Tiến hành chạy sắc ký cột với 20 g cặn diclometan:
HVTH: Bá Thị Dƣơng 43 Chuẩn bị chất chạy cột:
Hòa tan 20g cặn diclometan trong một lƣợng dung môi diclometan tối thiểu và tẩm với 40 g silica gel cỡ vừa (0,04 – 0,064 mm). Loại dung môi dƣới áp suất giảm đến khô.
Chuẩn bị cột:
- Chọn cột 45 mm, dài 70 cm, có van khóa teglon. Rửa sạch, tráng cột bằng metanol và sấy khô. Lót dƣới đáy cột một ít bông.
- Chuẩn bị silica gel theo phƣơng pháp nhồi ƣớt: Cân 400 g silica gel cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm. Hoạt silica gel ở 110 – 120°C trong 1 – 2 giờ. Ngâm silica gel đã hoạt hóa đến trƣơng nở hoàn toàn trong n-hexan. Trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều.
Nhồi cột:
- Dựng cột thẳng đứng. Rót từ từ hỗn dịch silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa gõ nhẹ để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều. Mở van khóa cho dung môi chảy và silica gel sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột.
- Khi dung môi chảy gần hết trong cột thì tiếp tục rót hỗn dịch silica gel vào cột. Lặp lại đến khi đổ hết hỗn dịch silica gel vào cột. Trong quá trình đổ hỗn dịch, tuyệt đối không để khô dung môi trong cột.
- Lƣợng dung môi hứng đƣợc lại tiếp tục đƣợc đổ lên cột và cho chảy liên tục. Chạy ổn định cột một thời gian trƣớc khi đƣa chất lên cột. Khi dung môi cách bề mặt chất hấp phụ 1 – 2 cm, khóa van, gõ cho phẳng bề mặt cột. Rải chất thành một lớp đều đặn trên mặt cột.
Chạy cột:
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat (H/E) và etyl axetat/metanol (E/M) theo độ tăng dần của hệ dung môi phân cực, thu đƣợc hình ảnh nhƣ hình 3.2.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 44
Hình 3.2: Hình ảnh cột đƣợc rửa giải bằng dung môi n-hexan/etyl axetat và
etyl axetat/metanol (E/M) theo độ phân cực tăng dần của hệ dung môi. Hứng dịch rửa giải trong bình tam giác khoảng 400 – 500 ml. Loại bớt dung môi (bằng máy cô quay chân không dƣới áp suất giảm) và gom dịch vào ống nghiệm và tỷ lệ cụ thể theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hệ dung môi rửa giải trong phân lập cặn chiết diclometan. ST
T Hệ dung môi
Lƣợng dung môi
dùng Dịch rửa giải thu đƣợc 1 n-hexan 100% 3000 ml Ống nghiệm 1 – 7 2 H:E = 99:1 4000 ml Ống nghiệm 8 – 17 3 H:E = 98:2 4000 ml Ống nghiệm 18 - 28 4 H:E = 96:4 4000 ml Ống nghiệm 29 – 37 5 H:E = 92:8 4000 ml Ống nghiệm 37 – 47 6 H:E = 85:15 4000 ml Ống nghiệm 48 – 58 7 H:E = 70:30 4000 ml Ống nghiệm 59 – 66
HVTH: Bá Thị Dƣơng 45 8 H:E = 30:70 4000 ml Ống nghiệm 67 – 79 9 H:E = 0:100 1000 ml Ống nghiệm 80 – 82 10 E:M = 90:10 2000 ml Ống nghiệm 83 – 86 11 E:M = 50:50 2000 ml Ống nghiệm 87 – 90 12 Metanol 100% 2000 ml
Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, tiến hành gom các ống nghiệm có các vết chất tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng thu đƣợc các phân đoạn khác nhau (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Các phân đoạn phân lập đƣợc từ cặn diclometan. STT Phân
đoạn Ống gom Khối lƣợng Ghi chú 1 C.1.1 1 – 20
2 C.1.2 21 – 23
3 C.1.3 24 – 31
4 C.1.4 32 – 36 2,204 g Hiện rõ hai vết đậm màu vàng.
5 C.1.5 37 – 48 2,717 g Hiện rõ hai vết đậm màu vàng và một vệt màu xanh. 6 C.1.6 49 – 56 7 C.1.7 57 – 66 8 C.1.8 67 – 79 9 C.1.9 80 – 86 1,985 g Nhiều vết chất. 10 C.1.10 87 – 90 11 C.1.11 Rửa Metanol
HVTH: Bá Thị Dƣơng 46 Xử lý một số phân đoạn:
Sau một thời gian, ở các phân đoạn C.1.3, C.1.6 và C.1.7, C1.8 thấy xuất hiện tinh thể:
- Phân đoạn C.1.3 xuất hiện kết tinh hình kim, màu vàng tƣơi. Dùng công tơ hút loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,426 g. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi thu đƣợc duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra với hai hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4 đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn với Rf × 100 = 43,7; 57,7; 57,5 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 92:8; H:E = 9:1; H:D = 6:4. Chúng tôi ký hiệu là chất DH01.
- Phân đoạn C.1.6 xuất hiện kết tinh dạng tấm, màu vàng cam. Dùng công tơ hút loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,305 g. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi chỉ thu đƣợc duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra với hai hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4 đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn với Rf × 100 = 33,3; 40,5; 50,1 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 92:8; H:E = 9:1; H:D = 6:4. Chúng tôi ký hiệu là DH02.
- Phân đoạn C.1.7 xuất hiện kết tinh hình kim, màu cam. Dùng công tơ hút loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,357 g. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi chỉ thu đƣợc duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra với hai hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4
đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn với Rf × 100 = 30,7; 47,5 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 4:1 và H:E = 3:1. Chúng tôi ký hiệu là DH03.
- Phân đoạn C.1.8 xuất hiện tinh thể vô định hình, màu xám. Dùng công tơ hút sạch loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,9427 g chất. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi chỉ thu đƣợc duy nhất một chấm tròn hóa nâu trong không khí. Kiểm tra với hai
HVTH: Bá Thị Dƣơng 47
hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4 đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn màu xanh với Rf × 100 = 35,5; 67,7 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 1:3 và D:M = 92:8. Chúng tôi ký hiệu là chất DH04.