Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng kháng kháng khuẩn của phương thuốc Tam Hoàng Thang
Trang 1Đặt vấn đề
Để tồn tại và phát triển, con ngời đã luôn tìm ra những phơng cách nhằmchống lại, hạn chế những tác động của thiên nhiên và môi trờng ảnh hởng đếnsức khoẻ của mình Một trong những phơng cách đó là sử dụng thuốc y học cổtruyền
Lúc đầu, con ngời sử dụng cây cỏ quanh mình để chữa bệnh theo kinhnghiệm bản thân Theo thời gian các kinh nghiệm đó đợc đúc kết lại thànhnhững nguyên tắc, lý luận tơng đối hoàn chỉnh, giúp việc sử dụng thuốc cổtruyền mang tính khoa học hơn
Hiện nay thuốc y học cổ truyền đã và đang trở thành một xu thế mạnhkhông chỉ ở nớc ta mà còn nhiều nớc trên thế giới Một số bệnh nan giải nhgan, thận, bệnh mạn tính cũng đợc chữa bằng thuốc cổ truyền cho kết quảtốt Vì thuốc cổ truyền có tác dụng điều hoà âm dơng, cân bằng sự hoạt độnggiữa các bộ phận trong cơ thể Mặt khác, khi sử dụng hầu nh không có tácdụng phụ
Để góp phần nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng của phơng thuốc,
chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng kháng kháng khuẩn của phơng thuốc tam hoàng thanG ” - một phơng thuốc
kinh điển của y học cổ truyền với mục tiêu sau đây:
1 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của phơng thuốc THT
2 Nghiên cứu tính kháng khuẩn của phơng thuốc THT
Phần 1 tổng quan
1.1 vàI nét về thuốc thang của yhct.
- Thuốc cổ truyền là một vị thuốc sống hoặc chín hay một chế phẩm thuốc đợcphối ngũ ( lập phơng ) và bào chế theo phơng pháp của YHCT từ một haynhiều vị thuốc có nguồn gốc thực vật, động vật, khoáng vật, có tác dụng chữabệnh hoặc có lợi cho sức khoẻ con ngời [2]
Trang 2- Trên thực tế, ngời ta thờng phối hợp các vị thuốc với nhau hơn là dùng riêng
lẻ Việc phối hợp thành phơng thuốc ( đặc biệt là thuốc thang ) nhằm làm tăngtác dụng, giảm độc tính trong điều trị bệnh
- Thuốc thang là một trong những dạng thuốc của YHCT đợc cấu tạo từ nhữngdợc liệu đã chế biến và đợc bào chế bằng cách sắc với nớc ở nhiệt độ bằnghoặc thấp hơn 1000C Thuốc thang có thể ngâm với rợu ở nhiệt độ thờng trongthời gian dài [7]
- Thuốc thang đợc hấp thu nhanh qua đờng tiêu hoá do đó đa lại hiệu quảnhanh, hay dùng trong bệnh cấp tính [7]
- Thuốc thang đợc cấu tạo dựa trên nguyên lý của YHCT, theo nguyên tắc có
đủ các thành phần: Quân ,Thần, Tá, Sứ [5]
1.2 phơng thuốc tam hoàng thang
THT là phơng thuốc kinh điển, đợc sử dụng chủ yếu trong các trờng hợpnhiệt nhập vào phần dinh, phần huyết, phần tâm bào, gây sốt cao, mê sảng, bấttỉnh, thần chí không ổn định, đôi khi phát cuồng co giật [2,5,8,17,18]
THT đợc cấu tạo từ 3 vị thuốc thuộc loại thanh nhiệt táo thấp Do 3 vị cómàu vàng nên có tên phơng THT
* Công thức của tht:
Hoàng Liên Hoàng Bá đồng lợngHoàng Cầm
Trong đó HL có tác dụng tả hoả ở tạng tâm, lại có thể dẫn thuốc đến các tạngphủ bị bệnh nên vừa là Quân vừa là Sứ HC có tác dụng tả hoả ở thợng tiêu, ởtạng phế, làm tăng tác dụng hạ sốt của HL; HB có tác dụng thanh nhiệt chủyếu ở hạ tiêu, bàng quang, làm tăng tác dụng hạ sốt của HL nên HC, HB vừa
- Không nên dùng với ngời âm h, tỳ h, tiết tả
- Các vị thuốc trong bài đều có vị rất đắng, do đó khi sử dụng cần chú ý vềliều lợng và thời gian sử dụng Không nên dùng liều cao kéo dài, vì sẽ làm têliệt thần kinh vị giác, gây cảm giác ăn không biết ngon hoặc buồn nôn [2,4]
Trang 3- Gần đây ngời ta đã bào chế dới dạng cải tiến – Viên nén.
* Một số bài thuốc có nguồn gốc từ phơng THT
Từ cổ phơng THT, các lơng y đã gia giảm tạo nên những phơng thuốc mớinh:
(1) Tam Hoàng Giải Độc Thang [17]
Hoàng bá 8g Chi tử 12g
Có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, giải độc ở tam tiêu Chủ trị phiền táo, nhiệt
độc, sốt cao, nôn ra máu, chảy máu cam
Bài thuốc còn có tên Hoàng Liên giải độc thang và đã đợc nghiên cứu về ảnhhởng của phơng pháp sắc đến hàm lợng hoạt chất trong bài [14]
(2) Tam Hoàng Cự Thắng Thang [17,18]
Hoàng Liên 3,2g Mang Tiêu 4g Thạch Cao 12g
Hoàng Bá 8g Chỉ Thực 8g Cam Thảo 3,2g
Hoàng Cầm 8g Đại Hoàng 8g
Có tác dụng trị dơng độc, phát cuồng, phiền khát, đại tiện táo bón, thở gấp (3) Tam Hoàng Thục Ngải Thang [17,18]
Lợng bằng nhau
Có tác dụng trị chứng đậu, sởi, ỉa chảy ra máu mủ hôi thối, cơ thể phát sốt,phiền khát
(4) Tam Hoàng Thạch Cao Thang [17,18]
Hoàng Liên 8g Huyền Sâm 4g Cam thảo 2,8gHoàng Cầm 6g
Có tác dụng trị tam tiêu thực nhiệt
* Hiện nay, Bệnh viện Y học Dân Tộc Cao Bằng đang sử bài thuốc có tên BộtTam Hoàng; trên cơ cở gia giảm một số vị thuốc của phơng THT để phòngnhiễm khuẩn sau khi thắt trĩ Bài thuốc có thành phần:
Hoàng Liên 1 kgHoàng Bá nam 1 kgHoàng Đằng 1 kgCuSO4 100 g
Trang 41.3 Các vị thuốc trong phơng.
1.3.1 Hoàng Liên
* Đặc điểm thực vật, phân bố, thu hái.
Có nhiều loại HL chân gà: Coptis chinensis Franch.; Coptis teeta Wall.;( 2 loài này có ở Việt nam [11] ); Coptis teetoides C.Y Cheng.; Coptisdeltoidea C.Y Cheng et Hsiao.; Coptis quinqueseeta W.T Wang., Coptisomeiensis ( Chen ) C.Y.Cheng, Họ Hoàng Liên-Ranunculaceae ở TrungQuốc có tất cả các loài HL trên
HL chân gà Coptis chinensis Franch.,
thuộc cây thảo, sống nhiều năm.Thân rễ
màu vàng thờng phân nhánh Lá có
cuống dài tập trung ở gốc, phiến lá chia
thành 3 thuỳ chính, mép răng ca không
đều Hoa nhỏ màu vàng mọc thành tụ
tán trên một cuống dài khoảng 25cm, có
khoảng 20 nhị, 8-12 lá noãn rời nhau
Quả đại [3,9,10,11,13,21]
HL thờng mọc ở vùng núi cao 1500-1800m ở nớc ta, HL mọc trên núiHoàng Liên Sơn ( Lào Cai ), Quảng Bạ ( Hà Giang ) ở Trung Quốc, HL mọchoang và trồng ở Vân Nam,Tứ Xuyên, Kiến Bình, Hồ Nam [3,13]
Sau khi trồng 4-5 năm, ngời ta đào cả cây, loại bỏ đất cát, cắt loại thân lá,
đem phơi, sấy khô rồi đóng gói
* Bộ phận dùng.
Thân rễ - Rhizoma Coptidis
Hình 1: Hoàng Liên
Trang 5Là những mẩu cong queo, dài 3-5cm, rộng 0,2-0,5cm, có nhiều đốt khúckhuỷu và phân nhánh nhiều Nhánh trông giống hình chân gà, mặt ngoài màuvàng nâu mang vết tích rễ phụ và cuống lá Thể chất cứng rắn, vết bẻ ngang không phẳng, phần gỗ màu vàng tơi, không mùi, vị rất đắng [1,3,6,20,21] Các loại HL khác, thân rễ màu vàng, ít phân nhánh cũng có bán trên thị trờngViệt Nam.
- Bột: Màu vàng ,vị rất đắng Dới tia tử ngoại có huỳnh quang màu vàng tơi.Soi kính hiển vi thấy: tế bào mô cứng hình tròn hay nhiều cạnh; hạt tinh bộthình trứng hay bầu dục; mảnh bần màu vàng nâu; mạch mạng; sợi có thành rấtdày [1,3,6]
Thân rễ HL chứa nhiều Alcaloid ( 5-8% ) trong đó chủ yếu là Berberin Ngoài
ra còn có Palmatin, Worenin, Coptisin, Jatrorizin, Magnoflorin, Columbamin,Urbenin, Acid ferulic [3,19,22]
Công thức cấu tạo của một số Alcaloid phân lập từ rễ HL:
Berberin R1+ R2 = - CH2 - Palmatin R1 = R2 = - CH3
Jatrorizin R1= - H
R2= - CH3 OCH
COOHCH
HO
Trang 6* Tác dụng sinh học của HL
- Tác dụng kháng khuẩn: Nớc sắc HL có phổ kháng khuẩn rất rộng Nớc sắcthể hiện tác dụng ức chế vi khuẩn ở những nồng độ pha loãng sau: nồng độ1:5120 có tác dụng trên Shigella shiga; nồng độ 1:2560 có tác dụng vớiShigella dysenteriae; nồng độ 1:1640 có tác dụng với Staphylococcus aureus;nồng độ 1:640 có tác dụng với Bacillus cholerae; nồng độ 1:80 với Bacilluscoli, Bacillus proteus; nồng độ 1:5 với Bacillus pyocyaneus [3]
Cơ chế tác dụng do Berberin ức chế sự tổng hợp ARN, protein và ngăn ngừa
sự chuyển hoá hydradcarbon của vi khuẩn
- HL có tác dụng tăng cờng hệ thống miễn dịch và quá trình thực bào; là tácnhân kháng độc tố, kháng viêm HL có thể gây hạ huyết áp do tác dụng vàothụ thể M ( muscarinic ) và làm giảm hoạt động của enzym cholinesterase HL
có tác dụng chống thiếu máu cục bộ ở não do giảm sự ngng kết tiểu cầu vàgiảm lợng Thomboxan A2 Nó tăng cờng chức năng tâm thất trái khi đã suyyếu bởi tính hớng cơ đặc hiệu và giãn mạch nhẹ toàn cơ thể [19]
- HL chế gừng có tác dụng hạ sốt tốt, HL chế giấm có tác dụng lợi mật tốt [1]
- Ngoài ra HL còn có tác dụng trên virus cúm, amip và một số nấm gây bệnhngoài da [14]
- Sản phẩm hydro hoá của Berberin là Tertrahydroberberin, có tác dụng anthần, mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [3]
Trang 7Theo đông y HL vị đắng tính hàn, qui vào 5 kinh: can, đởm, tâm, vị, đạitràng HL có tác dụng thanh nhiệt táo thấp, giải độc hạ hoả, chỉ huyết, thanhtâm trừ phiền, thanh can sáng mắt Dùng để chữa sốt cao, mê sảng, lỵ, tâm hoảthịnh, nôn ra máu, đau mắt đỏ, mất ngủ
Ngày dùng 2-12g dới dạng thuốc sắc hoặc bột [2,4,8,23,24]
1.3.2 Hoàng bá
* Đặc điểm thực vật, phân bố , thu hái.
Có 2 loài HB: Phellodendron amurense Rurp và Phellodendron chinenseSchneider, thuộc họ Cam - Rutaceae
HB thuộc cây gỗ, cao 10-25cm, cành
rất phát triển.Vỏ màu nâu hoặc màu
xám nhạt, vỏ phân thành hai lớp; lớp
bần dày có đờng rách dọc, lớp trong
màu vàng tơi Lá kép lông chim, có
khoảng 5-13 lá chét, mép lá có răng ca
Phần gốc của gân mang lông che chở
mềm Hoa nhỏ màu vàng, mẫu 5, đơn
tính khác gốc Quả mọng hình cầu
[3,7,10,13,21]
HB mọc hoang và trồng nhiều ở Trung Quốc, Xiberi Việt Nam đã di thực vàtrồng thí nghiệm thấy cây mọc tốt nhng cha trồng trên qui mô lớn, còn phảinhập của Trung Quốc [3]
Vỏ thu hái ở cây đã trồng trên 10 năm, thờng thu hái vào mùa hạ, cạo sạchlớp bần, cắt thành từng miếng phơi khô [3,13]
* Bộ phận dùng.
Vỏ thân, vỏ cành già - Cortex Phellodendri
Vỏ thân màu nâu, dày 0,3 - 0,5cm, dài 20 - 40cm, rộng 3-6 cm Mặt ngoài
có chỗ còn sót lại lớp bần mầu nâu đất, có những vết lõm sần sùi và rãnh dọc.Mặt trong màu nâu nhạt, có các vết nhăn dọc nhỏ, dài Vết bẻ lởm chởm màuvàng rơm.Thể chất chắc, nhẹ [3,7,20,21]
- Bột: Màu vàng tơi, vị rất đắng Soi kính hiển vi có: đám sợi màu vàng cóvách dày hoá gỗ; sợi chữa tinh thể hình lăng trụ; mảnh mô mềm với các tế bàohình tròn; mảnh bần màu vàng nâu hình chữ nhật [3,7]
* Chế biến.
Hình 2: Hoàng Bá
Trang 8HB đợc chế biến bằng nhiều cách khác nhau, cụ thể đợc chế thành: HB
phiến, HB sao, HB trích rợu, HB trích muối, HB thán [16]
* Thành phần hoá học.
Thành phần hoá học chính là Alcaloid trong đó chủ yếu là Berberin còn có
một lợng nhỏ Palmatin, Phellodendrin, Magnoflorin, Jatrorizin, Candixin,…
Ngoài ra còn có một hợp chất Sterolic, chất béo [3,19,22]
Công thức hoá học của một số chất trong cây:
* Tác dụng sinh học của Hoàng Bá.
- Tác dụng kháng khuẩn: HB có tác dụng kháng khuẩn tốt, đặc biệt tốt trên
Bạch hầu, Liên cầu, Tả, Lỵ, Salmonella [3,14,19]
- HB có tác dụng kích thích hoạt động thực bào của bạch cầu Nó có tác dụng
giãn mạch, tăng tuần hoàn vành, hạ huyết áp [15,19]
- Hợp chất Lacton trong HB có tác dụng ức chế thần kinh trung ơng và gây hạ
đờng huyết ở thỏ [13]
- Phellodendrin có tác dụng ức chế miễn dịch nhng khác Prednisolon và
Cyclophosphamid do không ảnh hởng đến sự sản xuất kháng thể của hồng cầu
cừu và chuột [19]
* Công dụng, liều dùng.
Theo đông y, HB vị đắng tính hàn quy vào 3 kinh: thận, bàng quang, tỳ
OHOCH
Trang 9HB có tác dụng t âm giáng hoả, thanh nhiệt táo thấp, giải độc tiêu viêm đợcdùng trong các trờng hợp âm h, phát sốt, hạ tiêu thấp nhiệt ( nh bàng quangthấp nhiệt dẫn đến tiểu tiện ngắn đỏ hoặc buốt rắt ), còn dùng khi cơ thể bịthấp chẩn, lở ngứa, mun nhọt.
Ngày dùng: 6 - 12 g dới dạng thuốc sắc hoặc thuốc bột [2,4,23,24]
1.3.3 hoàng cầm
* Đặc điểm thực vật, phân bố, thu hái
HC - Scutellaria baicalensis Georgi, Họ hoa môi - Lamiaceae
HC là cây thuộc thảo nhiều năm,
Là rễ cây HC Radix Scutellariae
Dợc liệu hình truỳ, vặn xoắn, dài 8 - 25 cm, đờng kính 1 - 3 cm Mặt ngoàimàu nâu vàng hoặc vàng thẫm, rải rác có vết rễ con hơi lồi Trên vỏ có nhữngvết dọc vặn vẹo hoặc vân dạng mạng Phần dới có các sọc dọc và các vết ngănnhỏ Thể chất chắc, dòn, dễ bẻ Mặt bẻ màu vàng thẫm, giữa có lõi màu nâu
đỏ Rễ già bên trong có bột vụn màu nâu hoặc đen nâu Dợc liệu bị ẩm sẽchuyển thành màu xanh vàng [3,7,20]
- Bột màu vàng hay màu nâu, vị đắng Soi kính hiển vi thấy: sợi rải rác hay tậptrung thành bó, hình thoi, thành dày, ống lỗ nhỏ; mảnh mô mềm chứa hạt tinhbột; tinh bột kép đôi hay kép ba; tế bào mô cứng có thành dày; mảng mạchchấm và mạch điểm [3,7]
Hình 3: Hoàng Cầm
Trang 10* Chế biến.
HC đợc chế biến bằng nhiều cách khác nhau, cụ thể đợc chế thành: HCphiến, HC tẩm rợu, HC sao tồn tính, HC sao cháy cạnh, HC trích mật, HCtrích gừng [16]
* Thành phần hoá học
Thành phần chính là flavonoid nh Baicalein, Baicalin, Scutellarein,Scutellarin, Wogonin, Wogonosid, 7- Metroxynorwogonin, Scullcapflavon I,
II Ngoài ra còn có Tanin thuộc nhóm Pyrocatechin, nhựa [3,19,22]
Công thức cấu tạo một số chất trong rễ Hoàng Cầm:
* Tác dụng sinh học của Hoàng Cầm.
- Tác dụng kháng khuẩn: HC có tác dụng trên Staphylococcus, Streptococcus,
E coli, Tả, Lỵ, Thơng hàn, Bạch hầu [3,13]
- Tác dụng chống Virus: HC có tác dụng ức chế đối với Virus Influenza [19]
- HC có tác dụng hạ nhiệt, chữa ho, lợi tiểu, an thần, hạ huyết áp [3,15]
- Baicalein có tác dụng hạ sốt yếu hơn Aspirin, còn là tác nhân kháng độc tố.Glycosid của Baicalein là baicalin có tác dụng chống viêm, chống khối u.Baicalin ngăn ngừa lây nhiễm HIV do ức chế HIV - 1 RT [19]
- Cả Baicalin và Baicalein đều có tác dụng bảo vệ hồng cầu tốt hơn tocoferol Ngoài ra Baicalein có tác dụng lợi mật tốt hơn Baicalin [19]
1= - HScutellarein R= - H; R1= - OHScutellarin R= - Gluc; R
Trang 11HC có tác dụng thanh thấp nhiệt, trừ hoả độc u tiên ở thợng tiêu ( tạng phế ),lơng huyết an thai; dùng cho các bệnh phế ung, phế có mủ, viêm phổi gâysốt cao Ngoài ra còn có tác dụng trừ thấp nhiệt ỏ vị tràng, thanh can nhiệt, chỉhuyết
Ngày dùng 6 - 15 g dới dạng thuốc sắc hoặc bột [2,4,23,24]
- Thân rễ HL Trung Quốc mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội
- Rễ HC (Scutellaria baicalensis Georgi) mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội
- Vỏ HB ( Phellodendron sp ) mua ở Phố Lãn Ông - Hà Nội
- Hoá chất đạt tiêu chuẩn phân tích mua tại CTTNHH hoá học ứng dụng- Phố
Lê Thánh Tông - Hà Nội
- Berberin chuẩn từ trung tâm kiểm nghiệm Sở Y Tế Hà Nội
- Palmatin chuẩn từ Bộ môn Dợc Liệu trờng Đại Học Dợc Hà nội
Trang 12- Các môi trờng dùng cho nghiên cứu kháng khuẩn đợc bào chế theo đúng tiêuchuẩn tại phòng thí nghiệm Vi Sinh - Kháng Sinh, Bộ môn Công nghiệp DợcTrờng Đại Học Dợc.
* Đối tợng nghiên cứu.
- Phơng thuốc THT đợc bào chế từ 3 loại dợc liệu: HL, HB, HC có cùng trọnglợng
- Khả năng kháng khuẩn của THT trên một số vi khuẩn kiểm định
* Dụng cụ thí nghiệm.
- Máy xác định độ ẩm dợc liệu “Precisa HA 6.0 ”
- Máy cất quay thu hồi dung môi “Buchi”
- Máy đo tử ngoại UV “Camag”
- Tủ sấy “Shellab” và “Memert”
- Nồi hấp tiệt trùng
- Các dụng cụ đo lờng đạt tiêu chuẩn kiểm định
2.2 Phơng pháp thực nghiệm
2.2.1 Sắc thuốc
Cân 15 g dợc liệu ( HL, HB, HC, THT ), thêm 90 ml nớc, đun sôi nhỏ lửatrong 1 giờ, gạn lấy dịch sắc Tiến hành sắc 3 lần, gộp các dịch sắc, cô nhỏ lửacòn 15 ml; đợc dịch sắc 1:1
2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học chính của phơng THT và từng vị thuốc
Trang 13+ Phản ứng với TT Dragendorff: 1 ml dịch chiết , thêm 2-3 giọt TT Nếu xuấthiện tủa màu da cam là phản ứng dơng tính.
+ Phản ứng với acid Picric: 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt TT Nếu xuất hiệntủa màu vàng là phản ứng dơng tính
+ Phản ứng với Acetat chì 30%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml Acetat chì Nếuthấy xuất hiện tủa nâu là phản ứng dơng tính
+ Phản ứng với FeCl3 5%: 1 ml dịch chiết, thêm 0,5 ml FeCl3 5% Nếu xuấthiện tủa màu xanh đen là phản ứng dơng tính
+ Phản ứng với NH3: nhỏ 1-2 giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khô, đem hơ trênhơi NH3 Nếu màu vàng tăng lên là phản ứng dơng tính
+ Phản ứng Cyanidin: 1ml dịch chiết, thêm 0,1g Mg, vài giọt HCL đặc, đuncách thuỷ vài phút Nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dơng tính
ml, ta đợc dịch phân tích
- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu
+ Cân 0,005 g Berberin chuẩn, hoà vào 1 ml chloroform
+ Cân 0,005 g Palmatin chuẩn, hoà vào 1 ml chloroform
- Chất hấp phụ:
Sử dụng Silicagel G của Merck, bản nhôm tráng sẵn Silicagel GF254 Merck
- Hệ dung môi khai triển
+ Hệ 1: Toluen : Aceton : Ethylacetat : Acid formic ( 5 :2 :2 :1 )
Trang 14+ HÖ 2: n-Butanol : Acid acetic : Níc ( 7 :1 :2 ).
- Dung dÞch hiÖn mµu
Dïng dÞch chiÕt trong ethylacetat nãi trªn
- ChÊt hÊp phô
Sö dông Silicagel G cña Merck, b¶n nh«m tr¸ng s½n Silicagel GF254 Merck
- HÖ dung m«i khai triÓn
+ HÖ 1: Toluen : Chloroform : Aceton ( 8 :5 :7 )
+ HÖ 2: Chloroform : Acid acetic ( 9:1 )
- Thuèc thö hiÖn mµu
Trang 15t thay đổi tuỳ thuộc độ tự do n-1 của mẫu
với P = 95% ta có t = 2,7762.2.3 nghiên cứu tính kháng khuẩn
Thí nghiệm đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Kháng sinh, Bộmôn công nghiệp Dợc Trờng Đại học Dợc Hà Nội theo phơng pháp sử dụngkhoanh giấy lọc
* Chủng vi khuẩn
10 chủng vi khuẩn đã sử dụng gồm:
- 5 chủng vi khuẩn Gram ( + ):
(x
i - x)2
n - 1
Trang 16Bacillus pumilus ATCC 10241 viết tắt là BP.
- 5 chủng vi khuẩn Gram ( - ):
* Môi trờng nuôi cấy vi khuẩn
Dùng môi trờng canh thang nuôi cấy vi khuẩn kiểm định
tr-* Chuẩn bị chế phẩm thử và mẫu thử
- Chuẩn bị chế phẩm thử
Sắc nh mục ( 2.2.1 ) ta đợc các dịch sắc: HL tỷ lệ 1:1, HB tỷ lệ 1:1, HC tỷ lệ1:1, THT tỷ lệ 1:1
- Mẫu thử
+ Dung dịch Penicillin G 30 UI = 18 g/ml
+ Dung dịch Gentamicin 20 UI = 20 g/ml
* Chuẩn bị khoanh giấy thử
- Đục khoanh giấy lọc có đờng kính D = 6,0 mm, khối lợng từ 33,5 - 34,0mg
- Hấp tiệt trùng các khoanh giấy ở nhiệt độ 117 - 1180C trong 30 phút, sau đósấy khô ở 600C trong khoảng 5 - 10 giờ
- Cho các khoanh giấy đã tiệt trùng vào 6 đĩa petri sạch khác nhau Mỗi đĩatẩm một trong các dịch: Pen, Gen, HL, HB, HC, THT Sau mỗi lần tẩm, đemsấy ở nhiệt độ 500C cho đến khô Tẩm 3 lần
Trang 17Kết quả: Mỗi khoanh giấy tẩm dịch sắc chứa khoảng 0,8g dợc liệu Mỗikhoanh giấy tẩm Pen chứa khoảng 1 UI kháng sinh Mỗi khoanh giấy tẩm Genchứa khoảng 0,7 UI kháng sinh.
* Chuẩn bị môi trờng thử kháng khuẩn
Sử dụng môi trờng thạch thờng có công thức:
* Thử tính kháng khuẩn
- Mỗi vi khuẩn làm trên 5 đĩa petri
- Trên mỗi đĩa petri đã đổ thạch, đặt các khoanh giấy đã tẩm kháng sinh vàdịch sắc theo sơ đồ:
Trong đó: KS : Khoanh giấy tẩm kháng sinh
HL : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Liên
HB : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Bá
THT : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Tam Hoàng Thang
.KS
HL
HB
.THT.HC
Trang 18HC : Khoanh giấy tẩm dịch sắc Hoàng Cầm Sau khi cấy, để vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 100C trong 2 giờ cho hoạt chấtkhuếch tán trong môi trờng thạch Sau đó để các hộp petri vào tủ ấm ở nhiệt
Vỏ HB có chiều dài không đồng nhất, dày 3- 4mm Mặt ngoài màu vàng lục
có vết rãnh dọc, bần sót lại màu vàng Mặt trong màu vàng sáng Thể chất
cứng, vết bẻ xơ, màu vàng tơi Dợc liệu gần nh không mùi, vị đắng.(hình4)