Nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây sói rừng ( sarcandra glabra ( thunb ) nakai họ hoa sói chloranthaceae)

Theo các tài liệu thu thập được, các tác giả nước ngoài đã công bố một số tác dụng sinh học của cây Sói rừng: * Zhong L và cộng sự [36] nghiên cứu ảnh hưởng của SG trên phòng và chữa bện

Bộ GIÁO DỰC VÀ ĐÀO TẠO B ộ YTẾ

đ ỗ THỊ OANH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

CÂY SÓI RỪNG

{Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai.

Họ Hoa sói - Chloranthaceae)

LUẬN VĂN • THẠC • s ĩ Dược • HỌC •

Lời cảm ơn

Sau thời gian nô lực nghiên cứu thực hiện đề tài, thời điếm hoàn thành luận văn là lúc tôi xỉn phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình đến những người đã hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suổt thời gian qua.

Trước hết, với lòng kỉnh trọng và biết ơn sâu sắc, tói xỉn được gửi lời

cảm on chân thành tới Nhà Giáo Nhân Dân GS.TS PHẠM THANH KỲ -

người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi trong suốt quả trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Bích Hằng - Phòng

Quản lý khoa học đã tận tĩnh hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi ừ-ong suốt quá trĩnh làm luận văn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược liệu, Bộ môn Dược cồ

truyền đã dạy dỗ, tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận vãn này.

Tôi cũng xin cảm ơn BGĐ B ệnh viện YH C T T W đã tạo điều kiện cho tôi được tiếp tục học tập và hoàn thành luận văn Và đặc biệt tôi xin gửi lời

cảm ơn đến TS.Nguyễn Thị Minh Tăm, Nguyên Trưởng Khoa Dược - B V

YH C T T W luôn động viên giúp đỡ tôi trong học tập và công tác.

Tôi xỉn cảm ơn TS Phan Văn Kiệm Viện hóa học các hợp chất thiên

nhiên, xỉn cảm ơn PGS.TS Nguyễn Trọng Thông, Th.s Phạm Thị Vân Anh

- Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y H à Nội đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận

văn.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ ng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kỉnh yêu, những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và chăm lo cho tôi trong cuộc sổng và sự nghiệp.

Xỉn chân thành cảm ơn!

Hà nôi, thảng 9 năm 2010

ĐỖ THỊ OANH

Proton Magnetic Resonance SpectroscopyPhổ cộng hưỏmg từ hạt nhân hai chiều Two-Dimensional NMR

Tetra carbon cloruaDịch chiết

DimethylsulfoxideDistortionless Enhancement by Polarisation TransferElectrospray Ionisation-Mass Spectrometry

Ethyl acetatEthanolHeteronuclear Multiple Bond ConnectivityHeteronuclear Single Quantum CoherencePhổ hồng ngoại

Infrared Spectroscopy

M Ụ C L Ụ C

ĐẶT VẤN ĐÈ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN B ố CỦA CÂY SÓI RỪNG 2

1.1.1.Đặc điểm thực vật của cây Sói rừng (Sarcandra glabra ( Thunb.) 2

Nakai 2

1.1.2.Sự phân bố của cây Sói rừng 2

1.2.THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY SÓI RỪ N G 2

1.3.TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CẦY SÓI RỪNG 5

1.4.CÔNG D Ụ N G 6

1.5.VÀI NÉT VÈ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẨU TRÚC HỢP CHẤT HỮU C ơ 9

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) 9

1.5.2 Phổ khối lượng ( Mass Spectroscopy) 10

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, N M R ) 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PH Á P 15

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN c ứ u 15

2.2 ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 15

2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u 16

2.3.1 Hóa chất: 16

2.3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 16

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ú tJ 16

2.4.1 Nghiên cứu về thành phần hóa h ọ c 16

2.4.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh h ọ c 17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CÚtJ 19

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN cử u VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 19

3.1.1 Định tính các nhóm chất bằng các phản ứng hóa học 19

3.1.2 Chiết xuất các chất trong dược liệu Sói Rừng 26

3.1.3 Phân lập các hợp chất 27

3.1.4 Nhận dạng các hợp chất phân lập được 29

3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VỀ TÁC DỤNG SINH H Ọ C 39

3.2.1 Kết quả thử độc tính cấp 39

3.2.2 Tác dụng chống viêm cấp 41

3.2.3 Tác dụng bảo vệ gan 42

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 56

KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC

Bảng 3.6 Số chuột chết ở các lô nghiên cứu

Bảng 3.7 Tác dụng của cao lỏng Sói rừng lên thể tích dịch rỉ viêm Bảng 3.8 Tác dụng của cao lỏng Sói rừng lên hàm lưọng

protein trong dịch rỉ viêm

Bảng 3.9 Tác dụng của cao lỏng Sói rừng lên số lượng bạch cầu

trong dịch rỉ viêm

Bảng 3.10 Anh hưởng của cao lỏng Sói rừng lên trọng lượng gan chuột

bị gây độc bằng paracetamol

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cao lỏng Sói rừng lên hoạt độ AST

trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng paracetamol

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của cao lỏng Sói rừng lên hoạt độ ALT

trong huyết thanh bị gây độc bằng paracetamol Bảng 3.13 Anh hưởng của cao lỏng Sói rừng lên hàm lưọng MDA

gan chuột nhắt bị gây độc bằng paracetamol

DANH MỤC HÌNH •

Hình 1.1 Flamasol

Hình 1.2 Hoàng thấp linh

Hình 1.3 Tiêu khiết thanh

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ Sói rừng

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Sói rừng

Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của SR (1) và 8Ị3,9a-dihydroxylindan-4(5),7(l 1)-

Hình 3.3 Các tương tác HMBC chính của SR

Hình 3.4 Cấu hình không gian và các tương tác NOESY chính của SR

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của SRl (2), lị3,4|3,7p,l 1-tetrahydroxyeudesmane

(2a) và (-)-7aH -eudesm ane-l p ,4 a ,l 1-triol (2b)

Hình 3.6 Các tương tác HMBC chính của SRl

Hình 3.7 Cấu hình không gian và các tương tác NOESY chính của SRl

Hình 3.8 Cấu trúc hóa học của SR2 và sarcaglaboside G

Hình 3.9 Các tương tác HMBC chính của SR2

ĐẶT VẤN ĐÈ

Việt nam là quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có thảm thực vật phong phú và đa dạng do đó có nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào Nhân dân ta cũng đã tích luỹ được rất nhiều kinh nghiệm, tri thức quý báu về phòng và chữa bệnh bằng cây cỏ Sói rừng là cây mọc hoang ở vùngnúi đất, ở bìa rừng và ven đồi ẩm nhiều nơi như: Lạng sơn, Bắc thái, Hoàbình Cây cũng được trồng để lấy hoa ướp trà Hiện nay ở Trung quốc cây Sói rừng đã được dùng chữa: ung thư tuỵ, dạ dày, trực tràng, gan, cuống họng còn dân gian thì dùng rễ ngâm rượu uống chữa ngực đau tức, lá giã đắp chữa rắn cắn, lá sắc uống trị ho lao .[7],[8],[9],[14],[15]

Tuy vậy ở Việt nam cho tới nay các công trình nghiên cứu về cây Sói rừng còn rất ít và chưa đầy đủ, do đó trong luận văn ứiực hiện đề tài: “Nghiên

cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Sói rừng -

Sarcandra glabra ( Thunb.) Nakai., họ Hoa sói - Chloranthaceae.” với các

mục tiêu sau:

1 về thành phần hoá học:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong cây.

- Chiết xuất và phân lập m ột sổ chất chính.

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỤC VẬT VÀ PHÂN BÓ CỦA CÂY SÓI RỪNG

1.1.1 Đặc điểm thực vật của cây Sói rừng {Sarcandra glabra ( Thunb.)

Nakai.

Cây nhỏ cao 1 - 2m, nhánh tròn, không lông Lá mọc đối, có phiến dài xoan bầu dục, dài 7 - 18cm, rộng 2 - 7cm, đầu nhọn, mép có răng nhọn, gân

màu trắng, không cuống, nhị l.[8][9]

1.1.2 Sự phân bố của cây Sói rừng

Triều Tiên, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam và Malaixia Cây có thể mọc hoang hoặc cũng được trồng để ưóp trà và làm thuốc

ở Việt Nam, cây mọc hoang ở vùng núi đất, ở bìa rừng và ven đồi ẩm nhiều nơi: Lạng sơn, Thái Nguyên, Hoà Bình, Hà Tây đến Kontum, Lâm Đồng Thu hái toàn cây vào mùa hạ, thu, dùng tươi hay phơi khô trong râm

Rễ thu hái quanh năm, rửa sạch cắt đoạn, phơi trong râm, cũng có thể dùng tươi

1.2 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY SÓI RỪNG

phenol, flavon, cyanogen

Theo các tài liệu thu thập được, các tác giả nước ngoài đã công bố một

số thành phần hóa học trong cây Sói rừng:

* Theo Bohlmann F và cộng sự [18],[19] đã phân lập được các chất: Shizukanolid, Dehydroshizukanolid, Shizukanolid B, Chloranthalactone A và

:o

* Theo Wang A và cộng sự [31] từ lá của Sarcandra glabra chiết

Ketone; (-)- Istanbulin A; 1,8 - dihydroxy - 7(11) - eremophilen - 12,8 olid; (l|3,8aOH) - form, 1 - Ketone)

OH

:o

* Tác giả Luo YM và cộng sự [30] đã phân lập được 2 saponin

được xác định là 3 beta, 19 alpha, 20 beta - trihydroxyurs -11, 13 (18) - diene

glucopyranosyl ( l- > 3 ) - [alpha - L - rhamnopyranosyl (1—>2)] - beta -D- xylopyranosyl-pomolic acid 28 - 0-beta-D-glucopyranosyl ester

* Li Y, Zhang DM và cộng sự [29] đã phân lập được 6 glycosid

sesquiterpen aglycon, cùng với 1 hợp chất đã biết, chloranosid A từ toàn cây

* Yuan K, Zhu JX và cộng sự [35] nghiên cứu dịch chiết n-butanol của

Sarcandra glabra, bằng phương pháp sắc ký cột Diaion íiP-20, Sephadex

LH-20, MCI CHP-20 và silicagel đã phân lập được 7 hợp chất là 5, 7, 3', 4'-

- D-glucuronid, fraxidin, isofraxidin, isofraxidin-7-O-beta-D-glucopyranosid, kaempferol, pinostrobin

* Huang MJ, Zeng GY và cộng sự [26] đã phân lập được; 5 flavonoid

glucuronid , quercetin-3-O-beta-D-glucuronopyranosid methyl ester, 5, 7, 4'-

caffeoylquinic acid methyl ester, 3, 4-dihydroxybenzoic acid, isofraxidin

* Zhu LP, Li Y và cộng sự [37] đã phân lập được 2 lacton sesquiterpen mới, 2 sesquiterpen đã biết là atractylenolid beta, chloranthalactone E, và hợp

9alpha-dihydroxylindan-4(5),(l l)-dien-8alpha,12-olid

là: 4, 4'-biisofraxidin, esculetin, fraxetin, scoparon, isofraxidin, scopoletin

* Hu XR, Yang JS, Xu XD [25] nghiên cứu cây Sói Rừng (S glabra.)

alpha-hydroxy -5 alpha H -lindan-7(ll)-en-8alpha, 12-olid-15-0-beta-D-

-7(11) - en- 8 alpha, 12-olid-15-0-beta-D-glucopyranosid (sarcaglaboside G),

beta-D-glucopyranosid (sarcaglabosid H), cùng với 5 họp chất đã biết: chloranosidA, sarcaglabosidC, dihydrovomifoliol-0-beta-D-glucopyranosid, 9-hydroxy-heterogorgiolid và chloranthalacton B

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY SÓI RỪNG

Trong “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi ghi: Sói rừng có

vị đắng, cay, tính hơi ấm, cũng có độc, có tác dụng hoạt huyết, giảm đau, khư phong trừ thấp, tiêu viêm giải độc

Theo các tài liệu thu thập được, các tác giả nước ngoài đã công bố một

số tác dụng sinh học của cây Sói rừng:

* Zhong L và cộng sự [36] nghiên cứu ảnh hưởng của SG trên phòng và chữa bệnh giảm tiểu cầu sau hóa trị liệu Kết quả thí nghiệm đã chứng minh:

s glabra có tác dụng rõ rệt trong điều trị giảm tiểu cầu và có thể ngăn ngừa chứng giảm tiểu cầu gây ra bởi 5-FU

* Kang M và cộng sự [27] nghiên cứu tác dụng ức chế khối u của dịch chiết s glabra và gây chết tế bào theo chương trình của dòng té bào gây ung thư biểu mô mũi - họng ở người cấy dưới da ở chuột trụi lông Kết quả cho thấy dịch chiết Sói Rừng ngăn cản sự phát triển khối u in vivo

* Yuan K, Zhu JX và cộng sự [35] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn dịch chiết n - butanol của s glabra Kết quả cho thấy đưÒTig kính vòng vô

isofraxidin-7-O-beta-D-glucopyranosid, kaempferol được ghi lại có thứ tự là 14.67 ± 0.08, 11.14 ± 1.06, 8.26 ± 1.26

* Xu XD, Hu XR và cộng sự [34] nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của SG Kết quả thực nghiệm cho thấy phân đoạn chloroform và EtOAc của dịch chiết EtOH toàn cây SG, có tác dụng kháng khuẩn mạnh.

* Li WY và cộng sự [27] nghiên cứu tác dụng ức chế tế bào ung thư của dịch chiết EtOH Kết quả cho thấy dịch chiết EtOAc có tác dụng ức chế dòng

tế bào bạch cầu HL-60 trên in vivo với IC50=58 microg/ml

glabra trên hệ miễn dịch ở chuột Ket quả thí nghiệm cho thấy dịch chiết Sói Rừng có liên quan tới sự cân bằng của tế bào T, làm tăng phần trăm NK và hiệu quả bảo vệ theo kiểu miễn dịch ở chuột bị ức chế có thể thông qua sự cải thiện tỉ lệ và số lưọng tế bào miễn dịch

* He RR, Yao x s và cộng sự [23] nghiên cứu tác dụng của dịch chiết

SG, trên phản ứng miễn dịch bao gồm hoạt động tế bào diệt tự nhiên NK và khả năng chống oxy hóa của nó trên tế bào lá lách ở chuột Kết quả cho thấy

sự điều trị bằng đường uống hàng ngày SG (125.500 mg/kg/ngày) trong 5 ngày liên tiếp đã làm giảm sự sản xuất tế bào lympho gây stress, sự cân bằng

cũng giảm rõ rệt mức độ peroxid hóa lipid và tăng khả năng hấp thu cơ bản oxygen trong tế bào lách Những kết quả này nhấn mạnh rằng SG điều chỉnh đáp ứng miễn dịch làm giảm stress, phần nào được giải thích bằng sự cải thiện khả năng chống oxy hóa trong tế bào miễn dịch

ruột thừa cấp, bệnh nhọt, đòn ngã tổn thương, gãy xương, thấp khớp dạng thấp, đau lưng Ngày dùng 15-30g, đun sôi uống hay tán bột uống với rưọoi hoặc dùng bột phối thành tễ uống [9], [14],

ở Vân Nam (Trung Quốc) còn dùng trị cảm mạo, kinh nguyệt không đều, viêm phổi và bệnh kiết lỵ [9], [14],

Thành phần: Nhũ Hương, Nhàu, Bạch thược, Thổ phục linh, Hoàng bá,

Sarcandra, L-Camitine fumarate

I « ỉ

f l ^ m a s o l

r r r r ^

Hình 1.1: Flamasol HOÀNG THẨP LINH

Thành phần: Mỗi viên tìiuốc có chứa: Paeonia lactiflora 400 mg,

Siegesbeckia orientalis 400mg, Sarcandra glabra 200mg, Pistacia lentiscus 50mg.

Công dụng: Hỗ trợ điều trị và phòng ngừa viêm khớp dạng tìiấp Giúp

giảm sưng, giảm đau, tăng cường hồi phục vận động khớp.

Đ ổi tượng sử dụng: Dùng cho người bị đau nhức khớp, viêm đau khớp

dạng thấp Không nên sử dụng cho phụ nữ có tíiai.

TIÊU KHIÉT THANH

Thành phần: mỗi viên chứa: Cao bán chi liên 300mg, cao rẻ quạt 120 mg,

cao bồ công anh 50mg, cao Sói rừng 50 mg.

Công dụng: Giúp phòng ngừa và giảm các triệu chứng viêm đường hô hấp

trên mạn tính như: viêm tíianh quản, viêm amiđan, khản tiếng, mất tiếng.

Hỗ trợ điều trị tiêu viêm, giảm sưng, giảm viêm thanh quản, làm trong sáng giọng nói.

Đổi tượng sử dụng: Người bị viêm đường hô hấp ữên mạn tính: viêm

thanh quản, khản tiếng, viêm amidan.

Hình 1.3: Tiêu khiết thanh 1.5 VÀI NÉT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

HÓA HỌC HỢP CHẤT HỮU cơ

Theo Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà [13], cấu tìTÌc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các phương pháp phổ kết hợp, Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng họp chất mà người ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể cấu trúc càng phức tạp ứiì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao Trong một số trường hợp, để xác định chính xác

cấu trúc hóa học của các họp chất người ta còn phải dựa vào các phương pháp

bổ xung khác như chuyển hóa hóa học, kết họp với các phương pháp sắc ký

so sánh

1.5.1 Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy, dựa vào kết quả phổ hồng ngoại, người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng, ví dụ như dao động hóa trị của các nhóm OH tự do trong các

1700-1750 cm’', của nhóm ether C-O-C trong vùng 1020-1100 cm '', của

gọi là vùng vân tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phưong pháp so sánh trực tiếp Hiện nay thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này lại cần từ 2-3mg và khó thu hồi lại Chính vì vậy, thông thường đối với các họp chất thiên nhiên (lưọng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ nhân hay phổ khối

1.5.2 Phổ khối lượng ( Mass Spectroscopy)

Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này

là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pick ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được

cấu trúc hóa học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng Những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:

+ Pho EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lưọng khác nhau, phổ biến là 70 eV

+ Phổ ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pick ion phân tử và các pick đặc trưng cho sự phá vỡ liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

+ Phổ FAB (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lưọng thấp, do

đó phổ cũng dễ thu được pick ion phân tử

+ Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pick ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất hữu cơ

+ Ngoài ra, hiện nay hiện nay người ta còn sử dụng các phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ Phương pháp này đặc biệt hiệu quả khi sử dụng thư viện phổ để so sánh nhận dạng hợp chất Có thể sử dụng GC-MS (sắc ký khối phổ) cho các họp chất dễ bay hơi như tinh dầu, hay LC-MS (sắc ký lỏng khối phổ) cho các hợp chất khác Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược)

1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, NMR)

Theo Trần Văn Sung [18], phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu co nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kết họp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của họp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ('H ,

và '^C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift) Ngoài ra, đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân

từ với nhau (spin coupling)

> PhỔ^H-NMR

Trong phổ *H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (ô) của các proton được xác

định trong thang ppm từ Oppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưỏng ở một môi trường khác nhau và vì vậỵ chúng được biểu diễn bằng một

độ dịch chuyển hóa học khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin coupling mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của họp chất

> P hổ^ ^ c-N M R

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ *^C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm)

> Phổ DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau Trên các phổ DEPT, tín hiệu của carbon bậc 4 biến mất Tín hiệu phổ của CH và

phổ DEPT 90^ thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

> PhỔ2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ 2 chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tủ trong không gian 2 chiều Một số kỹ thuật chủ yếu được

sử dụng như sau:

+ Phổ HSQC: ( Heteronuclear Single Quantum Coherence)

Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ, một trục là phổ 'H-NM R còn trục kia là '^C-NMR Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

+ Phổ 'H -'H COSY (HOMOCOSY) 'H -'H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

Phổ này biểu diễn tương tác H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền kề nhau Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân

tử được xác định về cấu trúc

+ Phổ NOESY ( Nuclear Overhause Effect Spectroscopy)

Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến các khoảng cách nhất định trong

không gian Dựa vào kết quả phổ này, có thể xác định được cấu trúc không gian của phân tử Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE defferences để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trưòng cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về mặt không gian thì sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn.

Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ hai chiều rất hiện đại khác, ví dụ như kỹ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định (decoupling), ví dụ như trên phổ proton, xóa tương tác của một proton nào đó xác định có thể xác định được vị trí của các proton bên cạnh v v

Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, trên thế giới, người ta còn sử dụng phổ X-RAY (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế, bởi vì yêu cầu tiên quyết là phải có đơn tinh thể Đây là điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn phải

sử dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đem vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thưòng phải sử dụng phương pháp thủy phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh bằng LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỬU

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN cứu

- Nguyên liệu là phần trên mặt đất của cây Sói rừng ứiu hái ở Vĩnh Phúc vào tìiáng 7 năm 2008, được phơi rồi sấy khô ừong tủ sấy ở nhiệt độ 50® sau đó được tán thô và bảo quản nơi khô mát.

- Mầu nghiên cứu đã được CN Ngô Văn Trại định tên khoa học là

Sarcandra glabra ( Thunb.) Nakai, họ Hoa sói (Chloranthaceae)

2.2 ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM

- Chuột nhắt trắng, chủng Swiss, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2g, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.

- Chuột cống trắng, cả hai giống, khỏe mạnh, trọng lượng 120 ± 20g.

Chuột thí nghiệm được nuôi trong điều kiện phòng tlií ngliiệm với đày đủ thức ăn và nước uống tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội.

2.3 HÓA CHẤT VÀ THIÉT BỊ DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u

2.3.1 Hóa chất:

- Các dung môi và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn DĐVN IV

2.3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- [a]o đo trên máy JASCO DIP - 1000 KƯY polarimeter

- Phổ khối đo trên máy 5989 - MS

- Phổ NMR đo trên máy NMR - Bruker - 500 MHz

- Máy xét nghiệm sinh hóa Screen - Master của hãng Hospitex Diagnostic, (Italy)

- Kit định lượng protein của hãng Hospitex Diagnostics (Italy)

- Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX-Diagnostics, định lượng trên máy Vet abc™ Animal Blood Counter

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.4.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

> Định tính các nhóm chất có trong nguyên liệu bằng các phản ứng hóa

> Chiết xuất các chất trong dược liệu theo phưong pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng

> Phân lập các chất trong các phân đoạn chiết bằng sắc ký cột - dùng silicagel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm và 0,015 - 0,040mm ( MERCK) hoặc Sephadex LH20 làm chất nhồi cột

> Nhận dạng chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ MS, 'H-NMR, '^C-NMR, DEPT 90, DEPT 135, HMQC, COSY, NOESY có so sánh với những tài liệu đã công bố.

2.4.2 Nghiên cứu về tác dụng sinh học

2.4.2.1 Thử độc tính cấp [5], [6 ], [11]

- Phần trên mặt đất của cây Sói rừng được nấu thành dạng cao lỏng tỷ

lệ 4,5:1( 4,5 gam dược liệu/ 1 ml cao) sau đó được pha với nước cất thành các nồng độ khác nhau để cho chuột uống trong quá trình nghiên cứu

- Sau khi dò liều, tiến hành nghiên cứu tìm liều tối đa không gây chết

- Trước khi uống thuốc, cho chuột nhịn ăn qua đêm

- Cho chuột uống cao Sói rừng theo liều tăng dần từ 190g dược liệu/kg đến 270g dược liệu/kg (chia 31ần, mỗi lần uống cách nhau 2h)

- Theo dõi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô trong 72h ( những chuột chết trong 2h đầu đều được mổ quan sát đại thể ) Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc

2.4.2.2 Thử tác dụng chổng viêm cấp

- Cao lỏng Sói rừng tỷ lệ 1:4 (1 ml cao chứa 4 g dược liệu) trong dung môi

nước, được pha thành các nồng độ thích hợp dùng trong nghiên cứu

- Phương pháp gây viêm màng bụng

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành

ưm c HÀ N T

- Lô 1 (đối chứng): uống nước cất, thể tích 1 ml/lOOg/ngày.

- Lô 2: uống aspirin liều 150 mg/kg/ngày

- Lô 3: uống cao lỏng Sói rừng liều thấp 5g dl/kg/ngày

- Lô 4: uống cao lỏng Sói rừng liều cao lOg dl/kg/ngày

Các lô chuột được uống thuốc thử hoặc nước muối sinh lý trong thời gian 4 ngày Sau đó gây viêm màng bụng bằng dung dịch carrageenin 0,05 g + formaldehyd 1,4 ml pha trong 100 ml nước muối sinh lý vừa đủ, tiêm 2 ml vào khoang màng bụng cho mỗi chuột

Sau 24 giờ gây viêm, mổ ổ bụng chuột hút dịch rỉ viêm Đo thể tích và đếm số lượng bạch cầu/ml dịch rỉ viêm, định lượng protein trong dịch rỉ viêm

2.4.2.3 Thử tác dụng bảo vệ gan

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 12 con

Lô 1 (chứng sinh học): uống nước cất

Lô 2 (gây mô hình viêm gan): uống nước cất + uống PAR

Lô 3 (chứng dương): uống PAR + uống silymarin 70 mg/kg

Lô 4 (thuốc nghiên cứu): uống PAR + Sói rừng liều 5g dl/kg

Lô 5 (thuốc nghiên cứu): uống PAR + Sói rừng liều lOg dl/kg

lô từ lô 2 đến lô 5 bằng uống paracetamol (PAR) liều 400mg/kg với thể tích

0 ,2m l/1 0g

48 giờ sau khi uổng paracetamol, lấy máu động mạch cảnh của chuột

để định lượng enzym AST và ALT, đồng thời lấy gan để xác định trọng lượng

và quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể)

CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u

3.1 KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÈ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.1.1 Định tính các nhóm chất bàng các phản ứng hóa học

K* Định tính alcaloid

Cho khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thấm ẩm dược liệu bằng dd ammoniac đặc Đậy kín trong vòng 30 phút Cho 15ml cloroform, ngâm 12h Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn Sau đó lắc kỹ với

==> Nhận xét: Dược liệu không có alcaloid

♦♦♦ Định tính flavonoid

Cho 5g bột dược liệu vào bình nón, thêm 20ml n-hexan, lắc đều, đậy kín, ngâm trong tối 24h Sau đó, loại hoàn toàn n-hexan, thêm 50ml cồn 90% đun cách thuỷ 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng:

Phản ứng Cyanidin: cho 2ml dịch chiết vào một ống nghiệm, thêm một ít bột

Magie kim loại, rồi cho 4 - 5 giọt HCl đặc Đun cách thuỷ vài phút thấy dung dịch xuất hiện màu hồng nhạt.( Phản ứng dương tính)

Phản ứng với kiềm'.

+ Phản ứng với NH3; Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, thấy màu vàng của vết đậm lên (Phản ứng dương tính).

+ Phản ứng với NaOH; Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm vài giọt dd NaOH 10%, thấy xuất hiện tủa và màu vàng của dich chiết tăng lên (Phản ứng dương tính)

+ Phản ứng với dung dịch FeCls 5%: Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd FeCLs 5% thấy xuất hiện màu nâu đen (Phản ứng dương tính)

=> Nhận xét: Dược liệu có flavonoid

*1* Định tính saponin.

- Quan sát hiện tượng tạo bọt.

Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 1 Oml nước Lắc mạnh trong

5 phút theo chiều dọc ống nghiệm Đe yên, quan sát thấy cột bọt bền sau 15 phút

- Phản ứng phân biệt 2 loại saponin:

thuỷ đến sôi Lọc nóng, để nguội, cho vào mỗi ống nghiệm Iml dịch lọc

*t* Định tính anthranoid.

- Phản úng Borntrager cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích

vào bình gạn Để nguội rồi lắc với 5ml ether ethylic Gạn lấy phần ether cho

- Vi thăng hoa: Đặt Ig bột dược liệu trên nắp nhôm Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn

cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính để một miếng bông tẩm nước lạnh Đốt nắp nhôm trên ngọn lửa đèn cồn Sau 5-10 phút, lấy lam kính ra để nguội Soi dưới kính hiển

vi, không thấy có tinh thể (Phản ứng âm tính)

=> Nhận xét: Dược liệu không có anthranoid

Định tính glycosid tim.

Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 60ml cồn 20%, lắc đều, để qua đêm Gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat 30%

cloroform vào cốc có mỏ, bốc hơi cách thuỷ đến khô Hòa tan cắn trong 5ml cồn 90^ để làm phản ứng định tính sau:

- Phản ứng Liebermann: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thủy

đến cắn Thêm Iml anhydrid acetic, lắc đều cho tới khi tan hết cắn Đặt nghiêng ống nghiệm 45®, thêm từ từ theo thành ống nghiệm Iml dung dịch

=> Không thấy xuất hiện một vòng tím đỏ ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng ( Phản ứng âm tính)

- Phản ứng Baljet: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0,5ml thuốc thử

Baljet mới pha( gồm 1 phần dd acid picric 1% và 9 phần dd NaOH 10%)

=> Không thấy xuất hiện màu đỏ cam ( Phản ứng âm tính)

- Phản ứng Legal: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dd natri

nitropmssiat l% và 2 giọt dd NaOH 10%

=> Không thấy xuất hiện màu đỏ cam.( Phản ứng âm tính)

=> Nhận xét: Dược liệu không có glycosid tim

♦t* Đinh tính coumarin.

Cho 2g bột dược liệu vào bình nón lOOml, thêm 30 ml cồn 90*^ Đun cách thuỷ sôi 5 phút Lọc nóng, địch chiết thu được dùng làm phản ứng:

- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml

dịch chiết Ống 1: Thêm 0,5 ml dd NaOH 10%, ống 2: để nguyên Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội Quan sát thấy; ống 1: có tủa màu vàng, ống 2: trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất Lắc đều, thấy: ống 1: trong suốt, ống 2: có tủa đục Thêm vài giọt giọt acid HCL đặc, ống 1 trở lại đục như ống 2 ( Phản ứng dương tính)

- Phản ứng Diazo\ Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm 2ml

dd.NaOH 10% Đun cách thuỷ sôi 5 phút rồi để nguội Thêm vào 10 giọt TT Diazo mới pha, thấy xuất hiện màu đỏ gạch ( Phản ứng dương tính)

=> Nhận xét: Dược liệu có coumarin

<♦ Định tính tanin.

Cho vào ống nghiệm Ig bột dược liệu, thêm lOml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết

- Ống 1: Thêm 2-3 giọt dung dịch FeCls 5% thấy xuất hiện màu xanh đen

- Ống 2: Thêm 2-3 giọt dung dịch gelatin 1% không thấy xuất hiện tủa bông

- Ống 3; Thêm 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa bông

=> Nhận xét; Dược liệu không có tanin

Định tính chất béo.

Cho lOg bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm, lọc Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi, thấy để lại vết mờ trên giấy lọc ( Phản ứng dương tính)

=> Nhận xét: Dược liệu có chất béo

Định tính steroid.

Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết ether dầu hỏa trên Bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Đe nghiêng

phân cách có màu vàng nâu, phía trên màu xanh ngọc bích, phía dưới trắng

=> Nhận xét: Dược liệu có hợp chất steroid

*1* Định tính caroten.

Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hỏa trên Bốc hơi cách

trời => Nhận xét: Dược liệu có caroten

<♦ Định tính acid hữu cơ.

Cho vào ổng nghiệm Ig bột dược liệu, thêm lOml nước cất, đun sôi trực tiếp

=> Nhận xét: Dược liệu có đường khử

Định tính polysaccharid.

Cho vào cốc có mỏ 3g bột dược liệu, thêm 15ml nước cất, đun cách thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng Cho vào 2 ống nghiệm:

Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol

Ống 2; 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol

Quan sát thấy ống 1 có màu đậm hon ống 2

=> Nhận xét: Dược liệu có Polysaccharid

Kết quả định tính được trình bày tóm tắt trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu Sói rừng

-Acid hữu cơ Phản ứng với bột Na2CƠ3 Có

Ghi chú: (-): Âm tính, (++): dương tính rõ

Kết luâm Qua các phản ứng định tính, thấy trong dược liệu Sói rừng có chứa:

flavonoid, saponin steroid, coumarin, acid hữu cơ, đường khử, chất béo, sterol, caroten, polysaccharid và không có anthranoid, glycosid tim, tanin, acid amin

3.1.2 Chiết xuất các chất trong dược liệu Sói Rừng

Từ 20 kg dược liệu tươi phơi khô thu được 2,8 kg dược liệu khô, tán thành bột thô chiết với ethanol 70% ở nhiệt độ phòng 3 lần Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được dịch đậm đặc, cho thêm

Hàm lượng cắn trong các phân đoạn được tính theo công thức:

Trong đó: X %: Hàm lượng cắn trong các phân đoạn chiết (%)

m: Khối lượng cắn thu được (g) a: Khối lượng dược liệu đem chiết (g)

d : Độ ẩm dược liệu (%)

Bảng 3.2: Kẻt quả định lượng cắn trong các phân đoạn

Từ cặn EtOAc, cho qua cột sắc ký silicagel pha thường rửa giải bằng hệ

màu trắng

Từ dịch cặn n-BuOH tiến hành chạy qua cột tách thô trên pha đảo (YMC RP-18) với hệ dung môi rửa giải là acetone-nước 1/3, thu được ba

trên cột sắc ký pha đảo (YMC RP-18 ) sử dụng hệ dung môi rửa giải là

dạng bột vô định hình màu trắng Quá trình phân lập các hợp chất từ cây sói rừng được trình bày tóm tắt ở hình 3.1

Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ cây Sói rừng

3.1.4 Nhận dạng các hợp chất phân lập được

3.I.4.I Hợp chất SR : 8a,9a,15-Trìhydroxyỉindan-4(5),7(12)-dien-8P,12-

oíide (Chất mới):

Hợp chất SR được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng,

_a]ó^^: + 42° (C 0,5; MeOH) Trên phổ 'H-NMR (đo trong CD3OD) của SR xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của hai nhóm metyl tại 5 1,82 (3H, d, J = 1.5

Hz, H-13) và 1,43 (3H, s, H-14) Các tín hiệu cộng hưởng tại ô 3,83 (IH , s,

H-9) và 4,11 (IH , d, J = 7,5 Hz, Ha-15)/4,23 (IH , d, J = 7,5 Hz, Hb-15) lần

lượt khẳng định cho sự tồn tại của một nhóm oximetin và một nhóm oximetilen Ngoài ra, sự xuất hiện các tín hiệu của một nhóm metilen tại 5

0.29 (IH , ddd, J = 4.0, 4.0, 4.0 Hz, Hp-2)/ 0.77 (IH , ddd, J = 4.0, 8.0, 8.0 Hz,

Ha-2) cho phép dự đoán SR là một hợp chất sesquitecpen dạng khung lindan,

một lớp chất điển hình đã được phân lập từ các loài ứiuộc chi Sarcandra

[25],[37]

Hĩnh 3.2 Cấu ừ-úc hóa học của S R (1) và 8Ị5,9a-dihydroxylindan-4(5),

7(11)-dỉen-8a,12-olide (la) Bảng 3.3 Số liệu p h ổ NMR của SR

2 15,3 15,08 (/?) 0,14 ddd (4,0, 4,0,

i o ) ( à ) 0,64 ddd (4,0, 8,0,

15,98 03)0,29 ddd (4,0,4,0,

i o )

(a) 0,77 ddd (4,0, 8,0,

^Đo trong DMSO-í/ổ, *’125 M H z, *^500 M Hz, “^đo trong CD 3 OD, ^ôc của %ỊỈ,9a-

dihydroxylindan-4(5),7(l l)-d ien -8 a,1 2 -o lid e [37],

Trên phổ '^C-NMR và DEPT của SR xuất hiện 15 tín hiệu cacbon của một họp chất sesquitectpen gồm có 2 nhóm metyl, 3 nhóm metilen, 3 nhóm metin và 7 cacbon bậc bốn Trong đó sự xuất hiện của một nhóm metilen và

C-2), 28,13 (CH, C-1) và 26,00 (CH, C-3) cho phép khẳng định SR là một sesquitectpen dạng khung lindan [25],[37] Hai nhóm metyl được xác định

bởi các tín hiệu cộng hưởng tại 5 8,12 (CH3, C-13) và 22,40 (CH3, C-14) Các

8)/124,16 (C, C -11) và 174,89 (C, C-12) đặc trưng cho hai liên kết đôi đã bị thế hoàn toàn và một nhóm carbonyl Ngoài ra, một cacbon bậc bốn nối trực tiếp với hai nguyên tử ôxi, một nhóm oximetin và một nhóm oximetilen được

Từ các phân tích nêu trên có thể sơ bộ xác định SR là một hợp chất sesquitecpen lacton dạng khung lidan có 2 liên kết đôi thế hoàn toàn và 3 nhóm OH trong phân tử Do đó, số liệu phổ '^C-NMR (đo trong MeOD) của

SR được so sánh với các giá trị tương ứng đã được công bố của hợp chất

8jS,9a-dihydroxylindan-4(5),7(12)-dien-8ci!,12-olide (la ) [37] và nhận được

sự phù hợp ở hầu hết các vị trí (Bảng 3.3) Sự khác biệt dễ nhận thấy nhất về giá trị phổ *^C-NMR giữa hai họp chất là sự xuất hiện tín hiệu của một nhóm

dihydroxylindan-4(5),7(ll)-dien-8a,12-olide (la ) [37].

Hình 3.3 Các tương tác HMBC chỉnh của SR

Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC và HMBC của SR cho phép gán chính xác giá trị phổ tại tất cả các vị trí trong phân tử của SR (Bảng 3.3) VỊ trí của nhóm oximetilen tại C-

15 được khẳng định bởi các tương tác HMBC giữa các proton oximetilen tại 5

cacbon C-3 (ỗ 26,00), C-4 (ô 144,18) và C-5 (5 135,57) Thêm vào đó, tương tác HMBC giữa các proton metyl tại 5 1,43 (3H, s, H-14) với các cacbon C-1 (5 28,13), C-5 (5 135,57), C-9 (ô 80,68) và C-10 (5 54,20) cho phép xác định

vị trí của nhóm oximetin tại C-9 Phân tích chi tiết các tương tác còn lại trên phổ HMBC (Hình 3.3) cho phép xác định chính xác cấu trúc phẳng của SR

Hình 3.4 Cẩu hình không gian và các tươỉĩg tác NO ESYchính của SR

Để xác định cấu hình không gian của SR, đã tiến hànli đo lại phổ NMR

hiệu proton của các nhóm OH và sử dụng kỹ thuật phổ NOESY để xác định cấu hình không gian Trong dung môi DMSO, tín hiệu proton của các nhóm

và 4,59 (t, J = 5,0 Hz) Toàn bộ số liệu phổ ‘H và '^C-NMR của SR được

tổng họp trong bảng 3.3 Trên phổ NOESY của SR, tương tác không gian giữa proton metyl H-14 (ô 1,29) với proton oximetin H-9 (ô 3,64) cho phép

xác định cấu hình a của nhóm OH tại C-9 Proton OH tại C-9 (ô 4,64) có

nhóm OH này có cùng cấu hình a Từ tất cả các phân tích nêu trên, cùng với kết quả phổ khối lượng ESI-MS tại m/z 279 [M+H]"^, tương ứng với công thức