Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế miễn dịch của lá cây chay

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO IỊỘ Y TẾ TRƯỜNC, ĐẠI I1ỌC Dược HẢ NỘI DS N G ô Q U Ố C ANH NGHIÊN CỨU TIIÀNII PHầ N h ó a h ọ c VÀ TÁC DỤNG ỨC CHế MIỄN DỊCH CỦA LÁ CÂY Ch AY ( Artocarpus tonkinensis A.Chev., Moraceae ) Luận văn Thạc sĩ Dược học Chuyên ngành : Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số : 02 03 Người 1lương dãn: IHỈS.TSKH T R ầ N HÀ NỘI - 2000 văn sung LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: P G S.T SK H TRẦN VĂN SUNG Viện Hoá, Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ Quốc Gia trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình, ln ln quan tâm, động viên đóng góp ý kiến q báu cho đường nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tói cán nghiên cứu thuộc phòng Tổng hợp hữu - Viện Hố phòng Miễn dịch - Viện Công nghệ Sinh học, trung tâm KHTN CNQG hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Đổng thời tồi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới GS TS PHAN THỊ PHI PHI cán nghiên cứu thuộc Labo Sinh học môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, trường Đại học Y Hà Nội hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS PHẠM THANH KỲ, PGS TS PHẠM QUANG TÙNG đọc góp ý kiến q báu để hồn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS PHẠM QUANG TÙNG, PGS TS BÙI KIM LIÊN thầy giáo phòng Đào tạo sau Đại học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới người thân gia đinh bạn bè luôn giúp đỡ, động viên, quan tâm tạo điều kiện cho suốt q trình học tập hồn thành đề tài Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2000 NGÔ QUỐC ANH MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ Ề CHƯƠNG I - TỔNG Q U A N 1.1 MỘT SỐ NÉT VỀ M Ễ N DỊCH HỌC VÀ THUỐC’ ú c CHẾ MIỄN DỊCH .3 1.2 CÂY CHAY , MỘT D ợ c LIỆU CÓ TÁC DỤNG ú c CHẾ MEEN d ịc h CHƯƠNG n - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 22 2A ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ú 2 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ú u 23 CHƯƠNG m — KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 NGHIÊN c ú u THÀNH PHAN HOÁ h ọ c v ho t t ín h s in h họ c : c ủ a d ịc h C H Ế T NƯỚC 3.2 NGHIÊN c ú u THÀNH PHAN HOÁ h ọ c v ho t t ín h s in h họ c : c ủ a d ịc h CHIẾT METHANOL 80% 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ N G H Ị 52 TÀI LIỆU THAM K H Ả O 54 ĐẬT VẤN ĐỂ Một đóng góp quan trọng miễn dịch học Y học việc phát chất điều hoà miễn dịch Các chất thuộc hai nhóm : nhóm có tác dụng hổi phục tăng cường tình trạng suy giảm miễn dịch nhóm có tác dụng ức chế tình trạng đáp ứng mức bình thường (q mẫn), thí dụ : - Nhóm chất kích thích miễn dịch : số có nguồn gốc sinh học lymphokin , interleukin, số khác có nguồn gốc từ vi sinh vật (BCG, corynebacterium parvum, ), thực vật (lectin, hợp chất tầm gửi, nhàu ) chất hoá học (LH1, levamisol, isoprinosin, ) [ 3] - Nhóm chất ức chế miễn dịch : Có nguồn gốc tổng họp cyclophosphamid, azathioprin, corticoid, có nguồn gốc từ chất chuyển hố nấm Tolypocladỉum cyclosporin A Hiện chất ức chế miễn dịch chia làm hai nhóm dựa theo cấu trúc hoá học : thuốc ức chế miễn dịch steroit không steroit.[3] Cùng với phát triển kỹ thuật ghép mô ngoại khoa việc tìm nguyên số bệnh nan y tình trạng đáp ứng mức bình thường (quá mẫn ) hệ miễn dịch việc tìm kiếm chất ức chế miễn dịch đẩy manh, kể chất ức chế miễn dịch tự nhiên hay tổng hợp Tuy nhiên biệt dược có tác dụng ức chế miễn dịch sử dụng đắt tiền có nhiều tác dụng phụ nguy hiểm diệt tế bào máu, tế bào miễn dịch tế bào niêm mạc ruột Do xu hướng tìm kiếm hoạt chất thiên nhiên từ nguồn gốc thảo mộc có tác dụng xấp xỉ biệt dược độc hơn, dễ dung nạp vào thể người cao tuổi người có bệnh mãn tính Với mong muốn tìm kiếm thuốc ức chế miễn dịch từ nguồn dược liệu nước, ý tới dược liệu chay, tên khoa học Artocarpus tonkinensis A Chev, thuộc họ dâu tằm Moraceae, mọc tự nhiên trồng phổ biến tỉnh trung du miền núi phía Bắc Theo kinh nghiệm dân gian, chay dùng dạng nước sắc để chữa bệnh đau lưng, yếu Giáo sư Phan Chúc Lâm (Bệnh viện Quân Y 108 ) dùng chế phẩm nước sắc chay (dạng bột phun sương ) điều trị thành công cho số bệnh nhân nhược tự miễn Chế phẩm chứng minh có hiệu ức chế miễn dịch rõ rệt in vitro in vivo kiểm nghiệm an tồn độc tính theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam I [9,11] Tuy mặt hoá học, chay chưa nghiên cứu nước ta giới Với hy vọng nâng cao hiệu điều trị tìm hoạt chất có hoạt tính ức chế miễn dịch từ chay, tiến hành đề tài nghiên cứu Nhiệm vụ luận văn : - Nghiên cứu phương pháp chiết tách khác để thu dịch chiết có hoạt tính ức chế miễn dịch từ chay - Từ dịch chiết có hoạt tính, tiến hành phương pháp sắc ký phương pháp tách để thu phân đoạn có hoạt tính cao - Nghiên cứu phương pháp thử hoạt tính ức chế miễn dịch thực nghiệm dùng cho dịch chiết phân đoạn từ chay CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 M ỘT SỐ NÉT VỂ M IỄN DỊCH HỌC VÀ THUỐC ứ c CHÊ MIỄN DỊCH Đáp ứng miễn dịch tượng sinh học đinh tính sống thể sống Cũng nhiều trình sinh học khác, đáp ứng miễn dịch thể ln điều hồ trì cân ổn định hai trình ức chế miễn dịch kích thích miễn dịch Nhờ thành tựu xuất sắc nghiên cứu miễn dịch học mà ngày hiểu biết tường tận chế trình đáp ứng miễn dịch chất nội sinh tham gia vào điều hoà miễn dịch thể Sự toàn vẹn hệ thống miễn dịch đảm bảo cho trình đáp ứng miễn dịch diễn bình thường Nhưng lý khác mà dẫn đến tổn thương hay nhiều yếu tố hệ miễn dịch dẫn đến rối loạn suy yếu chức đáp ứng miễn dịch thể, làm xuất hiện tượng bệnh lý 1.1.1 Bệnh lý đáp ứng miễn dịch Người ta xếp bệnh lý đáp ứng miễn dịch thành ba nhóm : đáp ứng miễn dịch mức, đáp ứng miễn dịch yếu, đáp ứng miễn dịch lẫn lộn + Đáp ứng miễn dịch mức [ 1,3] Các trạng thái bệnh lý miễn dịch xảy hệ thống miễn dịch hoạt động mức với kháng nguyên Đáp ứng đáp ứng miễn dịch thể dịch hay tế bào hai, kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng gây hậu xấu Có loại đáp ứng miễn dịch mẫn : • Quá mẫn typ I : Gồm mẫn tức khắc mẫn nhanh với thể lâm sàng sốc phản vệ người, bệnh Atopi, • Quá mẫn typ II : Đặc điểm mẫn typ tan hủy tế bào mang kháng nguyên Các thể lâm sàng mẫn typ II : Phản ứng truyền máu, tan hồng cầu nhóm kháng nguyên khác nhau, tan hồng cầu bệnh tự miễn, giảm loại huyết cầu theo chế tự miễn, bong mảnh ghép tối cấp • Quá mẫn typ n i : Là loại mẫn tập hợp kháng thê kết hợp với kháng nguyên gọi phức hợp miễn dịch tham gia vào vai trò bệnh sinh chủ đạo Các thể lâm sàng mẫn typ n i : Bệnh huyết thanh, viêm cầu thận sau nhiễm khuẩn, viêm đa khớp dạng thấp, lupus ban đỏ hệ thống • Quá mẫn typ IV : Còn gọi mẫn muộn theo phân loại trước (phân biệt với mẫn nhanh ) Các thể lâm sàng mẫn typ IV: Quá mẫn kiểu tuberculin, mẫn tiếp xúc, phản ứng bong mảnh ghép, phản ứng tạo u hạt Trong trường họp bệnh lý việc làm giảm hạn chế đáp ứng miễn dịch chất ức chế miễn dịch cần thiết để tránh hậu không mong muốn + Suy giảm miễn dịch [1,3,10] Trái ngược với trang thái đáp ứng miễn dich mức, tổn thương hay nhiều cấu thành thuộc hệ thống miễn dịch dẫn đến rối loạn mặt cấu trúc hay chức năng, bẩm sinh mắc phải, mà hậu cuối làm suy yếu phần hay toàn chức đáp ứng miễn dịch thể với kháng nguyên, làm xuất hiện tượng bệnh lý gọi suy giảm miễn dịch Dựa sở sinh lý bệnh học, người ta chia suy giảm miễn dịch thành hai nhóm : • Suy giảm miễn dịch bẩm sinh : Suy giảm dòng limpho T, suy giảm dòng limpho B, hỗn hợp hai dòng limpho T B, suy giảm tế bào thực bào bổ thể • Suy giảm miễn dịch mắc phải : thường suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau điều trị thuốc ức chế miễn dịch, hoá trị liệu ung thư, chiếu xạ tủy xương, nhiễm virus HIV, Trong trường hợp người ta phải đưa vào thể bị suy giảm miễn dịch chất để tăng cường hoạt động chức hệ miễn dịch + Đáp ứng miễn dịch lẫn lộn ( Bệnh tự miễn )[1,3,4] Bệnh tự miễn (autoimmune disease ) ba nhóm lớn bệnh lý miễn dịch mà tổn thương gây đáp ứng miễn dịch chống lại thành phần tổ chức thân Bệnh gồm hai nhóm : • Bệnh tự miễn đặc hiệu quan : bệnh xuất cư trú quan, ví dụ bệnh viêm tuyến giáp tự miễn Hasimoto • Bệnh tự miễn khơng đặc hiệu quan : gọi bệnh tự miễn tồn thân, ví dụ bệnh Lupus ban đỏ hệ thống 1.1.2 Các thuốc ức chê miễn dịch Do mục tiêu đề tài, luận văn tập trung vào thuốc có tác dụng ức chế miễn dịch Có hai nhóm thuốc ức chế miễn dịch : ức chế miễn dịch steroit không steroit CHo-OH 1.1.2.1 Thuốc ức chê miễn dịch o steroỉt Điển hình prednison [14] Pregna - 1,4-dien -3,11,20 - trion,17, 21 - dihydroxy- (1) Các thuốc có đặc điểm chung cấu trúc hố học có mang khung steroit Tác dung thuốc ngăn cản khả tăng sinh tế bào trình bệnh lý, ức chế phản ứng viêm miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu, ức chế khả bám dính bạch cầu trung tính với tế bào nội mô mao mạch vùng bị viêm ức chế chức đại thực bào tế bào bạch cầu hạt việc tiêu diệt vi khuẩn[5,6,26] Cơ chế tác dụng thuốc khả liên kết corticoit với receptor ADN nhân tế bào có thẩm quyền miễn dịch, liên kết ngăn cản chép tổng hợp ADN thành ARN phong bế trực tiếp trình dịch mã sinh tổng hợp protein sau Các corticoit ức chế trực tiếp lên tế bào limpho, ngồi chúng chống viêm.[ 2,6,21] Các tác dụng phụ : tùy theo liều lượng thời gian dùng thuốc mà có - Gây rối loạn tiêu hố tăng tiết axít, gây lt dày tá tràng giảm tái tạo tế bào màng nhầy, đái tháo đường, nguy nhiễm trùng, virus thứ phát, rối loạn tâm thần kinh, thường gây trạng thái hưng phấn kèm theo rối loạn giấc ngủ, có thao cuồng co giật - Gây rối loạn chuyển hoá, bệnh Cushing, loãng xương, cao huyết áp Với máu làm tăng bạch cầu hạt, giảm tế bào limpho bạch cầu kiềm, tăng đơng máu Có thể gây qi thai thai chết lưu Dùng liều lớn dài ngày dẫn đến suy tuyến thượng thận [14,21,26] N 1.1.2.2 Thuốc ức chê miễn dịch không steroit n - N O Thuốc ức chế miễn dịch không steroit chia N thành nhóm sau : d:H-j N □ Nhóm chống chuyển hố : - mecaptopurin, azathioprin, methotrexat, Điển hình I |J (2 ) N I H azathioprin (Imuran - Glaxo Wellcome) [5,14] 1H - purin, 6-[( - methyl - - nitro - 1H - imidazol - - yl)thio]- (2) Đây thuốc có tác dụng chủ yếu phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, cụ thể sản phẩm chuyển hố thể 6mercaptopurin cạnh tranh với enzym xúc tác cho q trình tổng hợp axít nucleic Azathioprin tác dụng chủ yếu tế bào limpho T Kết cuối ức chế tổng hợp axít nucleic Tuy nhóm có nhiều tác dụng phụ nguy hiểm độc cho tủy xương, thiếu máu giảm bạch cầu, chán ăn, buồn nơn, ỉa chảy, rụng tóc, độc cho thai nhi, xơ hoá buồng trứng, tinh trùng Thuốc gây rối loạn chức gan, viêm thận, bàng quang, có nguy làm tăng u ác tính u limpho ung thư da.[17,26] □ Nhóm alkyl hố : busulfan, chlorambucil, cyclophosphamid, tiêu biểu cyclophosphamid (Endoxan - Asta )[ 14] Cyclophospham id có tên khoa học 2-[bis-(2-chloroethyl)- aminotetrahydro-2H-1,2,3-oxazaphosphorine-2-oxide (3) Cyclophosphamid tác dụng in vitro sản phẩm chuyển hố thể lại có hoạt tính Cyclophosphamid gây độc tế bào thơng qua việc chuyển nhóm alkyl tới cấu thành tế bào Sự alkyl hố ADN bên nhân tế bào dẫn đến thay đổi hoạt động nội bào làm chết tế bào Có thể Cyclophosphamid alkyl hố base guanine ADN để hình thành liên kết chéo chuỗi ADN Do ngồi tác dụng gây độc tế bào khối u, cyclophosphamid gây nhiều tác dụng phụ nguy hiểm hệ miễn dịch, tạo máu, niêm mạc ruột, tế bào sinh sản Trên lâm sàng, cyclophosphamid thuốc ức chế chủ yếu chức tế bào limpho B dẫn đến làm giảm tổng số tế bào limpho.[16,18,26] □ Thuốc ức chế miễn dịch chọn lọc Cyclosporin A (Sandimmun Novartis) Lần : chạy hệ 1, đánh dấu tuyến dung mơi (a) soi đèn tử ngoại để khoanh tròn vết Lần : tiếp tục chạy mỏng với hệ đến tuyến dung môi (b) Hiện màu vết thuốc thử (a) (a) 8 ->(A) (b) > (B ) F7 F6 F7 Lần F6 Lần Hình 14 : sắc kỷ đồ so sánh F6 F7 Nhận x é t : - Với hệ phần lớn chất không di chuyển - Với hệ xuất vết di chuyển nhanh đường dung mơi Tuy vậy, dựa vào kích thước mức độ bắt màu với thuốc thử kết luận chất A hỗn hợp F6 chiết sang lớp BuOH, chất B nằm lại lóp nước - Với thuốc thử vanilin/H2S 04, vết A B F6 F7 bắt màu đỏ sậm; Tuy F6 F7 âm tính với thuốc thử ninhydrin - Với I2, vết A, B bắt màu vàng - Phổ IR (Hình 15) F7 giống F6 đa số peak, đặc biệt vị trí đặc trưng cho amit hydroxyl 42 Kết luận : Bằng phương pháp so sánh phổ IR sắc ký lớp mỏng , kết luận F7 chứa thành phần quan trọng F6 (vết A sắc ký đổ) a Xác đinh hàm lương nitơ tổng số F7 theo phương pháp Kendan: Kết : Định lượng nitơ toàn phần F7 khẳng định F7 nhóm hợp chất tự nhiên giàu nitơ (10g%) gồm liên kết amit Kết tương đương với hàm lượng nitơ trung bình số loại thực vật có chứa hợp chất peptit [22,24,27,28] Điều cho phép dự đốn lớp chất F7 peptit b Xác đinh thành phần, hàm lương axít amin F7 : Bảng : Thành phần, hàm lượng axít amin tronẹ F7 STT Axít amin mg/g g% Asparagin 1,236 0,1236 Serin 0,552 0,0552 Glutamic + Treonin 0,940 0,0940 Prolin 3,635 0,3650 Tyrozin 0,838 0,0838 Phenyl 0,981 0,0981 Izoleucin + Leucin 1,070 0,1070 Methionin + Valin 0,680 0,0680 Alanin 0,974 0,0974 10 Glycin 0,553 0,0553 11 Arginin + Histidin 0,504 0,0504 12 Ly sin 0,330 0,0330 Tổng sơ axít amin 12,300 1,2300 44 Ghi Hình 16: sắc đồ axít amin chuẩn (trên) axít amin F7 (dưới) Kết luận : Trong F7 có 16 axít amin thuộc nhóm 20 axít amin thơng thường, ngồi thấy có axít amin lạ khơng thuộc vào nhóm Như F7 tập hợp peptit thực vật, có gốc đường 45 (glucopeptit) Điều cần có nghiên cứu sâu để khẳng định thêm, cụ thể tách xác định trình tự axít amin peptit c.Tách thành phần F7 sắc ký cốt trẽn silicagel F7 (4,5g) tách sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ silicagel (250g), hệ dung môi rửa giải CHCl3-MeOH Các phân đoạn nhận biết sắc ký lớp mỏng silicagel với thuốc thử Vanilin/H2S 04 Kết thu phân đoạn sau tương ứng với tỷ lệ dung môi sử dụng : F71 (8 : 2), F72 (8 : 2), F73 (7 : 3), F74 (6 : 4), F75 (5 : 5), F76 (5 : 5) Sắc ký đồ q trình tách mơ tả hình 17 : & • C5 ft m F71 F72 -