình thường (quá mẫn), thí dụ :

- Nhóm chất kích thích miễn dịch : một số có nguồn gốc sinh học như lymphokin , interleukin, một số khác có nguồn gốc từ vi sinh vật (BCG, corynebacterium parvum, ), thực vật (lectin, các hợp chất trong tầm gửi, cây nhàu ) và các chất hoá học (LH1, levamisol, isoprinosin, ) [ 3]

- Nhóm chất ức chế miễn dịch : Có nguồn gốc tổng họp như cyclophosphamid, azathioprin, corticoid, hoặc có nguồn gốc từ chất

chuyển hoá của nấm Tolypocladỉum như cyclosporin A Hiện nay các

chất ức chế miễn dịch được chia làm hai nhóm dựa theo cấu trúc hoá học : thuốc ức chế miễn dịch steroit và không steroit.[3]

Cùng với sự phát triển của các kỹ thuật ghép mô trong ngoại khoa và việc tìm ra căn nguyên của một số bệnh nan y là do tình trạng đáp ứng quá mức bình thường (quá mẫn ) của hệ miễn dịch thì việc tìm kiếm các chất ức chế miễn dịch đã được đẩy manh, kể cả các chất ức chế miễn dịch tự nhiên hay tổng hợp Tuy nhiên các biệt dược có tác dụng ức chế miễn dịch đang được

sử dụng hiện nay đều rất đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ nguy hiểm như diệt tế bào máu, tế bào miễn dịch và tế bào niêm mạc ruột Do vậy xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hoạt chất thiên nhiên từ nguồn gốc thảo mộc có tác dụng xấp xỉ các biệt dược nhưng ít độc hơn, dễ được dung nạp

vào cơ thể nhất là ở người cao tuổi và người có bệnh mãn tính.

1

Với mong muốn tìm kiếm các thuốc ức chế miễn dịch từ nguồn dược liệu trong nước, chúng tôi chú ý tới một dược liệu là cây chay, tên khoa học là

Artocarpus tonkinensis A Chev, thuộc họ dâu tằm Moraceae, một cây mọc

tự nhiên hoặc được trồng phổ biến ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc Theo kinh nghiệm dân gian, lá chay dùng dưới dạng nước sắc để chữa các bệnh đau lưng, yếu cơ Giáo sư Phan Chúc Lâm (Bệnh viện Quân Y 108 )

đã dùng chế phẩm nước sắc lá chay (dạng bột phun sương ) điều trị thành công cho một số bệnh nhân nhược cơ tự miễn Chế phẩm cũng đã được

chứng minh có hiệu quả ức chế miễn dịch rõ rệt trên in vitro và in vivo và

được kiểm nghiệm là an toàn về độc tính theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam I [9,11] Tuy vậy về mặt hoá học, cây chay chưa được nghiên cứu ở nước ta cũng như trên thế giới

Với hy vọng có thể nâng cao hiệu quả điều trị và tìm ra các hoạt chất có hoạt tính ức chế miễn dịch từ cây chay, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu này Nhiệm vụ của luận văn là :

- Nghiên cứu các phương pháp chiết tách khác nhau để thu được các dịch chiết có hoạt tính ức chế miễn dịch từ lá chay

- Từ các dịch chiết có hoạt tính, tiến hành các phương pháp sắc ký và phương pháp tách để thu các phân đoạn có hoạt tính cao hơn

- Nghiên cứu các phương pháp thử hoạt tính ức chế miễn dịch thực nghiệm dùng cho các dịch chiết và các phân đoạn từ cây chay

có thể hiểu biết khá tường tận về cơ chế của quá trình đáp ứng miễn dịch cũng như các chất nội sinh tham gia vào sự điều hoà miễn dịch của cơ thể

Sự toàn vẹn của hệ thống miễn dịch đảm bảo cho quá trình đáp ứng miễn dịch diễn ra bình thường Nhưng vì những lý do khác nhau mà dẫn đến các tổn thương của một hay nhiều yếu tố trong hệ miễn dịch thì sẽ dẫn đến rối loạn và suy yếu chức năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể, làm xuất hiện các hiện tượng bệnh lý

3

• Quá mẫn typ I : Gồm quá mẫn tức khắc và quá mẫn nhanh với các thể lâm sàng như sốc phản vệ ở người, bệnh Atopi,

• Quá mẫn typ II : Đặc điểm của quá mẫn typ này là sự tan hủy các tế bào mang kháng nguyên Các thể lâm sàng của quá mẫn typ II : Phản ứng truyền máu, tan hồng cầu do các nhóm kháng nguyên khác nhau, tan hồng cầu trong bệnh tự miễn, giảm các loại huyết cầu theo cơ chế tự miễn, bong mảnh ghép tối cấp

• Quá mẫn typ n i : Là loại quá mẫn do những tập hợp kháng thê kết hợp với kháng nguyên gọi là phức hợp miễn dịch tham gia vào vai trò bệnh sinh chủ đạo Các thể lâm sàng của quá mẫn typ n i : Bệnh huyết thanh, viêm cầu thận sau nhiễm khuẩn, viêm đa khớp dạng thấp, lupus ban đỏ hệ thống

• Quá mẫn typ IV : Còn gọi là quá mẫn muộn theo phân loại trước đây (phân biệt với quá mẫn nhanh ) Các thể lâm sàng của quá mẫn typ IV: Quá mẫn kiểu tuberculin, quá mẫn do tiếp xúc, phản ứng bong mảnh ghép, phản ứng tạo u hạt

Trong những trường họp bệnh lý trên việc làm giảm và hạn chế đáp ứng miễn dịch bằng các chất ức chế miễn dịch là cần thiết để tránh những hậu quả không mong muốn

+ Suy giảm miễn dịch [1,3,10]

Trái ngược với trang thái đáp ứng miễn dich quá mức, các tổn thương của một hay nhiều cấu thành nào đó thuộc hệ thống miễn dịch dẫn đến những rối loạn về mặt cấu trúc hay chức năng, có thể bẩm sinh hoặc mắc phải, mà hậu quả cuối cùng làm suy yếu một phần hay toàn bộ chức năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể với kháng nguyên, làm xuất hiện các hiện tượng bệnh

lý được gọi là suy giảm miễn dịch Dựa trên cơ sở sinh lý bệnh học, người

ta chia suy giảm miễn dịch thành hai nhóm :

• Suy giảm miễn dịch bẩm sinh : Suy giảm dòng limpho T, suy giảm dòng limpho B, hỗn hợp cả hai dòng limpho T và B, suy giảm các tế bào thực bào và bổ thể.

• Suy giảm miễn dịch mắc phải : thường do suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau điều trị thuốc ức chế miễn dịch, hoá trị liệu ung thư, chiếu xạ tủy xương, nhiễm virus HIV,

Trong trường hợp này người ta phải đưa vào cơ thể bị suy giảm miễn dịch các chất để tăng cường hoạt động chức năng của hệ miễn dịch

+ Đáp ứng miễn dịch lẫn lộn ( Bệnh tự miễn )[1,3,4]

Bệnh tự miễn (autoimmune disease ) là một trong ba nhóm lớn của bệnh lý miễn dịch mà tổn thương gây ra là đáp ứng miễn dịch chống lại các thành phần tổ chức của bản thân Bệnh gồm hai nhóm :

• Bệnh tự miễn đặc hiệu cơ quan : bệnh chỉ xuất hiện và cư trú ở một

cơ quan, ví dụ bệnh viêm tuyến giáp tự miễn Hasimoto

• Bệnh tự miễn không đặc hiệu cơ quan : còn gọi là bệnh tự miễn toàn thân, ví dụ bệnh Lupus ban đỏ hệ thống

1.1.2 Các thuốc ức chê miễn dịch

Do mục tiêu của đề tài, luận văn này chỉ tập trung vào các thuốc có tác dụng ức chế miễn dịch Có hai nhóm thuốc ức chế miễn dịch : ức chế miễndịch steroit và không steroit

1.1.2.1 Thuốc ức chê miễn dịch

Các thuốc có đặc điểm chung là trong cấu trúc hoá học có mang khung steroit Tác dung của thuốc là ngăn cản khả năng tăng sinh tế bào trong quá trình bệnh lý, ức chế phản ứng viêm miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, như ức chế khả năng bám dính của bạch cầu trung tính với các tế bào nội

mô mao mạch trong vùng bị viêm cũng như ức chế chức năng của đại thực bào và tế bào bạch cầu hạt trong việc tiêu diệt vi khuẩn[5,6,26] Cơ chế tác dụng của thuốc là khả năng liên kết của corticoit với receptor trong ADN nhân tế bào có thẩm quyền miễn dịch, chính liên kết này đã ngăn cản sự sao chép và tổng hợp ADN thành ARN và phong bế trực tiếp quá trình dịch mã sinh tổng hợp protein sau đó Các corticoit cũng ức chế trực tiếp lên tế bào limpho, ngoài ra chúng còn chống viêm.[ 2,6 ,21]

Các tác dụng phụ : tùy theo liều lượng và thời gian dùng thuốc mà có thể có

- Gây rối loạn tiêu hoá như tăng tiết axít, gây loét dạ dày tá tràng giảm tái tạo tế bào màng nhầy, đái tháo đường, nguy cơ nhiễm trùng, virus thứ phát, rối loạn tâm thần kinh, thường gây trạng thái hưng phấn kèm theo rối loạn giấc ngủ, có thể có thao cuồng hoặc co giật

- Gây rối loạn chuyển hoá, bệnh Cushing, loãng xương, cao huyết áp Với máu làm tăng bạch cầu hạt, giảm tế bào limpho và bạch cầu ái kiềm, tăng đông máu Có thể gây quái thai hoặc thai chết lưu Dùng liều lớn dài ngày có thể dẫn đến suy tuyến thượng thận [14,21,26]

1.1.2.2 Thuốc ức chê miễn dịch không steroit

Thuốc ức chế miễn dịch không steroit được chia N

azathioprin (Imuran - Glaxo Wellcome) [5,14]

1H - purin, 6-[( 1 - methyl - 4 - nitro - 1H - imidazol - 5 - yl)thio]- (2) Đây là thuốc có tác dụng chủ yếu trên các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, cụ thể là sản phẩm chuyển hoá trong cơ thể của nó là 6- mercaptopurin cạnh tranh với các enzym xúc tác cho quá trình tổng hợp axít nucleic Azathioprin tác dụng chủ yếu trên các tế bào limpho T Kết quả cuối cùng là ức chế tổng hợp axít nucleic Tuy vậy nhóm này có nhiều tác dụng phụ nguy hiểm như độc cho tủy xương, thiếu máu giảm bạch cầu, chán ăn, buồn nôn, ỉa chảy, rụng tóc, độc cho thai nhi, xơ hoá buồng trứng, mất tinh trùng Thuốc gây rối loạn chức năng gan, viêm thận, bàng quang,

có nguy cơ làm tăng các u ác tính nhất là u limpho và ung thư da.[17,26]

□ Nhóm alkyl hoá : busulfan, chlorambucil, cyclophosphamid, tiêu biểu

là cyclophosphamid (Endoxan - Asta )[ 14]

C yclophospham id có tên khoa học là 2-[bis-(2-chloroethyl)- aminotetrahydro-2H-1,2,3-oxazaphosphorine-2-oxide (3)

Cyclophosphamid không thể hiện tác dụng trên in vitro nhưng sản phẩm

chuyển hoá của nó trong cơ thể lại có hoạt tính Cyclophosphamid gây độc

tế bào thông qua việc chuyển các nhóm alkyl của nó tới các cấu thành tế

bào Sự alkyl hoá ở ADN bên trong nhân tế bào dẫn đến các thay đổi của

hoạt động nội bào và làm chết tế bào Có thể do Cyclophosphamid alkyl hoá các base guanine của ADN để hình thành liên kết chéo các chuỗi ADN

Do vậy ngoài tác dụng chính gây độc đối với tế bào khối u, cyclophosphamid còn gây nhiều tác dụng phụ nguy hiểm trên hệ miễn dịch, tạo máu, niêm mạc ruột, tế bào sinh sản Trên lâm sàng, cyclophosphamid

là thuốc ức chế chủ yếu chức năng của tế bào limpho B dẫn đến làm giảm tổng số tế bào limpho.[16,18,26]

□ Thuốc ức chế miễn dịch chọn lọc Cyclosporin A (Sandimmun - Novartis)

7

Cyclosporin A (CyA) là một peptit vòng, kỵ nước, trung tính chứa 11 axít

amin, được chiết từ một loại nấm có tên Tolypocladiurri inflatum Công thức

ị-MeBmt-Abu-Sar-MeLeu-V ar-M eLeu-Ala-D _Ala-M eLeu-

MeLeu-MeVưl-) (4)

CyA không tác dụng trên tế bào limpho B mà chỉ tác dụng trên tế bào limpho T nhạy cảm kháng nguyên ở giai đoạn G0 đến Gj và phong bế một cách chọn lọc khâu dịch mã của ARN thông qua quá trình gắn với cytophylin hoạt động như một peptidylpropyl isomerase, một enzym tham gia vào sự gấp protein Các tế bào có tua trình diện kháng nguyên đặc biệt nhạy cảm với thuốc này CyA cũng tác dụng trên nhóm các tế bào T4 làm chúng không sản xuất ra IL-2 khi bị hoạt hoá CyA có tác dụng chống lại sự huy động ion Ca2+ dự trữ của nội bào, cụ thể khi vào trong tế bào nó kết hợp với một chất gọi là immunophylin có trong bào tương và nhân, sau đó tác động lên calcineurin ở bên trong bào tương và ngăn cản sự hoạt động của các kênh ion Ca 2+ Tế bào sẽ bị ức chế và không được hoạt hoá nên không sản xuất ra EL-2 vì sự hoạt động này tùy thuộc vào nồng độ canxi trong nội bào CyA có tác dụng ức chế đặc hiệu phản ứng thải loại mảnh ghép bằng cách ức chế chọn lọc quần thể tế bào T4 Tác dụng phụ chủ yếu của CyA là gây độc với thận, ngoài ra thuốc có thể gây rối loạn tiêu hoá khi dùng liều cao bằng đường uống.[3,20,26,30,31]

□ Những phát hiện gần đây về các hợp chất tự nhiên có tác dụng ức chế

miễn dịch

Một sesterterpenetriol mới, được đặt tên là kobiin (5) và ba hợp chất 2- furanone mới, được đặt tên là các kobifuranone A, B, và c (6 , 7, và 8) đã

được tách từ một loại nấm Ascomycete có tên Gelasinospora kobi 5 là

thành phần chính có tác dụng ức chế miễn dịch trong khi 6, 7, và 8 là các

sản phẩm chuyển hoá của quá trình sinh tổng hợp trung gian thông thường qua con đường acetat-malonat.[19]

7 R = H

8 R = OH

Ba peptit vòng được tìm thấy trong khô dầu hạt lanh Đó là các cyclolinopeptit A (CLA) một peptit vòng có hoạt tính ức chế miễn dịch rõ rệt, B (CLB) và một peptit vòng mới, được đặt tên là CLX CLX có cấu tạo tương tự CLA, ngoài việc X là một axít amin lạ có công thức N-methyl-4- aminoproline Trật tự axít amin của CLX đã được xác đinh là (-Pro-Pro- Phe-Phe-Ile-Leu-Leu-X-) (9) Hoạt tính của CLX đang được nghiên cứu [29]

1.2 CÂY CHAY, M ỘT DƯỢC L IỆ U CÓ TÁC DỤNG ứ c CHÊ

M IỄN D ỊC H

1.2.1 Đặc điểm thực v ậ t :

Cây chay ( chay Bắc Bộ, chay vỏ tía ) có tên khoa học là Artocarpus

tonkinensis A Chev, thuộc họ Dâu tằm ( Moraceae ).

Cây gỗ cao 10 - 15m, thân thẳng nhẵn phân cành nhiều Cành non có lông nhung, sau nhẩn Lá mọc so le, xếp thành hai hàng, phiến to hình bầu dục thon hay hình trái xoan, dài từ 10-20cm, rộng từ 5-8cm, nhẵn, đầu nhọn hay hơi có đuôi, gốc tròn hay hình nêm, có lông bạc ở gân chính, mặt dưới có lông hoe, thưa, gân phụ 7-10 cặp, lồi ở mặt dưới, có lông hoe thưa Cuống dài l,5-2cm, lá bẹ nhỏ Hoa đơn độc ở nách lá, màu vàng nhạt Quả phức hình trái xoan hay gần tròn, khi chín màu vàng, cuống dài lcm Thịt quả mềm màu hồng vị chua Hạt to có nhựa dính.

Cây ra hoa vào tháng 3-4, quả chín vào tháng 7-9 Cây được trồng ở nhiều nơi để lấy quả ăn, vỏ rễ để ăn trầu.[7,12]

Theo Võ Văn Chi, ở Việt Nam còn có 3 loài chay khác cũng thuộc chi

Artocarpus [7] bao gồm :

- Chay (Artocarpus lakoocha Roxb.,) : Cây mọc hoang ở Lào Cai, Thanh Hoá, có được trồng ở Thảo cầm viên thành phố Hồ Chí Minh Dân gian chủ

yếu dùng vỏ và hạt Hạt làm thuốc sổ, vỏ cây tán bột đắp vết thương để rút

mủ, đắp mụn nhọt và các vết nẻ ở da Gỗ, quả sắc nước uống dùng trị giun đũa, giun kim, sán xơ mít, dùng ngoài trị ghẻ

- Chay Cúc Phương (Artocarpus petelotii Gagnep ) : Cây đặc hữu của Bắc

Việt Nam, mọc ở Lào Cai, Nam Hà, Ninh Bình, Thanh Hoá Rễ cũng dùng

ăn trầu như chay Bắc Bộ

- Chay lá bóng {Artocarpus nitidus Tréc Subsp Lingnanensis (Merr.)

Jair (A lingnanensis Merr.) ) : Cây mọc hoang trong rừng và đất khai

hoang ở Khánh Hoà, Đồng Nai; được trồng ở Hà Nội, Hải Phòng, v ỏ thân

và rễ dùng ăn trầu thay cho cau, quả ăn được Quả và rễ chữa phổi nóng, ho

ra máu, thổ huyết, khạc ra máu, đau họng, thiếu nước chua trong dạ dày, không muốn ăn

1.2.2 Thành phần hoá học

Cho đến nay chưa có công bố nào trên thế giới về thành phần hoá học của cây chay Ở Việt Nam nhóm nghiên cứu của Trần Văn Sung và cộng sự đã nghiên cứu thành phần hoá học của lá chay [25], Kết quả như sau :

+ Từ dịch chiết n-hexan đã tách và xác định được cấu trúc hoá học của các hợp chất triterpenoit

JJ

Lupeol (14)

(0,0006%)

p -amyrine acetate (15) (0,0038%)

11

Đáng chú ý là trong số 6 chất triterpenoit tlm thấy có 4 chất là dẫn xuất 3- acetoxy, một loại dẫn xuất ít thấy trong tự nhiên Chất 3-acetoxy-30- norlupane-20-one (3) và betulinic axít (4) gần đây được một nhóm nghiên círu tại Mỹ phát hiện có hoạt tính chống HIV Một loạt dẫn xuất mói của chúng đã được nghiên cứu tổng hợp bằng con đường hoá học để thử hoạt tính chống HIV [13],

+ Từ dịch chiết etyl axetat đã tách và xác định cấu trúc hoá học của các chất phenolic

ỌH

r ì

ho/ ^ ^ oH Resveratrol (19)

Artotonkin (20)

(0,0005%)

Chất flavonoit glycosit 16 và flavonoit 17 có phổ hoạt tính tương đối rộng, đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn Đáng chú ý là chất oxyresveratrol 18, một dẫn xuất của resveratrol có hoạt tính thú vị Năm 1997 một nhóm nghiên cứu tại Mỹ đã phát hiện ra hoạt tính chống ung thư, chống oxy hoá

và chống những gen gây đột biến của resveratrol, một phytoalexin được phân lập từ quả nho và một số thực phẩm khác [13]

Artotonkin 20 là một chất mới, được phân lập từ lá chay, đó là một chất dầu được tinh chế bằng sắc ký cột ngược pha RP-8 Cấu trúc của nó được xác đinh bằng cách kết hợp các phương pháp phổ

Ngoài ra nhóm nghiên cứu trên cũng đã xác định được các hỗn hợp sau đây trong lá chay [13]:

□ Hỗn hợp các hydrocacbon mạch dài có công thức C33H68, C31H64 và29^60'

□ Hỗn hợp sterol gồm campesterol, stigmasterol, sitosterol và fucosterol

□ Hỗn hợp các ancol no gồm C34H70O và € 32^ 0

□ Hỗn hợp các axít béo no gồm C34H680 2 và C32H64Ơ2

Từ dịch chiết cồn 70%, bằng các phương pháp sàng lọc đinh tính trên sắc

ký lóp mỏng và sắc ký giấy, nhóm nghiên cứu của Phan Chúc Lâm và cộng

sự đã xác đinh được sự có mặt của các thành phần sau : Các dẫn xuất indol, các axít phenol cacboxylic, các flavonoit, chất khử, axít amin , glucosamin, đường, lectin và không có các thành phần protein, glycoprotein, ancaloit, saponin [ 11]

+ Từ dịch sắc trong nước, bằng các phương pháp đinh tính trên sắc ký lớp mỏng, nhóm nghiên cứu trên đã xác định được các thành phần sau : Các dẫn xuất indol, các axít phenol cacboxylic, các flavonoit, chất khử, axít amin, glucosamin, đường, lectin, protein, glycoprotein và không có các thành phần ancaloit, saponin [ 11]

Từ hạt chay (Artocarpus tonkinensis) Nguyễn Khang và cộng sự đã chiết

tách và tinh chế được một lectin Đây là một glucoprotein trong đó phần protein được tạo thành từ hai chuỗi peptit có trọng lượng phân tử lần lượt là

18000 và 15000 dalton Thành phần và hàm lượng % các axít amin của mỗi chuỗi đã được xác định Kết quả được đem so sánh với lectin của hai loài

Artocarpus khác là Artocarpus heterophyllus (A.H) và Artocarpus altilis

(A.A) :

Bảng 1 : % Axít amin của hai chuỗi peptit 18000 dalton (18kDa A.T) và

15000 dalton (15kDa A.T) của lectin tronẹ Artocarpus tonkinensis so sánh với các peptit 15000 dalton (15kD A.H) và 12000 dalton (12kD A.H) của lectin trong Artocarpus heterophyllus và Artocarpus altilis (A.A)

Axít Amin 18kDaAT 15kDa AT 15kDa AH 12kDa AH AAAsparagin 8,9 9,5 9,2 9,1 9,0Threonin 5,7 6,1 6,7 7,3 7,9Serin 15,5 14,5 10,1 9,1 9,9Glutamin 16,9 16,0 8,4 7,3 7,1

Phenylalanin 2,5 2,5 5,9 6,4 7,1Histidin 1,9 2,0 0,8 0,9 0,7

Thành phần axít amin của lectin từ Artocarpus tonkinensis giống với thành

phần lectin từ các loài khác ngoại trừ tỷ lệ % rất thấp của các axít amin kị nước Sự giống nhau trong thành phần axít amin của hai chuỗi có thể do

chuỗi 15kDa là một đoạn sao chép của chuỗi 18kDa Một điều đặc biệt

trong cấu trúc phân tử lectin Artocarpus tonkinensis là nó tồn tại ở dạng dimer, khác với lectin của các loài Artocarpus khác thường tồn tại ở dạng

tetramer [23]

1.2.3 Tác dụng dược lý

Theo kinh nghiệm dân gian lá và rễ chay sắc uống có thể chữa đau lưng mỏi gối tê thấp, đặc biệt là bệnh liệt Khi khảo sát các trường hợp liệt được

chữa khỏi bằng lá chay thấy đó là bệnh nhược cơ ( Myasthenia gravis ), một

bệnh tự miễn dịch phải điều trị bằng các thuốc ức chế miễn dịch như : prednisolon, azathioprin hay cyclosporin A Như vậy nước sắc lá chay có thể chứa các chất có tác dụng ức chế miễn dịch

1.2.3.1 Nuôi cấy limpho hỗn hợp [11]

Đánh giá bằng hình thái học về tỷ lệ tế bào limpho chuyển dạng và tỷ lệ thu nhận H3-thymidin trong ADN của dịch chiết nước và dịch chiết cồn từ lá chay đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sandoz - Thụy Sĩ Kết quả :

Bảng 2 - Phản ứng limpho hỗn hợp (Phồng thí nghiệm MD - Sandoz )

C h ất th ử IC - 50 ((g/ml)Cyclosporin A

Dịch chiết nước

Dịch chiết cồn 70%

0,04570

> 166 ( không có tác dung )IC-50 : nồng độ có tác dụng ức chế 50% tế bào limpho

Kết quả cho thấy dịch chiết nước của lá chay( ĐYI ) có tác dụng ức chế miễn dịch nhưng cần liều cao hơn cyclosporin A (CyA) Dịch chiết cồn hoàn toàn không có tác dụng ức chế miễn dịch

1.2.3.2 Tác dụng của Đ YI trên bạch cầu [11]

15

So sánh số lượng bạch cầu, bạch cầu hạt, bạch cầu mono, limpho và NK ( Natural Killers ) ở nhóm chuột chứng và nhóm được dùng ĐYI.

Nhóm chứng : Chuột bình thường, nuôi cùng điều kiện thí nghiệm

Nhóm Đ Y I : Chuột được uống ĐYI ở dạng bột phun sương liều 0,03g/chuột trong 15 ngày liên tục Kết quả :

Bảng 3 - Ảnh hưởng của ĐYI trên bạch cầu

Nhóm n Tổng số BC BC mono BC limpho BC tủy Số NKChứng 30 14356+3969 435±343 6191+211 6087±2162 1062±906ĐYI 30 13505±2450 241±203 3976±1409 7466±2495 1825±625P2/1 < 0 ,5 < 0,01 < 10'5 < 0,02 < 10"8Kết quả cho thấy :

- Tổng số bạch cầu ở nhóm dùng ĐYI không có sự thay đổi so với nhóm

chứng

- Số lượng bạch cầu tủy và tế bào diệt tự nhiên NK gia tăng rõ r ệ t

- Số lượng tế bào dòng mono và dòng limpho ở nhóm ĐYI lại giảm so với nhóm chứng

Như vậy ĐYI một mặt có tác dụng ức chế miễn dịch đặc hiệu (là vai trò của bạch cầu mono và limpho ) mặt khác lại làm tăng miễn dịch không đặc hiệu (vai trò của bạch cầu tủy và tế bào NK )

1.2.3.3 Tác dụng ức c h ế thải ghép da dị gen [9]

Nhóm nghiên cứu của Phan Thị Phi Phi đã nghiên cứu tác dụng ức chế thải mảnh ghép da dị gen của dịch chiết nước lá chay (ĐYI) so sánh với cyclophosphamid (CY) và cyclosporin A (CyA) là hai thuốc ức chế miễn dịch chuẩn, sử dụng mô hình ghép da dị gen ở chuột Swiss và BALB/C Tiến hành như sau :

Nhóm chứng : n = 12, chuột được nuôi trong cùng điều kiện như các lô nghiệm

Nhóm chứng : n = 12, chuột được nuôi trong cùng điều kiện như các lô

nghiệm

Nhóm CY : tiêm cyclophosphamid liều đầu 200mg/kg Tiêm tiếp 20 ngày,

cách nhau 5 ngày liều 100mg/kg Tổng liều 600mg/kg

Nhóm CyA : tiêm cyclosporin A liều đầu l,5mg/kg Tiêm tiếp 20 ngày,

cách nhau 5 ngày liều 0,6mg/kg Tổng liều 4mg/kg

Nhóm ĐYI : uống ĐYI 15 ngày liên tục Tiếp tục cho uống đến ngày 20

Thời gian bắt đầu bong (ngày) 10 16 16 16

Thời gian bong hoàn toàn 13,6+2 21,3±2,7 21,8±3 21,8±3,1

Kết quả :

- Thời gian bắt đầu thải mảnh ghép ở các nhóm dùng thuốc là 16 ngày so

với nhóm chứng là 10 ngày

- Thời gian thải hoàn toàn mảnh ghép ở các nhóm dùng thuốc khoảng 21

ngày so với nhóm chứng là 13 ngày

- CY có tác dụng bảo vệ mảnh ghép da, kéo dài thời gian sống của mảnh

ghép nhưng tác dụng phụ rất xấu (giảm bạch cầu và tiểu cầu nặng )

Như vậy ĐYI có tác dụng ức chế thải ghép da dị gen và tác dụng này tương

đương với cyclophosphamid và cyclosporin A

có chuột chết, không có ỉa chảy, không có rối loạn vận động, chuột vẫn hoạt động bình thường.

1.2.4.2 Độc tính bán trường diễn :

+ Ảnh hưởng của chê phẩm ĐYI trên huyết áp động v ậ t:

Phương pháp gây hạ huyết áp theo TCVN 1025 -70 DĐVN, tập I, trang 754

+ Ảnh hưởng của thuốc trên dạ dày, gan, thận, p h ổ i:

Phương pháp là cho động vật uống thuốc liều cao trong thòi gian dài, so với nhóm chứng Theo dõi chuột chết, sự vận động của chuột và các triệu chứng ngộ độc

Kết quả :

- Không có chuột chết

- Chuột hoạt động bình thường, không có dấu hiệu gì đặc biệt

- Trong cùng chế đô chăm sóc, lô thử tăng cân nhanh hơn so với lôchứng, chênh lệch 6,14%, lông mượt hơn

- Các tổ chức gan, tim, thận, dạ dày, phổi không phát hiện dấu hiệu gì đặc biệt, phát triển với tỷ lệ sinh lý bình thường

Như vậy trên chuột cống trắng dùng liều tương đương với 50 lần liều dùng cho người, sau 7 ngày không phát hiện các triệu chứng ngộ độc, chuột tăngcân nhanh hơn so với lô chứng ( tỷ lệ 6,14% )

+ Ảnh hưởng của ĐYI trên thành phần của máu :

Phương pháp là kiểm tra máu của thỏ trước và sau 7 ngày cho uống ĐYI Liều dùng gấp 10 lần liều của người

K ết quả : Sau 7 ngày uống ĐYI liều cao, các thành phần của máu thỏ không có thay đổi gì rõ rệt

1.2.4.3 K ết luận :

- Nghiên cứu độc tính cấp cho thấy thuốc không độc với cơ thể động vật, không gây chết động vật ngay cả ở liều cao gấp 250 lần liều dùng cho người

- Nghiên cứu độc tính bán trường diễn cho thấy thuốc đạt yêu cầu DĐVN về kiểm nghiệm các chất gây hạ huyết áp Khi dùng thuốc ở liều cao gấp 50 lần liều dùng cho người trong 7 ngày, không thấy biểu hiện các triệu chứng ngộ độc và có tác dụng tăng trọng trên chuột cống trắng Thuốc không làm thay đổi thành phần của máu thỏ sau 7 ngày uống thuốc

1.2.5 Hiệu quả trên lâm sàng :

1.2.5.1 Mô hình nghiên cứu :

GS Phan Chúc Lâm [11] đã chọn mô hình điều trị bệnh nhược cơ

(Myasthenia gravis) bằng chế phẩm ĐYI (bột phun sương của dịch sắc

nước đóng viên nang 0,4g) từ nước sắc lá cây chay (Artocarpus

tonkinensis), so sánh với liệu pháp prednisolon và phẫu thuật cắt bỏ tuyến

ức để đánh giá tác dụng của chế phẩm ĐYI trên hệ miễn dịch Bệnh nhược

cơ được chọn vì ba lí do :

■ Bệnh nhược cơ được khẳng định là một bệnh tự miễn dịch có kháng thể kháng acetylcholine receptor (AchRs) lưu hành, phá hủy các AchRs ở màng sau của sinap thần kinh - cơ, dẫn tới chẹn dẫn truyền thần kinh -

cơ, gây liệt mỏi các cơ vân [4,8]

19

màng sau của sinap thần kinh - cơ, dẫn tới chẹn dẫn truyền thần kinh -

cơ, gây liệt mỏi các cơ vân [4,8]

■ Bệnh nhược cơ chỉ có một hướng điều trị là ức chế miễn dịch Hiện nay

có 3 biện pháp điều trị bệnh nhược cơ [8] :

□ Dùng thuốc ức chế miễn dịch prednisolon, azathioprin, cyclosporinA

□ Phẫu thuật cắt bỏ tuyến ức (thymus), các tế bào dạng cơ có trong tuyến ức là nguồn kháng nguyên tạo ra phản ứng tự miễn dịch trong tuyến ức

□ Thay huyết tương để hạ nhanh các kháng thể kháng AchRs lưu hành

□ Các thuốc anticholinesterase như pyridostigmin, neostigmin là những thuốc chữa triệu chứng, chỉ có tác dụng ngắn trong vài tiếng

- Bệnh nhược cơ có thể theo dõi đánh giá một cách dễ dàng trên lâm sàng qua các dấu hiệu sa mi, liệt vận nhãn, yếu các cơ mặt, nói giọng mũi, nuốt khó, yếu chân tay, nhưng các phản xạ gân xương vẫn còn kể cả ở các cơ bị yếu.[8]

Khỏi 15(48,38%) 13(48,01%) 12 (37,50%)

Đỡ 12(38,70%) 11(40,74%) 12(37,50%)Như cũ 4 (12,90%) 1 (3,7%) 6 (18,75%)

Kết quả cho thấy :

- Kết quả điều trị của nhóm I và II là tương đương nhau, không có sự khác biệt gì trên thống kê Như vậỵ chế phẩm ĐYI từ nước sắc lá cây chay có tác dụng ức chế miễn dịch tương tự prednisolon trong điều trị bệnh nhược cơ Kết quả của nhóm III chưa được so sánh vì kết quả phẫu thuật tuyến ức trong điều trị bệnh nhược cơ chỉ ổn định sau nhiều tháng, nhiều năm Do vậy những số liệu thu được trong vòng năm đầu sau phẫu thuật chưa được ổn định

- Chế phẩm ĐYI không gây tình trạng bội nhiễm trên các bệnh nhân uống ngày 6 viên ĐYI trong thời gian 2 tháng Có thể ĐYI đã không ức chế toàn bộ hệ miễn dịch như prednisolon mà vẫn tôn trọng khả năng chống nhiễm khuẩn thông thường của cơ thể

21

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Dược liệu là lá của cây chay, được thu hái tại chùa Nam Dư Hạ, xã Trần Phú, Thanh trì, Hà Nội Mâu cây đã được KS Ngô Văn Trại ( phòng Tài

nguyên thực vật - Viện Dược Liệu ) giám định là : Artocarpus tonkinensis

A.Chev ex Gagnep , họ Dâu tằm (Moraceae)

Tiêu bản mẫu lá hiện được lưu trữ tại phòng Tài nguyên thực vật - Viện Dược liêu

Lá có thể hái quanh năm, chọn những lá xanh tốt, không sâu bệnh Lá hái

về bỏ cành con, sấy khô ở nhiệt độ 50-60°C Lúc dùng mới đem xay nhỏ

H ình 1 : Ảnh chụp cây chay (trên) và lá cây chay ị dưới).

2.2 PHƯƠNG PHÁP NG HIÊN c ứ u

2.2.1 Các phương pháp nghiên cứu hoá học

2.2.1.1 Định lượng nỉtơbằng phương pháp Kendan (Kjeldahl) [15]

Nguyên tắc : dùng axít sunfuric đậm đặc vô cơ hoá nguyên liệu Các chất hữu cơ bị đốt cháy thành C 0 2, H20 , còn nitơ được chuyển thành amoni sunfat [(NH4)2SOJ

Cho NaOH tác dụng vói (NH4)2S 0 4 sẽ giải phóng NH3 NH3 bốc theo hơi nước chuyển tới một bình đựng H2S 0 4 chuẩn độ Chuẩn độ H2S 04 thừa bằng NaOH chuẩn độ

Làm song song một mẫu trắng để kiểm tra lượng NH3 trong nước, không lvhí và thuốc thử Hiệu số kết quả chuẩn độ giữa mẫu thử và mẫu trắng bằng lượng axít thực tế đã phản ứng với NH3 được giải phóng từ nguyên liệu đã

vô cơ hoá Từ đó tính ra lượng nitơ trong nguyên liệu

K để NaOH 40% từ phễu B vào bình phản ứng Đun lửa đều, cất khoảng 5 - 6 phút Kết thúc cất hạ bình chuẩn độ xuống dể sinh hàn không chạm vào lớp axít, cất thêm 3 phút.

- Chuẩn độ axít sunfuric N50 thừa : Dùng NaOH N/50 chuẩn độ axít sunfuric N/50 thừa Làm song song một mẫu trắng

- Tính kết quả : lm l axít sunfuric N/50 tương ứng với 0,28mg nitơ

H ình 2 : Thiết bị Kendan định lượng nitơ toàn phẩn

Thuốc thử :

- Hỗn hợp xúc tác : C11SO4 1 phần , K^so^ị 2 phần hoặc 200mg CuS04 và

1 tới 5mg HgO

- Chỉ thị màu Tashiro : khi dùng nhỏ riêng từng dung dịch : Đỏ metyl

0,1 % trong ancol và xanh metylen 0,1 % trong ancol

2.2.1.2 Xác định thành phần và hàm lượng của các axít amiỉi

Nguyên tắc : Nguyên liệu được thủy phân để cắt mạch thành các axít amin

tự do Điện di và sắc kí giấy dịch sau thủy phân sẽ cho sắc đồ của các vết axít amin So sánh sắc đổ thu được với sắc đổ chuẩn sẽ xác định được thành phần các axít amin trong hỗn hợp Trên giấy sắc kí đã phun thuốc thử ninhydrin cắt lấy các vết axít amin, đem thôi màu trong dung dịch CdCl2 0,5% rồi đo quang Làm song song với mẫu chuẩn để tính kết quả

Tiến hành :

1 Omg nguyên liệu được trộn với 10ml HC1 6N trong ống nghiệm Hút chân không rồi hàn kín ống Đun nóng liên tục ống nghiệm ở nhiệt độ 110°c trong 24h Sau phản ứng thu lấy sản phẩm :

- Trung hoà bằng Ca(OH)2 đến pH = 4-5

- ủ than hoạt trong vài giờ ở nhiệt độ ấm để hấp thụ muối có trong dịch

trung hoà

- Lọc lấy dịch trong có mầu vàng chanh

- Trung hoà tiếp dịch lọc điều chỉnh đến pH = 7

Sắc kí giấy :

- Pha chuẩn và mẫu trong isopropanol 10% với tỷ lệ 1/1 (mg/ml)

- Dùng hệ dung môi BuOH : Axít acetic : H20 = 4 : 1 : 5

- Sau khi chạy xong sấy nhẹ rồi nhuộm bằng ninhydrin 0,5% trong aceton Sấy nhẹ trong 5phút cho hiện màu

Định lượng bằng đo quang :

- Cắt những vùng giấy hiện màu trên sắc đồ cho vào các ống nghiệm khác nhau

25

- Cho vào mỗi ống nghiệm 4ml dung dịch CdCl2 0,5% bão hoà trong cồn 40% rổi bọc kín.

- ủ kín trong tối 3h

- Đưa ra đo quang phổ ở bước sóng X = 530nm.

2.2.2 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.2.2.1 Phản ứng nuôi cấy lỉmpho hỗn hợp (ỉn vitro)

Nguyên tắc : Mục đích của kỹ thuật là đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của tế bào khi có mặt một tác nhân bên ngoài Các tế bào limpho của hai cá thể khi nuôi cấy trong môi trường có mặt một số chất, sẽ bị kích thích trải qua quá trình biệt hoá và phân bào để chuyển thành các tế bào blast Sự đáp ứng chuyển dạng của tế bào limpho đi đôi với những biến đổi

về hình thể cũng như sự chuyển hoá của tế bào thì phụ thuộc vào tác dụng kích thích hay ức chế của tác nhân bên ngoài

Tiêu chuẩn của một tế bào blast như sau : kích thước to hơn bình thường, đường kính tế bào khoảng 10-12 ịim, nguyên sinh chất rộng bắt màu kiềm,

có vài không bào, nhân có 2-3 hạt, tỉ lệ nguyên sinh chất / nhân thì lớn

2.2.2.2 Thử tác dụng ức chê miễn dịch frên in vivo

Nguyên tắc : Thí nghiệm dựa trên một bệnh về hệ miễn dịch thường thấy ở

các loại gia cầm như gà Người ta phát hiện thấy có một loại virus gây ra các hội chứng suy giảm miễn dịch ở gia cầm và đặt tên là virus Gumboro Người ta cũng đã tìm ra đươc vaccin để phòng ngừa loai virus này bằng cách làm vô hoạt các virus cường độc Gumboro

Trong thí nghiêm, đầu tiên tiêm vaccin cho gà để tạo miễn dịch đổng thời cũng cho dùng cả chất thử ức chế miễn dịch Trong điều kiện bình thường thì sau 21 ngày gà sẽ đạt được trạng thái miễn dịch cao nhất Nhưng nếu dùng thuốc thử thì sẽ có suy giảm đáp ứng miễn dịch thông qua một số chỉ tiêu về huyết học như công thức bạch cầu, lượng protein toàn phần trong