Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chất phân lập được từ cây đại hoàng (rheum tanguticum maxim ex balf)

Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BẢNG LỜI MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN 11 1.1 Khái quát họ rau răm (Polygonaceae) 11 1.1.1 Họ rau răm (Polygonaceae) 11 1.1.2 Phân loại 11 1.2 Giới thiệu chi Đại hoàng - Rheum L 12 1.2.1 Đặc điểm hình thái 12 1.2.2 Phân bố 12 1.3 Giới thiệu Đại hoàng – Rheum sp 13 1.3.1 Đặc điểm thực vật 13 1.3.2 Phân bố thu hái 15 1.3.3 Thành phần hóa học 16 1.3.3.1 Anthraquinon 16 1.3.3.2 Anthrone 18 1.3.3.3 Stilben 19 1.3.3.4 Acylglucoside 20 1.3.3.5 Flavonoid 21 1.3.3.6 Các hợp chất khác 22 1.3.4 Tác dụng dược lý Đại hoàng 22 1.3.4.1 Tác dụng nhuận tràng 22 1.3.4.2 Tác dụng chống ung thƣ 22 1.3.4.3 Tác dụng kháng viêm giảm đau 23 HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền 1.3.4.4 Tác dụng bảo vệ gan 23 1.3.4.5 Điều trị bệnh tiểu đƣờng 23 1.4 Một số kết nghiên cứu hoạt tính sinh học anthraquinon stilben câ Đại hoàng – Rheum sp 23 1.4.1 Các hợp chất anthraquinon 23 1.4.1.1 Khái niệm chung 23 1.4.1.2 Hoạt tính sinh học anthraquinon 24 1.4.2 Các hợp chất stilben 26 1.4.2.1 Khái niệm chung 26 1.4.2.2 Hoạt tính sinh học stilben 27 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu nghiên cứu 28 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị dùng nghiên cứu 28 2.1.2.1 Dụng cụ hóa chất 28 2.1.2.2 Các thiết bị dùng nghiên cứu 29 2.2 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 Phương pháp nghiên cứu hóa học 30 2.2.1.1 Phƣơng pháp chiết xuất 30 2.2.1.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 31 2.2.1.3 Phƣơng pháp sắc ký cột (CC) 32 2.2.1.4.Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập đƣợc 33 2.2.2 Phương pháp thử hoạt hoạt tính kháng khuẩn 35 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM 37 3.1 Xử lý mẫu thực nghiệm nghiên cứu điều kiện chiết chiết xuất anthraquinon từ mẫu thực nghiệm 37 3.1.1 Xử lý mẫu thực nghiệm 37 HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền 3.1.2 Nghiên cứu điều kiện chiết xuất anthraquinon từ mẫu thực nghiệm 37 3.1.2.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết 37 3.1.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian đến hiệu suất chiết 38 3.1.2.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi đến hàm lƣợng anthraquinon 38 3.2 Chiết xuất mẫu thực nghiệm phân đoạn hóa cặn chiết 39 3.2.1 Xử lý bột Đại hoàng 40 3.2.2 Xử lý cao chiết metanol 40 3.3 Phân lập số hoạt chất có cặn diclometan 42 3.3.1 Khảo sát sơ cặn diclometan sắc ký lớp mỏng 42 3.3.2 Phân lập cặn diclometan 42 3.4 Tính chất vật lý liệu phổ hợp chất phân lập đƣợc 47 3.4.1 Tính chất vật lý 47 3.4.2 Dữ liệu phổ hợp chất phân lập 48 3.4.2.1 Dữ liệu phổ hợp chất DH01 48 3.4.2.2 Dữ liệu phổ hợp chất DH02 48 3.4.2.3 Dữ liệu phổ hợp chất DH03 48 3.4.2.4 Dữ liệu phổ hợp chất DH04 49 3.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 49 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1 Kết nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ mẫu thực nghiệm 50 4.1.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết 50 4.1.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất chiết 51 4.1.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng dung môi đến hàm lượng anthraquinon 52 4.2 Xác định cấu trúc hợp chất DH01, DH02, DH03, DH04 54 HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền 4.2.1 Cấu trúc hợp chất DH01 54 4.2.2 Cấu trúc hợp chất DH02 57 4.2.3 Cấu trúc hợp chất DH03 61 4.2.4 Cấu trúc hợp chất DH04 65 4.2 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết chất phân lập đƣợc 69 4.2.1 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết 69 4.2.2 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn hợp chất phân lập được… …………………………………………………………………… 71 KẾT LUẬN 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC 82 HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN R.: Rheum TCN: Trƣớc Công Nguyên IR: phổ hồng ngoại MS: phổ khối lƣợng H-NMR: phổ cộng hƣởng từ proton 13 C-NMR: phổ cộng hƣởng từ cacbon 2D-NMR: phổ cộng hƣởng từ hai chiều DEPT: Distortionless enhancement by polarization transfer TLC (Thin layer chromatography): Sắc ký lớp mỏng CC (Column chromatography): Sắc ký cột H: n-hexan E: Etyl axetat D: Diclometan M: Metanol m/z: khối lƣợng/điện tích d: doublet dd: doublet of doublet s: singlet t: triplet brs: broad singlet δH: độ dịch chuyển hóa học proton δC: độ dịch chuyển hóa học carbon MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu c.f.u (colony forming unit): Đơn vị tạo khuẩn lạc TSB: Tryptone Soya Broth HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Một số loài chi Đại hoàng 12 Hình 1.2: Rheum palmatum L 15 Hình 1.3 Rheum palmatum lai tanguticum 15 Hình 1.4: Rheum tanguticum Maxim ex Balf 15 Hình 1.5: Rheum officinale Baill 15 Hình 1.6: Cấu trúc hóa học anthraquinon dẫn xuất đƣợc 18 phân lập từ Đại hoàng Hình 1.7 : Cấu trúc hóa học anthrone đƣợc phân lập từ 19 Đại hoàng Hình 1.8: Các hợp chất stilben phân lập đƣợc từ Đại hoàng 21 Hình 1.9: Các hợp chất Acylglucosid phân lập đƣợc từ Đại 20 hoàng Hình 1.10: Các hợp chất Flavonoid phân lập đƣợc từ Đại 21 hoàng Hình 1.11: Khung anthraquinon – 9,10-anthracendion 24 Hình 1.12 Khung stilben dạng cis-stilben dạng trans-stilben 26 Hình 2.1: Cây đại hoàng củ đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim 28 Ex Balf) Hình 2.2: Cách tính giá trị Rf 31 Hình 2.3: Các bƣớc tiến hành sắc ký mỏng 32 Hình 2.4: Các bƣớc tiến hành sắc ký cột (CC) 33 Hình 3.1: Hình ảnh khảo sát sắc ký mỏng (TLC) cặn chiết 42 diclometan Hình 3.2 Hình ảnh cột đƣợc rửa giải dung môi n-hexan/etyl 44 axetat etyl axetat/metanol (E/M) theo độ phân cực tăng dần hệ dung môi Hình 4.1 Kết khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ chiết 50 Hình 4.2 Kết khảo sát nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết 51 Hình 4.3 Kết khảo sát nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi đến 53 hàm lƣợng anthraquinon HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Hình 4.4: Phổ 1H-NMR hợp chất DH01 Hình 4.5: Phổ 13C-NMR hợp chất DH01 Hình 4.6: Phổ DEPT-135 hợp chất DH01 Hình 4.7: Công thức hợp chất chrysophanol (DH01) Hình 4.8: Phổ 1H-NMR hợp chất DH02 Hình 4.9: Phổ 13C-NMR hợp chất DH02 Hình 4.10: Phổ DEPT-135 hợp chất DH02 Hình 4.11: Công thức hợp chất physcion (DH02) Hình 4.12: Phổ 1H-NMR hợp chất DH03 Hình 4.13: Phổ 13C-NMR hợp chất DH03 Hình 4.14: Phổ DEPT-135 hợp chất DH03 Hình 4.15: Công thức hợp chất emodin (DH03) Hình 4.16: Phổ 1H-NMR hợp chất DH04 Hình 4.17: Phổ 13C-NMR hợp chất DH04 Hình 4.18: Phổ DEPT-135 hợp chất DH04 Hình 4.19: Công thức hợp chất rhapontigenin (DH04) Sơ đồ 3.1: Sơ đồ xử lý bột Đại hoàng Sơ đồ 3.2: Xử lý cao chiết metanol Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phân lập cặn diclometan HVTH: Bá Thị Dƣơng 54 55 56 57 58 59 59 61 62 63 63 65 66 67 67 69 40 41 47 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Anthraquinon dẫn xuất đƣợc phân lập từ Đại 16 hoàng Bảng 3.1: Hệ dung môi rửa giải phân lập cặn diclometan 44 Bảng 3.2: Các phân đoạn phân lập đƣợc từ cặn diclometan 45 Bảng 4.1 Kết nghiên cứu khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ 51 Bảng 4.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết 52 Bảng 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng dung môi chiết đến 53 hàm lƣợng anthraquinon Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 1H-NMR 13 C-NMR DH01 so sánh 56 với chrysophanol Bảng 4.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR 13 C-NMR DH02 so sánh 60 13 C-NMR DH03 so sánh 64 với physcion Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 1H-NMR với emodin Bảng 4.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR DH04 so sánh 68 với rhapontigenin Bảng 4.8 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết sau 70 24 Bảng 4.9 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn hợp chất 71 phân lập đƣợc sau 24 đo độ đục (OD600nm) Bảng 4.10 Kết thử hoạt tính kháng khuẩn chất phân 72 lập đƣợc sau 48 đo độ đục (OD600nm) HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền LỜI MỞ ĐẦU Cây Đại hoàng (Rheum sp.) thuộc họ rau răm (Polygonaceae) chủ yếu mọc hoang phần đƣợc trồng Tứ Xuyên, Cam Túc (Trung quốc) Ở Việt Nam đƣợc trồng Sapa, loại thuốc quý Đông y lẫn Tây y Trên Thế giới, đặc biệt Trung Quốc nhƣ nƣớc ta dùng Đại hoàng làm vị thuốc chữa số bệnh nhƣ: nhuận tràng, nhuận tẩy, lợi tiểu, viêm loét dày, tăng huyết áp thai kỳ, đái tháo đƣờng, điều trị sỏi thận, giải độc gan, điều trị ung thƣ, bệnh da nhƣ viêm loét vảy nến, [14], [33] Các anthraquinon stilben Đại hoàng đƣợc chứng minh có nhiều tính chất dƣợc lý quan trọng nhƣ kháng viêm, chống ung thƣ, bảo vệ gan, lợi tiểu Trong đó, hợp chất thuộc nhóm anthraquinon nhƣ chrysophanol, physcion, emodin, aloe-emodin, rhein,… có tác dụng điều trị lâm sàng nhiều bệnh: kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, nhuận tràng, tẩy, lợi tiểu, thông mật, điều trị sỏi thận,… [10] đặc biệt có tiềm điều trị bệnh ung thƣ khả ức chế tăng sinh tế bào, gây độc tế bào phòng ngừa di [23] Tuy nhiên, Việt Nam việc nghiên cứu thành phần hóa học nhƣ hoạt tính sinh học chi Đại hoàng (Rheum sp.) đặc biệt loài Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf) chƣa hệ thống đầy đủ Chính vậy, cần có nghiên cứu hệ thống lại thành phần hóa học phân lập đƣợc nhƣ hoạt tính sinh học Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf), thuộc chi Rheum L., họ Rau Răm (Polygonaceae) Dựa tổng hợp đó, chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất phân lập từ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf)”, thực đề tài HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền nhằm góp phần vào việc tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học, hoạt tính kháng khuẩn, nâng cao giá trị sử dụng nguyên liệu Đại hoàng vốn quen thuộc  Nội dung nghiên cứu đề tài: - Nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf) - Phân lập chất tinh khiết từ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf) - Xác định cấu trúc chất phân lập đƣợc - Thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết chất phân lập đƣợc  Đối tƣợng nghiên cứu: Rễ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf) đƣợc sử dụng phổ biến y học cổ truyền Việt Nam HVTH: Bá Thị Dƣơng 10 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH02 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 6: Phổ 1H-NMR hợp chất DH02 HVTH: Bá Thị Dƣơng 88 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH02 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất DH02 HVTH: Bá Thị Dƣơng 89 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH02 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR hợp chất DH02 HVTH: Bá Thị Dƣơng 90 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH02 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 9: Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất DH02 HVTH: Bá Thị Dƣơng 91 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH02 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 10: Phổ DEPT-135 hợp chất DH02 HVTH: Bá Thị Dƣơng 92 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR hợp chất DH03 HVTH: Bá Thị Dƣơng 93 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất DH03 HVTH: Bá Thị Dƣơng 94 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR hợp chất DH03 HVTH: Bá Thị Dƣơng 95 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất DH03 HVTH: Bá Thị Dƣơng 96 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Phụ lục 15: Phổ DEPT-135 hợp chất DH03 HVTH: Bá Thị Dƣơng 97 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền Phụ lục 16: Phổ 1H-NMR hợp chất DH04 HVTH: Bá Thị Dƣơng 98 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH04 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 17: Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất DH04 HVTH: Bá Thị Dƣơng 99 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH04 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 18: Phổ 13C-NMR hợp chất DH04 HVTH: Bá Thị Dƣơng 100 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH04 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 19: Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất DH04 HVTH: Bá Thị Dƣơng 101 GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng PGS.TS Phạm Gia Điền DH04 Luận văn thạc sĩ kỹ thuật Phụ lục 20: Phổ DEPT-135 hợp chất DH04 HVTH: Bá Thị Dƣơng 102 ... tanguticum Maxim Ex Balf) chƣa hệ thống đầy đủ Chính vậy, cần có nghiên cứu hệ thống lại thành phần hóa học phân lập đƣợc nhƣ hoạt tính sinh học Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf), thuộc... Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học chất phân lập từ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf) , thực đề tài HVTH: Bá Thị Dƣơng Luận văn thạc sĩ kỹ thuật GVHD: PGS.TS Vũ Đình Hoàng. .. Nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf) - Phân lập chất tinh khiết từ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim Ex Balf) - Xác định cấu trúc chất phân