Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng ức chế tế bào ung thư của cây dù dẻ tía

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC D NG ỨC CHẾ TÉ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY BÙ DẺ TÍA (IUVARIA GRANDIFLORA ROXB EX HORNEM - ANNONACEAE) ThS L ê T h ị B ích H iển* TĨM T T H ướ tịg dẫn; PG S.TS N guyễn T h ịH ài* Trong ơuố tứnh t m hiểu tri thức sử rfnncr câv th”ốc cửa đànơ Pak'"' Vân iTiẲn tính ^ ’’ảrg 'TVỈ /'â,r ^ *l& (Uvaria grandi ỉora) nghiến cứu sàng lọc cho thấy tác dụng gây độc tế bào ung thư (TBUT) mô h nh ỉn vitro Bài báo nhằm nghiên cứu thành phần hố học xác định hoạt tính óc chế TBUT phân đoạn hợp chât phân lập từ Bù đẻ tía Đối tượng nghiên cứu: Phần *nặt đất Bù dẻ tía thu hái tỉnh Quảng Trị Phương pháp nghiên cứu: Chiết xuất phương pháp ngâm chiết, chiết iỏng ­ lỏng, rắn ­ lỏng Phân lập phương pháp: sắc ký cột pha thường, pha đảo, sắc ký cột Sephadex LH­20 Theo dõi tr nh phân lập sắc ký lớp mỏng Xác định cấu trúc phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (’H­NMR, 13C­NMR, DEpT)’ hai chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY) phổ khối phun mù điện tử (ESI ­ MS) Xác định hoạt tinh UC chế TBƯT mô h nh in vitro Kết quả: Đắ phân lập hợp chất từ Bù đè tía Uvariỉactam, 3~O debenzoylzeylenon, Zeylenon Pipoxid Phân đoạn chloroform có hoạt tính gây độc TBƯT mạnh đòng TBƯT vú va ung thư đày với giá trị IC50 0,971 ng/mi 1,305 íig/ml Trong hợp chất phân lập được, hợp chat 3­O­debenzoyIzeylenon ức chế dòng TBUT phổi mạnh với giá trị ICso 1,30 đồng thời hợp chất ức chế dòng TBUT khác: ung thư biểu mô ung thư gan, ung thư đạ dày, ung thư đại tràng ung thư bạch cầu Kết luận: Phân đoạn choloroform có hoạt tính gây độc.tế bào mạnh phân đoạn từ Bù đẻ tía Đã phân lập hợp chất tị Bù đẻ tía, hợp chất 3­0­debenzoyIzeylenon có khả ức chế mạnh dịng TBUT * Từ khóa: Uvarìa grandỉflora\ Vvarilactam; 3­0­debenzoy zey enon; Zeylenon; Pipoxid Study on ch em ical com p ositio n an d inh ibitory activity o f ca n cer cell lines o fu v a r ia grandiflora roxb ex hornem ­ annonaceae Sum m ary in the process of learning knowledge of medicinal plants of Pako, Van Kieu ethnic in Quangtri Province Uvaria grandiflora has shown in vitro cytotoxic effects of cancer cells in our previous screening test This paper aims to study the chemical composition and to determine inhibitory activity of cancer cells of fragments and isolated compounds from Uvana grandiflora Materials: Above­ground parts of Uvaria grandifiora harvested in Quangtri province Method: Extraction methods: soaking extraction, liquid ­ liquid extraction, solid ­ liquid extraction Isolated by normal phase, reverse phase column chromatography and Sephadex LH­20 column chromatography Subscribe to isolation process by thin­layer chromatography Determining structure by the method of nuclear magnetic resonance spectroscopy: one ­ dimensional (1H­NMR, 13C­NMR, DEPT), two ­ dimensional (HMBC, HSQC, COSY NOESY) and electron spray mass spectrometry (ESI­MS) Determination inhibitory activity of cancer cells in in vitro models Results: compounds were isolated from Uvaria grandiflora including Uvarilactam, 3­O­debenzoylzeylenon Zeylenon and Pipoxid Chloroform fragment shows strongest cancer cells cytotoxic activity in breast cancer cell line and gastric cancer cel line with ICso values are 0,971 Mg/ml and 1,305 [lg/ml In isolated compounds, 3­O­debenzoyIzeyIenon has strongest^cytotoxic activity against lung cancer cell line with ICso 1,30 Mg/ml, and this compound also inWbits different cancer cell lines: epithelial cancer, liver cancer, stomach cancer, colon cancer and leukemia Conclusion: Choloroform fragment has strongest cancer cells cytotoxic activity among fragments from Uvaria grandfflora compounds were isolated from Uvaria grandiflora, in which 3.0­debenzoylzeyienon h i a strong abilfcv to inhibit cancer cell lines * Key words: Uvaria grandiflora; Uvarilactam; 3­O­debenzoylzeylenon; Zeylenon­ Pipoxid * Đại học Y Được H u 530 I Đ Ặ T VẤN © Việt N am quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao [1], nữa, cộng đồng dân tộc Việt Nam vốn có nhiều kinh nghiệm độc đáo sử dụng cỏ làm thuốc Tuy nhiên, sô loài đưa vào chiết xuất hợp chất làm thuốc hạn chế [4] Do vậy, nghiên cứu thuốc dựa tri thức địa hướng đầy tiềm Theo kết sàng lọc hoạt tính gây độc TBUT ỉn vitro số thuốc đồng bào Pako, V ân K iều Quảng Trị m khảo sát, địch chiết tồn phần Bù dẻ tía ( Uvarỉa grandiflora ­Annonaceae) thể hoạt mạnh có tính hướng đích dịng TBUT thử nghiệm [3] Tuy nhiên, V iệt Nam chưa có nhiều nghiên cứu lồi dược liệu V báo nhằm: N ghiên c ứu n h p hầ n hoá học th o định h ướ ng tác dụ ng sinh học xác định hoạt tính ức c h ế T B V T c ũ a p h â n đoạn hợ p c h ả ph â n lập từ c â y B ù d ẻ tía II ©Ĩĩ TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u Đổi tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu phần mặt đất Bù dẻ tía {Uvaria grandifiora Roxb ex Homem ­ Annonaceae) Mẩu thu huyện Đakrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng ­ 2011 Tên khoa học xác định TS Nguyên Thế Cường ­ Viện Sinh thái v Tài nguyên sinh vật ­ Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt Nam Các thử nghiệm tiến hành đòng TBUT: LU­1 (ung thư phổi người), KB (ung thư biểu mô), MDA­BA­321 (ung thư vú), Hep G2 (ung thư gan người), SW­480 (ung thư ruột kết) MKN7 (ung thư đày) Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp điều chế mẫu thử Phần mặt đất Bù dè tía phoi, sấy khô, xay thành bột m ịn (5 kg), sau chiết với methanol tuyệt đối pháp ngâm nhiệt độ phòng (1 tuần/lần X3 lần) Gộp dịch chiết, cất thu hồi đung môi đưới áp suất giảm thu cao toàn phần (m = 850g) Cao toàn phần phân tán vào nước chiết xuất phân đoạn phương pháp chiết lỏng­lỏng vỏi dung môi n ­ hexan, chloroform, ethyl acetat, butanol, thu địch chiết phân đoạn phần nước cịn lại c ấ t thu hồi đung mơi áp suất giảm thu cắn tương ứng 2.2 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào Phương pháp thử độ độc té bào in vitro [8] Viện Ung thư Quốc gia H oa Kỳ xác nhận phép thử độ độc tế bào chuẳn nhằm sàng lọc, phát chất có khả nấng k m hãm phát triển diệt TBUT điều kiện in vitro Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD ­ Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm sulforhodamin B (SRB) G iá trị OD máy đo tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein Khả ức chế sống sót tế bào xác định thông qua công thức: , % song sot [OD(chất thử) ­ OD(ngày 0)] X 100 OD(đối chửng âm DMSO 10%) ­ OD(ngày 0) % ức chế = 100% ­ % sống sót Các phép thử lặp ỉại lần EHipíiciue (Sigma) sử dụng làm chất đối chứng đương, DMSO 10% sử dụng làm đối chứng âm Giá trị ICso xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve Chât thử có IC 50 < 20 Ịig/mỉ (với chất chiết thô, với phân đoạn hóa học) IC 50 < {Ig/mỉ (với hoạt chất tinh khiết) xem có hoạt tính gây độc tế bào có khả ức chế phát triển diệt TBUT 2.3 Phương pháp nghiên u hoá học [2] Phân lập chất tinh khiết sắc ký cột silicagel pha thường (Silica gel 60 0,040 “ 0,063 mm (230 ­ 400 mesh ASTM), Merck); silicagel pha đảo YMC (30 ­ 50 jxm, FuJisilisa Chem ical Ltd.), Sephadex LH­20 531 Theo dõi tr nh phân lập sắc ký lớp mỏng pha thường, pha đảo (TLC­Silicagel 60 F 254 Merck, RP,a F 254, Merck) Phát vết chất đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nra 366 nm dùng thuốc thử dung địch H2SO 10% ethanol tuyệt đối Xác định cấu trúc hợp chất phân lập dựa phương pháp phổ bao gồm: phổ khối phun mù điện tử (ESI ­ MS) đo máy AGILENT 6310 Ion Trap; phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều ( H­NMR, 3C­NMR, DEPT) hai chiều (HMBC, HSQC, COSY, NOESY) đo máy Bruker Avance AM 500 FT­ NM R Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TTT P ẻ T ATT ỉ i r ì » TLT T T T i M ili 1\£ c nhóm Cyl cộng hưởng 5c 197,5 (C­6); c olefinic Sc 127,6 (C­5); 153,0 (C­4) nguyên tử c sp3 gắn với oxy ôc 63,3 (C­7); 70,2 (C­3); 75,7 (C­2); 77,2 (C ­l) Các tương tác COSY HMBC cho phép thiết lập vòng cạnh với nối đơi vị trí 4, 5; n h ó m 0X0 v ị t r í v c h ứ n g tỏ n h ó m C “7 n ố i v ó i C ­ l v v i nh ó m be n zoy lo x y Cấu h nh tương đối cùa UG LE1 xác định dựa vào việc phân tích số tương tác J kiện phổ NOESY Các kiện phổ NM R, MS cùa U G LE1 chứng tỏ họp chất có cấu trúc tương tự với hợp chất 3­0­debenzoylzeylenon tách từ loài Uvaria purpur a tnrớc [11] Khác biệt hai hợp chất 533 dấu suất quay cực ([a ]D) Theo tài liệu [7], 3­O­debenzoylzeylenon có [ặ ta = +12,5 họp chất U G LE có |a ] D = ­ 12,0 Điều chứng tỏ U G L E m ột đối quang -0 d e b e n z o y lz e y le n o n c ấ u trú c U G L E đ ợ c x c đ ịn h ( ­ ) ­ ­ ­ đ e b e n z o y lz e y le n o n H ợ p c h ấ t (UGC5): Bột màu trắng, tan teong aceton, methanol; Rf = 0,40 (hexan/aceton 2/1 methanol/nước 3/1) Phổ 'H ­N M R tín hiệu 10 proton aromatic khoảng 7,51 ­ 8,08 bao gồm doublet (J S5 8,0 Hz) v multiplet tương ứng với tín hiệu vùng s 128,7 ­ 165,6 phổ Ỉ3C~NMR Điều chứng tỏ tồn nhóm bezoyloxy phân tử Các phổ 1D­NMR tín hiệu rn ro tn n W QiB is­olgfin ic nr s 79 (Y7 vV« f\ 17 ( T C H ­0­) Sự có mặt i nhóm Cyl phân tử thể rõ qua tín hiệu ơc 195,1 Phổ H (H ~C O S Y tương tác cùa H­2/H­3, H­3/H­4, H­4/H­5 Phổ HM BC cho thấy H­7 tương tác với C ­l, C“2, C­6, C ­7 ’ chứng tỏ có nhóm benzoyloxy gắn vào vị trí c~7 Nhóm benzoyloxy cịn lại định vị vào C­3 có tương tác H­3/C­7” phổ HMBC T phân tích phù hợp số liệu phổ NMR UGC5 với số liệu phổ hợp chất Zeyienon công bố [6 ] cho phép khẳng định cấu trúc hóa học ƯGC5 Zeylenon H ọ p c h ấ t (UGC8): Bột màu trắng, tan tốt aceton, Rf K 0,30 (aceton/nước 2/1), 0,4 (hexan/aceton 5/2) Phổ 'iI­N M R ƯGC có diện cụm tín hiệu multiplet ứng với Ỉ0 proton (thuộc vòng thơm) khoảng s 7,49 ­ 8,10; cis proton olefinic s 5,91 6,14 (J = 10 Hz); proton nhóm methylenoxy (­CH 20 ­) s 4,91 4,57 với Jgem = 12,0 Hz; proton nhóm methinoxy (>CH~0­) khoảng s 3,66 ­ 5,63­ Phổ °C­N M R , DEPT 90, 135 có m ặt nhóm benzoyloxy vởi ngun tử c vịng thơm 129,6 ” 134,5 với nguyên tử c nằm nhóm cacboxyl 167,5 167,7 Tín hiệu nguyên tử c gắn với o thấy khoảng s 55,1 ­ 75,8 gồm I nhóm ­CH 20 ­ 63,7 nhóm >CH­0~ ỗ 55,1, 71 ,1,75 ,8 nguyên tử c bậc IV ỗ 61,0 Các đặc điểm phổ NMR chiều UGC chứng tỏ hợp chất đẫn xuất oxy hóa vịng cyclohexene So sánh kiện phổ cùa ƯGC với kiện phổ Pipoxid công bố tài liệu [10] cho thấy có trùng hợp hồn tồn Do ƯGC xác định Pipoxid Uvarilactam (1) Zeylenone (3) (­)­3­0­debenzoylzeylenon (2) Pipoxiđe (4) H nh c ấ ụ trúc hóa học hợp chất phân lập từ Bù dẻ tía 534 Tác dụng ốc chế TBUT cảa hợp ch t phân ỉập Các hợp chất phân lập xác định khả gây độc tế bào dòng TBƯT phổi LU­1 Kết thử nghiệm thể bảng Bảng Kết xác định giá trị IC 50 hợp chất phân lập dòng tế bào LU­1 % ứ c chế Nồng độ (Mg/ml) Hợp chất Hợp chất Hợp chất Hợp chất Ellipticine 16,66 1,30 37,63 26,19 0,67 IC 50 Trong hợp chất phân ỉập được, hợp chất ((­)­3­0~đebenzoyỉzeylenon) có hoạt tính m ạnh đòng tế bào LU­1 với giá trị IC 50 1,30 (Xg/ml Do xác định hợp chất có tác dụng ức chê phát triển TBUT dịng LƯ­1 Nhóm nghiên cứu tiếp tục xác định hoạt tính hợp chất dòng TBUT khác dòng tế bào thường 3T3, kết thể bảng Bảng 3, Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất (­)­3­0­đebenzoylzeyỉenon % ức chế Nồng độ (Mg/ml) I C 50 Nồng độ (M­g/ml) I C 50 HepG2 LNCaP MDA­BA­231 KB UGLE1 Ellipticine UGLE1 Ellipticine UGLE1 Ellipticine ƯGLE1 Elỉipticine 3,71 0,98 17,81 0,79 12,63 0,79 3,65 ,8 % ức chê HL­60 SW480 MKN7 3T3( Tế bào thường) UGLE1 Elỉipticine UGLE1 Ellipticine UGLE1 Ellipticine UGLE1 Ellipticine 2,40 0,94 3,13 0,78 1,73 0,72 7,19 0,31 Kêt cho thấy hợp chất (“ )­3­0­debenzoylzeylenon có khả ức chế nhiều dịng TBUT khác nhau, thơng qua khả ức chế 5/7 dịng tế bào thử nghiệm (với giá trị IC 50 < ỊXg/ml), bao gồm đòng tế bào: ung thư biểu mô KB, ung thư gan HepG2, ung thư dày M KN7, ung thư m ộ t kết SW480 ung thư bạch cầu HL­60 Trên đòng tế bào thường 3T3, hợp chất có giá trị IC 50 cao hom so vơi Ellipticine đến 23 lần, đồng thời giá trị IC 50 nằm ngưỡng gây độc tế bào ( > (J.g/ml) Điều chứng tỏ họp chất có tính an tồn cao Trong hợp chất phân iập, Uvarilactam lần t m thấy thành phần hóa học lồi Uvaria grandiflora Ưvariỉactam alcaloid thuộc nhóm Aristolactam M ột số hợp chất thuộc nhóm có khả gây độc TBUT [5] Trong đó, hợp chất Zeylenon, (“ )­3­0­đebenzoylzeylenon Pipoxid có cấu trúc thuộc nhóm Polyoxygenated cyclohexen Hiện nay, nhóm chất quan tâm nghiên cứu với hoạt tính ức chế TBUT M ột số dẫn chất Polyoxygenateđ cyclohexen phân lập từ chi Uvarìa c ó t c d ụ n g g ầ y đ ộ c c c d ò n g t ế b o k h ố i u n g i n h t ế b o K B , H C T ­ ( u n g t h r u ộ t k ế t ) , B e l 7402 (ung thư gan) A 2780 (ung thư buồng trứng) [9] Zeylenon chứng minh chất ức chế vận chuyển nucleosid TBƯT cổ trướng Ehrlich [6] Hợp chất thể tác dụng gây độc nhiều dòng tể bào khối u người tế bào HCT­8, BGC­823 (ung thư dày), Beỉ 7402, MCF­7 MCF­ 7/ADM (ung thư vứ), KB KB/VCR (ung thư biểu mô miệng) [6] Như hợp chất phân lập có cấu trúc thuộc hai nhóm Aristolactam Polyoxygenated cyclohexen nhóm chất có tác dụng ức chế nhiều đòng TBUT Đặc biệt hợp chất (~)­3­0­debenzoyizeylenon thể khả ức chế mạnh nhiều dòng TBƯT với giá trị IC50 thấp Kết m triển vọng cho việc nghiên cứu bán tổng hợp thuốc có tác dụng chống khối u từ hợp chất (­)­3­0­debenzoylzeylenon 535 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong phân đoạn dịch chiết từ Bù dẻ tía, phân đoạn chloroform có hoạt tính gây độc tể bào mạnh dòng TBƯT MDA­BA­321, MKN7 với giá trị IC 50 0,97 1,30 Jig/ml Từ phân đoạn chloroform phân lập hợp chất Uvarilactam, 3­O­debenzoylzeylenon, Zeyỉenon Pipoxid Trong hợp chất 3­0­đebenzoylzeyỉenon ức chế địng TBƯT L ­ l mạnh với IC 50 1,30 ng/ml, đồng thời hợp chất ức chế dòng TBUT: KB, HepG2, MKN7, SW480 HL­60 Các kêt nghiên cứu góp phần giải thích kinh nghiệm đùng thuốc quý giá đồng bào dận tộc cho thấy dứợc liệu cần nghiên cứu diên rôns mức độ­ sâu hon thành nhẩn hná Iwv* 'irb Kr.pt tírxU ci«u k™ Aẳ T • V ­ rv/ Miaut r **" ỈỈU“ iiyv Via iỉvttl lỉíiíi M iỉi iiyC UV V/U i u c ĩ lm ĩ ã hoạt chất có tác đụng diệt TBUT tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Tài nguyên Môi trường (2010), Báo cáo trạng môi trường quốc gia ­ Chuyên đề Đa dạng sinh học tr Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viểt Tựu (1985), Phư ng pháp nghiên cứu h a học thuốc, Nxb Y học, Thành phổ HỒ Chí Minh, tr 19­23,43­52, 58­74,243­283 Nguyễn Thị Hoài, Trịnh Thị Điệp, Đỗ Thị Thảo, Nguyễn Khánh Thuỳ Linh, Nguyễn Bích Hiền, Hồng Thị Diệu Hương (2012), “Sàng lọc hoạt tính điệt TBUT lĩiột số thuốc cùa đồng bào Pako, Vân Kiều Quang Tr?’ Tap chí Dược liệu, 17(2), tr 95­100 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội tr 67­ 69 Christophe Wiart (2012), “Lead compounds from medicinal plants for the treatment of cancer”, Acad mic Pr ss pp 40 Liao Yong Hong, Xu Li Zhen, Yang Shi Lin, Dai Jie, Zhen Yong Su, Zhu Min, and Sun Nail Jun (1997), “Three cyclohexene oxides from Uvaria grandiflora”, Phytoch mistry, 45(4), pp 729­732 Matthew J Palframan, Gabriele Kociok Kohn, Simon E Lewis (2012), “Photooxygenation of a microbial arene oxidation product and regioseiective Komblum­DeLamare rearrangement: Total synthesis of zeylenols and zeylenones” Ch mistry - A Europ an Journal, 18(15), pp 4766­4774 Monks A., Scudiero D , Skehan p., Shoemake R , Pauli K., Vistica D., Hose c „ Langley J., Cronise p., Campbell H., Mayo J., Boyd M (1991), “Feasibility of a high­flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines”, Journal o f National Canc r Institut , \ 1(83), pp 757­766 Pan Xi Ping, Yu Đ.Q (1997), “Studies on new cytotoxic annonaceous acetogenins from Uvaria grandiflora and absolute configurations”, Acta pharmac utica sinica, 32(4), pp 286­293 10­Ying Ma and Gui Qui Han (1993), "Cyclohexene epoxides from Piper polysyphorum”, Journal o f Chin s Pharmac utical Sci nc s, 2, pp 97­102 11 Yoshiiusa Takeuchi, Qing Wen Shi, Takeyoshi Sugiyama, Takayuki Oritani (200Ỉ), “Folyoxygenated Cyclohexenes from the Chinese tree, Uvaria purpur a”, Biosci nc Biot chnology and Bioch mistry, 66(3) pp 537 54 536 ... người), KB (ung thư biểu mô), MDA­BA­321 (ung thư vú), Hep G2 (ung thư gan người), SW­480 (ung thư ruột kết) MKN7 (ung thư đày) Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp điều chế mẫu thử Phần mặt đất... có khả ức chế nhiều dịng TBUT khác nhau, thơng qua khả ức chế 5/7 dịng tế bào thử nghiệm (với giá trị IC 50 < ỊXg/ml), bao gồm đòng tế bào: ung thư biểu mô KB, ung thư gan HepG2, ung thư dày... tính gây độc tế bào đòng tể bào M DA ­ BA ­ 321 (ung thư vú) MKN7 (ung thư dày) Kết tr nh bày bảng Bảng Kểt thử hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết phân đoạn đòng tể bào MDA­BA­ 321 vàM K N Nồng