Stilben là hợp chất thứ cấp gắn liền với nhiều lợi ích sức khỏe con ngƣời nhƣ kháng ung thƣ, kháng viêm và giảm nguy cơ về bệnh tim mạch [7]. Stilben là phytoalexin, hợp chất đƣợc tổng hợp khi thực vật đáp ứng với sự xâm hại của nấm mốc, vi khuẩn và tác nhân gây bệnh. Resveratrol là hợp chất phổ biến nhất của nhóm stilben, nó tồn tại ở cả dạng đồng phân cis- và trans- và trong mô thực vật ở dạng cơ bản nhƣ trans-resveratrol-3-O-glucoside đƣợc biết nhƣ piceid và polydatin [35]. Resveratrol là một chất có hoạt tính sinh học rất cao dạng polyphenolic có nhiều trong nho, đậu, lạc và rƣợu vang đỏ, củ cốt khí…. Resveratrol đƣợc biết đến là một chất chống oxi hóa, phòng ngừa các bệnh tim mạch nhƣ bệnh xơ vữa động mạch, bệnh mỡ máu cao… Bên cạnh đó, theo một nghiên cứu của Khoa Dƣợc (Đại học Calabira, Italia) resveratrol còn có tác dụng ức chế ảnh hƣởng của estrogen và ngăn chặn sự phát triển ung thƣ vú ở phụ nữ.
Hiện nay, việc nghiên cứu stilben trong đại hoàng chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều. Tuy nhiên, Đại hoàng Hàn Quốc (Rheum undulatum L.) đã đƣợc nhóm tác giả Masayuki Yoshikawa cùng CS đã nghiên cứu và chỉ ra rằng ba stilben (rhapontigenin, piceatannol, và resveratrol) có tác dụng ức chế chống lại các nitric oxide (NO) sản xuất trong đại thực bào lipopolysaccharide (IC50
= 11 ± 69 µM). Ngoài ra, hầu hết các stilben đƣợc phân lập từ Đại hoàng Hàn Quốc có tác dụng ức chế mỡ máu bởi hydroperoxide tert-butyl, chống dị ứng, chống oxi hóa…v.v, [20], [21], [22], [38].
HVTH: Bá Thị Dƣơng 28
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu.
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.
Đối tƣợng nghiên cứu là rễ của cây Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf) sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Việt Nam. Mẫu đƣợc thu mua tại phố Lãn Ông – Hà Nội, mẫu nghiên cứu đƣợc xác định bởi Th.S Nghiêm Đức Trọng – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội và lƣu tiêu bản tại Phòng Công nghệ các chất có hoạt tính sinh học - Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam.
Hình 2.1:Cây Đại hoàng và củ Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf)
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất và các thiết bị dùng trong nghiên cứu.
2.1.2.1. Dụng cụ và hóa chất. Dụng cụ thí nghiệm: Dụng cụ thí nghiệm:
- Bình tam giác (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml, 2000 ml...). - Bình cầu (100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml...).
HVTH: Bá Thị Dƣơng 29 - Ống nghiệm.
- Bình đựng dung môi (500 ml, 1 lít, 2 lít, 5 lít, 10 lít). - Bình ngâm chiết nguyên liệu (50 lít).
- Bình thủy tinh (25 ml, 50 ml, 100 ml....). - Ống đong ( 5 ml, 10 ml, 50 ml, 250 ml,…). - Các loại phễu chiết, pipet, ống hút chia độ. Hóa chất:
- Dung môi metanol, aceton, diclometan, etyl acetat, n-hexan,… - Bột silicagel 60 Merck cỡ hạt 0,063-0,2 mm,…
- Thuốc thử Ce(SO4)2.
2.1.2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu.
- Máy cô quay chân không: Buchi Rotavapor R – 210. - Cột sắc kí 45 mm.
- Bản sắc ký lớp mỏng silicagel Merck 60 F254 dày 0,2 mm. - Bình triển khai bản mỏng.
- Tủ sấy, máy sấy. - Máy hiện UV. - Tủ hút.
- Bơm hút chân không.
- Cân kỹ thuật Sartorius cp324s.
- Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân: Bruker Avance AM500FT-NMR (Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). - Máy đo phổ khối: ESI-MS: AGILENT 1100LC-MSD
(Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). -Máy đo phổ hồng ngoại: 670-FTIR NICOLET-NEXUS
(Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
HVTH: Bá Thị Dƣơng 30
2.2.1.Phương pháp nghiên cứu hóa học.
2.2.1.1.Phƣơng pháp chiết xuất [3].
Phƣơng pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết. Một phƣơng pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể đƣợc hoạch định khi biết rõ thành phần của các chất cần biết trong cây ra. Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi. Vì vậy không thể có một phƣơng pháp chiết xuất chung cho tất cả các dƣợc liệu.
Phƣơng pháp chiết có hai phƣơng pháp chiết:
- Phƣơng pháp 1: Phƣơng pháp chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu sơ bộ khi chƣa biết rõ thành phần hóa học của dƣợc liệu, dùng phƣơng pháp cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dƣợc liệu. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: ete dầu, ete, clorofoc, cồn và cuối cùng là nƣớc.
- Phƣơng pháp 2: Phƣơng pháp chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong dƣợc liệu thì dung môi thích hợp nhất metanol hoặc etanol (80%). Nhất là metanol đƣợc xem nhƣ là dung môi vạn năng, nó hòa tan đƣợc chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với metanol thu đƣợc, đem loại hết dung môi thu đƣợc cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dƣợc liệu. Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nƣớc và có độ phân cực từ yếu đến mạnh. Ví dụ dãy dung môi: Ete dầu, ete, clrofoc, etyl axetat, n-butanol.
Cách chiết có hai cách chiết chiết ở nhiệt độ thƣờng và chiết nóng. - Chiết ở nhiệt độ thƣờng: Cách chiết thông thƣờng là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 31
- Chiết nóng: Nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lƣu, nếu dung môi là nƣớc thì sắc đặc hoặc là hãm phân đoạn.
Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không dƣới áp suất giảm cho hiệu suất cao.
2.2.1.2.Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
Sắc ký lớp mỏng là công cụ đắc lực trong nghiên cứu dƣợc liệu vì đơn giản, ít tốn thiết bị và dung môi mà lại đạt hiệu quả cao.
Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đã đặt sẵn hỗn hợp chất cần phân tích. Pha tĩnh là chất hấp phụ đƣợc lựa chọn tùy theo yêu cầu phân tích, đƣợc trải mỏng đồng nhất và đƣợc cố định trên các phiến kính hoặc kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ nhất định tùy theo mục đích cụ thể. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc di chuyển trên lớp mỏng theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta thu đƣợc một sắc ký đồ trên lớp mỏng.
Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf đƣợc tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi (Hình 2.1). Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến giá trị Rf.
Hình 2.2:Cách tính giá trị Rf.
Rf = 𝒃
HVTH: Bá Thị Dƣơng 32
Các bƣớc trong kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Hình 2.2):
- Chuẩn bị bản mỏng (hiện nay, chủ yếu sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254, kích thƣớc 20×20 cm, dày 0,2 mm.)
- Chấm chất phân tích lên bản mỏng. - Triển khai sắc ký.
- Hiện vết trên bản mỏng. Có thể hiện vết bằng cách soi UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử (thuốc thử dùng trong luận án là Ce(SO4)2).
- Ghi lại kết quả.
2.2.1.3. Phƣơng pháp sắc ký cột (CC).
Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.
Giống nhƣ sắc ký lớp mỏng, phƣơng pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký.
Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột. Trong luận án này, sử dụng cột hấp phụ silica gel.
Kỹ thuật sắc ký cột
- Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: - Nhồi cột.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 33 - Đƣa chất cần phân tách lên cột - Rửa cột
Hình ảnh các bƣớc sắc ký cột (Hình 2.4):
2.2.1.4.Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc.
Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện đại. Tuy nhiên, phƣơng pháp phổ biến nhất là các phƣơng pháp đo phổ nhƣ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR,
13
C-NMR, DEPT,…).
Phổ khối lƣợng (MS).
Phổ khối lƣợng dựa trên sự phân tách chất tƣơng ứng khối lƣợng phân tử và nguyên tử bằng cách sử dụng từ trƣờng và điện trƣờng để tác động lên các hạt tích điện (ion) trong chân không. Phổ khối không xác định trực tiếp khối lƣợng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lƣợng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thƣờng là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lƣợng của ion. Dƣới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lƣợng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lƣợng của M+ chính là khối lƣợng của phân tử.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 34
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định. Các chất có cấu trúc tƣơng tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lƣợng phân tử và các mảnh của phân tử, cùng với các phƣơng pháp phổ khác ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc của một chất chƣa biết. So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất đó dễ dàng và chính xác.
Trong kỹ thuật này, các phân tử hợp chất bị bắn phá bởi chùm electron năng lƣợng cao, biến các phân tử thành ion. Sau đó, các ion này đƣợc tăng tốc trong một điện trƣờng. Tiếp theo, các ion tăng tốc đƣợc phân tách tƣơng ứng với tỉ lệ khối lƣợng/điện tích (m/z –số khối) trong một từ trƣờng hay điện trƣờng. Mỗi ion có một tỉ lệ m/z nhất định và đƣợc phát hiện bởi một thiết bị đo số lƣợng ion đập vào nó. Mỗi số khối của mỗi mảnh ion bị bắn phá sẽ cho một pic tƣơng ứng trên phổ đồ.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance ), là một phƣơng pháp phân tích hiện đại, đƣợc sử dụng rộng rãi trong hóa học.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.
Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học của các proton đƣợc xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào
HVTH: Bá Thị Dƣơng 35
cấu trúc hoá học của phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ chuyển dịch hoá học khác nhau. Dựa vào độ chuyển dịch hoá học, diện tích pic cũng nhƣ tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất.
Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng đƣợc tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).
Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phổ phân loại các bậc carbon khác nhau. Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4.
Phổ hồng ngoại (IR) [3].
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 10000 đến 100 cm-1
và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử. Sự biến đổi năng lƣợng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng quay. Sự hấp thụ này có định lƣợng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với cƣờng độ khác nhau, gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR). Mỗi loại dao động hấp thụ ở một tần số hay độ dài sóng xác định, phụ thuộc vào khối lƣợng tƣơng đối của các nguyên tử, hằng số lực các dây nối và cấu trúc hình học của nguyên tử. Do đó, phổ hồng ngoại cho phép xác định thông tin về cấu trúc hóa học nhƣ cấu dạng và nhóm chức đặc trƣng của hợp chất hữu cơ. 2.2.2. Phương pháp thử hoạt hoạt tính kháng khuẩn.
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh trên thực vật nhƣ: Đốm nâu trên hoa lan, khối u hình chóp trên thân cây, bạc lá bông gạo, thối loét, thối nhũn hay
HVTH: Bá Thị Dƣơng 36
vết đốm trên cây cà chua…v.v đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu Công nghệ Hóa học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Chemical Technology).
- Theo phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ in vitro [5].
- Môi trƣờng nuôi cấy TSB (Tryptone Soya Broth) : Đƣợc sử dụng để phục hồi các chủng vi sinh. Thành phần môi trƣờng nhƣ sau: Casein thuỷ phân 17,0g/l, Đậu nành thuỷ phân 3,0g/l, Sodium chloride 5g/l, Dipotassium phosphate 2,5g/l, Dextrose 2,5g/l, pH = 7,3.
- Các chủng đƣợc hoạt hóa trƣớc khi nuôi cấy với nồng độ 105
CFU/ml, - Thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, thời gian 24 giờ đến 48 giờ cho hầu hết các chủng (trừ hai chủng X.arboricola pruni và P. syringae pv.
actinidiae KW11 ở 25oC).
- Nồng độ thử: Pha lỏng 2 đến 4 nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ đƣợc lặp lại 2 lần.
+ Đối với chất thử nồng độ từ 600 – 9,5 µg/ml. + Đối với dịch chiết nồng độ từ 2000 – 31,25 µg/ml. - Đối chứng âm: DMSO 2%.
- Đối chứng dƣơng: Chloramphenicol (40 – 0,63 µg/ml), streptomycin sulfate (2000 µg/ml).
Sau khi ủ ở điều kiện trên, đọc độ đục ở bƣớc sóng 600 nm, thu đƣợc các giá trị OD của các giếng điều khiển.
[OD(đ/c) - OD(test)] x 100
% ức chế =
OD(đ/c) OD(đ/c): OD đối chứng.
OD (test): OD thử.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 37
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Xử lý mẫu thực nghiệm và nghiên cứu điều kiện chiết chiết xuất anthraquinon từ mẫu thực nghiệm. anthraquinon từ mẫu thực nghiệm.
3.1.1. Xử lý mẫu thực nghiệm.
Mẫu thực vật là củ của cây Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf), thu mua tại phố Lãn Ông – Hà Nội. Mẫu sau khi mua về đƣợc rửa sạch, chặt thành những miếng mỏng, sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60oC, rồi nghiền thành bột. Bảo quản trong túi nilon và lƣu giữ trong bình hút ẩm.
3.1.2. Nghiên cứu điều kiện chiết xuất anthraquinon từ mẫu thực nghiệm.
3.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết.
Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu bằng dung môi metanol, thay đổi