Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu bằng dung môi metanol, thay đổi điều kiện nhiệt độ chiết ở nhiệt độ phòng (25oC) và chiết nóng (chiết soxhlet).
Tiến hành thí nghiệm:
- Mẫu M1: Cân 100g bột củ Đại hoàng cho vào bình tam giác 500 ml
có nút nhám, cho thêm 300 ml metanol, tiến hành chiết 3 lần, ở nhiệt độ phòng, thời gian 24 giờ, lọc thu dịch chiết. Gom dịch các lần chiết lại, lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát hàm lƣợng cao chiết). Phần còn lại đƣợc loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc.
- Mẫu M2: Cân 100g bột củ Đại hoàng cho vào bình cầu 1000 ml, cho
thêm 600 ml metanol, tiến hành chiết soxhlet, gia nhiệt trong thời gian 2 giờ. Lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát hàm lƣợng cao chiết), phần còn lại đƣợc loại dung môi dƣới áp suất giảm th cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc.
- Xác định hàm lƣợng cao chiết, so sánh hàm lƣợng cao chiết theo hai phƣơng pháp chiết trên bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi triển
HVTH: Bá Thị Dƣơng 38
khai là n-hexan/etyl axetat (9/1 v/v và 6/4 v/v). Hiện vết dƣới ánh sáng đèn UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử Ce(SO4)2, đốt ở 110o
C. 3.1.2.2.Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất chiết.
Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu bằng dung môi metanol, chiết nóng (chiết soxhlet). Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hiệu xuất chiết, để xác định điều kiện chiết tối ƣu, tại các điều kiện thời gian chiết là: 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ.
Tiến hành thí nghiệm:
Cân 100g bột củ Đại hoàng, cho 600 ml metanol vào bình cầu 1000 ml, tiến hành chiết soxhlet, gia nhiệt tại nhiệt độ sôi metanol. Trong các điều kiện thời gian MT1 (0,5 giờ), MT2 (1 giờ), MT3 (2 giờ), MT4 (4 giờ). Lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát hàm lƣợng cao chiết), phần còn lại đƣợc loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc, xác định hàm lƣợng cao chiết thu đƣợc.
Khảo sát sơ bộ và so sánh hàm lƣợng cao chiết bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), hệ dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat (9/1 v/v và 6/4 v/v). Hiện vết dƣới ánh sáng đèn UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử Ce(SO4)2, đốt ở 110o
C.
3.1.2.3.Nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng anthraquinon. Cao chiết thu đƣợc theo mẫu MT3 (2 giờ) ở trên, acid hóa dịch chiết Cao chiết thu đƣợc theo mẫu MT3 (2 giờ) ở trên, acid hóa dịch chiết bằng dung dịch acid HCl 5% đến pH = 2 – 3, thấy xuất hiện kết tủa. Phần kết tủa đƣợc lọc và chiết trong các loại dung môi khác nhau nhƣ: n-hexan, diclometan, etyl axetat (mục đích chiết các thành phần anthraquinon dạng phenolic tự do có hàm lƣợng cao hơn).
HVTH: Bá Thị Dƣơng 39
Cân 10g cao chiết ở mẫu MT3 (2 giờ), acid hóa dịch chiết bằng 50 ml dung dịch acid HCl 5% đến pH = 2 – 3, thấy xuất hiện kết tủa. Phần kết tủa đƣợc lọc và chiết 3 lần với 200 ml dung môi khác nhau tƣơng ứng: MH (chiết trong n-hexan), MD (chiết trong diclometan), ME (chiết trong etyl axetat) trong bình cầu 500 ml. Sau đó đặt trong điều kiện cách thủy có sinh hàn hồi lƣu, thời gian 30 phút. Tiến hành lọc, thu phần dịch và phần cặn tủa. Gom dịch các lần chiết, lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát sơ bộ anthraquinon), phần còn lại loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc, xác định hàm lƣợng thu đƣợc trong các thí nghiệm với các dung môi khác nhau.
Khảo sát sơ bộ và so sánh hàm lƣợng anthraquinon có trong dịch chiết bằng các phƣơng pháp sử dụng dung môi khác nhau. Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), hệ dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat (9/1 v/v và 6/4 v/v). Hiện vết anthraquinon dƣới ánh sáng đèn UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử Ce(SO4)2, đốt ở 110o
C.
3.2. Chiết xuất mẫu thực nghiệm và phân đoạn hóa cặn chiết.
Từ kết quả nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ mẫu Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf), nhƣ đã trình bày ở mục 3.1.2, chúng tôi tiến hành thực nghiệm với nguyên liệu lớn 3 kg bột củ Đại hoàng, các bƣớc tiến hành đƣợc trình bày nhƣ mô tả dƣới đây.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 40
3.2.1. Xử lý bột Đại hoàng.
Sơ đồ 3.1:Sơ đồ xử lý bột Đại hoàng.
Cân 3 kg bột Đại hoàng đã đƣợc sơ chế theo mục 3.1.1. Chiết 3 lần, mỗi lần với 7 lít dung môi metanol, thời gian 24 giờ, ở nhiệt độ phòng. Tiến hành lọc qua lớp vải thô thu dịch chiết, gom dịch chiết, đem lọc lại bằng giấy lọc để loại hết tạp cơ học. Sau đó, loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc 881,6 g cao chiết metanol, các bƣớc đƣợc trình bày nhƣ sơ đồ 3.1. ở trên.
3.2.2. Xử lý cao chiết metanol.
Phần cao chiết metanol lại tiếp tục đƣợc xử lý nhƣ sau (Sơ đồ 3.2):
Bột Đại hoàng - Chiết 3 lần bằng metanol ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. - Lọc thô Bã Dịch chiết metanol - Lọc
- Loại dung môi
HVTH: Bá Thị Dƣơng 41
Acid hóa 881,6 g cao chiết metanol bằng 4 lít dung dịch acid HCl 5% đến pH= 2 – 3, thấy xuất hiện kết tủa. Lọc thu đƣợc 236,7 g kết tủa A và dịch chiết B.
Kết tủa A, lắc 3 lần với diclometan, mỗi lần 750 ml. Lọc và gom dịch lọc của 3 lần, loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc 32,9 g cặn chiết diclometan.
Cao metanol
- Acid hóa bằng dung dịch acid HCl 5% đến pH = 2 – 3.
- Lọc
Kết tủa A Dịch chiết B
Chiết với diclometan (3 lần )
Dịch diclometan Cặn không tan
Loại dung môi (dƣới áp suất giảm)
Cặn diclometan
HVTH: Bá Thị Dƣơng 42
3.3. Phân lập một số hoạt chất có trong cặn diclometan.
3.3.1. Khảo sát sơ bộ cặn diclometan bằng sắc ký lớp mỏng.
Khảo sát sắc ký lớp mỏng cặn diclometan, với hệ dung môi triển khai n-hexan/etyl axetat (H/E) với tỷ lệ: 9/1; 8/2; 7/3; 6/4. Hiện vết dƣới ánh sáng đèn UV bƣớc sóng 254 nm và Ce(SO4)2, đốt ở 110oC, kết quả nhƣ hình 3.1.
Hình 3.1: Hình ảnh khảo sát sắc ký lớp mỏng (TLC) của cặn diclometan Hệ dung môi n-hexan : etyl axetat (H/E) = 9/1, nhận thấy trên bản mỏng sau khi hiện dƣới ánh sáng đèn UV 254 nm cho 3 chấm màu vàng có độ đậm nhạt khác nhau và khoảng cách tƣơng đối xa nhau, các vết đƣợc hiện rõ hơn sau khi hiện Ce(SO4)2. Với các hệ dung môi n-hexan: etyl axetat (H/E) = 8/2, và 7/3 nhận thấy trên bản mỏng với độ phân cực tăng dần có số lƣợng vết càng nhiều. Ở bản mỏng với hệ dung môi n-hexan: etyl axetat (H/E) = 6/4 sau khi hiện bản mỏng ở UV 254 nm và hiện thuốc thử Ce(SO4)2 có 4 vết màu vàng và nhiều vết màu xanh và quan trọng hơn các vết có giá trị Rf khác biệt nhau tƣơng đối lớn và có độ đậm nhạt khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chọn hệ dung môi n-hexan : etyl axetat (H/E) để sắc ký cột cặn diclometan trong điều kiện tƣơng tự trên.
3.3.2. Phân lập cặn diclometan.
Tiến hành chạy sắc ký cột với 20 g cặn diclometan:
HVTH: Bá Thị Dƣơng 43 Chuẩn bị chất chạy cột:
Hòa tan 20g cặn diclometan trong một lƣợng dung môi diclometan tối thiểu và tẩm với 40 g silica gel cỡ vừa (0,04 – 0,064 mm). Loại dung môi dƣới áp suất giảm đến khô.
Chuẩn bị cột:
- Chọn cột 45 mm, dài 70 cm, có van khóa teglon. Rửa sạch, tráng cột bằng metanol và sấy khô. Lót dƣới đáy cột một ít bông.
- Chuẩn bị silica gel theo phƣơng pháp nhồi ƣớt: Cân 400 g silica gel cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm. Hoạt silica gel ở 110 – 120°C trong 1 – 2 giờ. Ngâm silica gel đã hoạt hóa đến trƣơng nở hoàn toàn trong n-hexan. Trong quá trình ngâm, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều.
Nhồi cột:
- Dựng cột thẳng đứng. Rót từ từ hỗn dịch silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa gõ nhẹ để đuổi bọt khí và tăng độ đồng đều. Mở van khóa cho dung môi chảy và silica gel sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột.
- Khi dung môi chảy gần hết trong cột thì tiếp tục rót hỗn dịch silica gel vào cột. Lặp lại đến khi đổ hết hỗn dịch silica gel vào cột. Trong quá trình đổ hỗn dịch, tuyệt đối không để khô dung môi trong cột.
- Lƣợng dung môi hứng đƣợc lại tiếp tục đƣợc đổ lên cột và cho chảy liên tục. Chạy ổn định cột một thời gian trƣớc khi đƣa chất lên cột. Khi dung môi cách bề mặt chất hấp phụ 1 – 2 cm, khóa van, gõ cho phẳng bề mặt cột. Rải chất thành một lớp đều đặn trên mặt cột.
Chạy cột:
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan/etyl axetat (H/E) và etyl axetat/metanol (E/M) theo độ tăng dần của hệ dung môi phân cực, thu đƣợc hình ảnh nhƣ hình 3.2.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 44
Hình 3.2: Hình ảnh cột đƣợc rửa giải bằng dung môi n-hexan/etyl axetat và
etyl axetat/metanol (E/M) theo độ phân cực tăng dần của hệ dung môi. Hứng dịch rửa giải trong bình tam giác khoảng 400 – 500 ml. Loại bớt dung môi (bằng máy cô quay chân không dƣới áp suất giảm) và gom dịch vào ống nghiệm và tỷ lệ cụ thể theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hệ dung môi rửa giải trong phân lập cặn chiết diclometan. ST
T Hệ dung môi
Lƣợng dung môi
dùng Dịch rửa giải thu đƣợc 1 n-hexan 100% 3000 ml Ống nghiệm 1 – 7 2 H:E = 99:1 4000 ml Ống nghiệm 8 – 17 3 H:E = 98:2 4000 ml Ống nghiệm 18 - 28 4 H:E = 96:4 4000 ml Ống nghiệm 29 – 37 5 H:E = 92:8 4000 ml Ống nghiệm 37 – 47 6 H:E = 85:15 4000 ml Ống nghiệm 48 – 58 7 H:E = 70:30 4000 ml Ống nghiệm 59 – 66
HVTH: Bá Thị Dƣơng 45 8 H:E = 30:70 4000 ml Ống nghiệm 67 – 79 9 H:E = 0:100 1000 ml Ống nghiệm 80 – 82 10 E:M = 90:10 2000 ml Ống nghiệm 83 – 86 11 E:M = 50:50 2000 ml Ống nghiệm 87 – 90 12 Metanol 100% 2000 ml
Kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, tiến hành gom các ống nghiệm có các vết chất tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng thu đƣợc các phân đoạn khác nhau (Bảng 3.2).
Bảng 3.2: Các phân đoạn phân lập đƣợc từ cặn diclometan. STT Phân
đoạn Ống gom Khối lƣợng Ghi chú 1 C.1.1 1 – 20
2 C.1.2 21 – 23
3 C.1.3 24 – 31
4 C.1.4 32 – 36 2,204 g Hiện rõ hai vết đậm màu vàng.
5 C.1.5 37 – 48 2,717 g Hiện rõ hai vết đậm màu vàng và một vệt màu xanh. 6 C.1.6 49 – 56 7 C.1.7 57 – 66 8 C.1.8 67 – 79 9 C.1.9 80 – 86 1,985 g Nhiều vết chất. 10 C.1.10 87 – 90 11 C.1.11 Rửa Metanol
HVTH: Bá Thị Dƣơng 46 Xử lý một số phân đoạn:
Sau một thời gian, ở các phân đoạn C.1.3, C.1.6 và C.1.7, C1.8 thấy xuất hiện tinh thể:
- Phân đoạn C.1.3 xuất hiện kết tinh hình kim, màu vàng tƣơi. Dùng công tơ hút loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,426 g. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi thu đƣợc duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra với hai hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4 đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn với Rf × 100 = 43,7; 57,7; 57,5 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 92:8; H:E = 9:1; H:D = 6:4. Chúng tôi ký hiệu là chất DH01.
- Phân đoạn C.1.6 xuất hiện kết tinh dạng tấm, màu vàng cam. Dùng công tơ hút loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,305 g. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi chỉ thu đƣợc duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra với hai hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4 đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn với Rf × 100 = 33,3; 40,5; 50,1 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 92:8; H:E = 9:1; H:D = 6:4. Chúng tôi ký hiệu là DH02.
- Phân đoạn C.1.7 xuất hiện kết tinh hình kim, màu cam. Dùng công tơ hút loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,357 g. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi chỉ thu đƣợc duy nhất một chấm tròn màu vàng. Kiểm tra với hai hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4
đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn với Rf × 100 = 30,7; 47,5 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 4:1 và H:E = 3:1. Chúng tôi ký hiệu là DH03.
- Phân đoạn C.1.8 xuất hiện tinh thể vô định hình, màu xám. Dùng công tơ hút sạch loại hết dịch, rửa sạch, và sấy khô thu đƣợc 0,9427 g chất. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau, chúng tôi chỉ thu đƣợc duy nhất một chấm tròn hóa nâu trong không khí. Kiểm tra với hai
HVTH: Bá Thị Dƣơng 47
hệ thuốc thử Ce(SO4)2 và H2SO4 đặc vẫn chỉ thu đƣợc một chấm tròn màu xanh với Rf × 100 = 35,5; 67,7 trong các hệ dung môi tƣơng ứng H:E = 1:3 và D:M = 92:8. Chúng tôi ký hiệu là chất DH04.
3.4.Tính chất vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập đƣợc.
3.4.1 Tính chất vật lý.
- DH01: Chất rắn màu vàng tƣơi (0,426 g), tan trong CH2Cl2, nhiệt độ nóng chảy 196 – 197°C.
- DH02: Chất rắn màu vàng cam (0,305 g), tan trong CH2Cl2, nhiệt độ nóng chảy 202,2 – 204°C.
- DH03: Chất rắn màu cam (0,357 g), tan trong CH2Cl2, nhiệt độ nóng chảy 256 – 257°C.
- DH04: Tinh thể màu nâu nhạt (0,9427 g), tan tốt trong metanol, ít tan
trong CH2Cl2. C. 1.1 Cặn diclometan (20 g) C. 1.2 DH 01 DH 02 DH 03
Sơ đồ 3.3: Sơ đồ phân lập cặn diclometan.
C. 1.3 C. 1.4 C. 1.5 C. 1.6 C. 1.7 C. 1.9 C. 1.8 C. 1.10 C. 1.11 DH 04
HVTH: Bá Thị Dƣơng 48
3.4.2.Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được.
3.4.2.1.Dữ liệu phổ của hợp chất DH01. 1 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3 ) δH (ppm): 12,116 (1H; s; H-8); 12,008 (1H; s; H-1); 7,817 (1H; d; J = 9,0 Hz; H-5); 7,663 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-6); 7,648 (1H; s; H-4); 7,276 (1H; d; J = 8,5 Hz; H-7); 7,095 (1H; s; H-2); 2,462 (3H; s; 3-CH3); 13C-NMR (125 MHz; CDCl3 ) δC(ppm) : 192,57 (C-9); 182,02 (C-10); 162,75 (C-1); 162,45 (C-8); 149,36 (C-3); 136,97 (C-6); 133,68 (C-4a); 133,31 (C-10a); 124,57 (C-7); 124,38 (C-2); 121,38 (C-4); 119,95 (C-5); 115,90 (C-8a); 113,77 (C-9a); 22,28 (3-CH3). 3.4.2.2.Dữ liệu phổ của hợp chất DH02. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δH (ppm) : 12,295 (1H; s; H-1), 12,097 (1H; s; H-8); 7,610 (1H; s; H-4); 7,348 (1H; d; J = 1,5 Hz, H-5); 7,067 (1H; s; H-2); 6,670 (1H; d; J = 1.5 Hz; H-7); 3,930 (3H; s; OCH3); 2,442 (3H; s; 3- CH3); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δC (ppm): 191,80 (C-9); 182,01 (C-10); 166,56 (C-8); 165,20 (C-1); 162,52 (C-6); 148,45 (C-3); 135,27 (C-10a); 133,23 (C-4a), 124,51 (C-2); 121,29 (C-4); 113,69 (C-9a); 110,27 (C-8a); 108,22 (C-5); 106,78 (C-7); 56,09 (6-OCH3); 22,16 (3-CH3). 3.4.2.3 Dữ liệu phổ của hợp chất DH03. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH (ppm): 12,092 (1H; s; H-1); 12,022 (1H; s; H-8); 7,498 (1H; s; H-4); 7,175 (1H; s; H-2); 7,122 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-5); 6,598 (1H; d; J = 2.0 Hz; H-7); 2,420 (3H; s; 3-CH3); 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC (ppm): 190,18 (C-9); 181,88 (C- 10), 166,08 (C-8); 164,93 (C-1); 161,89 (C-6); 148,73 (C-3); 135,60 (C-10a); 133,31 (C-4a); 124,61 (C-4); 120,95 (C-2); 113,86 (C-9a); 109,42 (C-5); 109,27 (C-8a); 108,41 (C-7); 21,99 (3-CH3).
HVTH: Bá Thị Dƣơng 49 3.4.2.4 Dữ liệu phổ của hợp chất DH04. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH (ppm): 6,996 (1H; d; J = 1.5 Hz; H- 2'); 6,886 (1H; d; J = 14.5 Hz, H-β); 6,877 (2H; m; H-5'; H-6'); 6,763 (1H; d; J =16.0 Hz; H-α); 6,438 (2H; d; J = 2.0 Hz; H-2, 6); 6,158 (1H; d; J = 2,0 Hz; H-4), 3,840 (3H; s; 4'-OCH3). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC (ppm) : 158,27 (C-3, 5); 147,58 (C-4'), 146,31 (C-3'); 139,73 (C-1); 130,82 (C-1'); 127,97 (C-α); 126,47 (C- β); 118,64 (C-2’); 112,20 (C-6'); 111,34 (C-5'); 104,47 (C-2, 6); 101,41 (C- 4); 55,02 (4'-OCH3).
3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn.
Các cặn chiết và các hợp chất phân lập đƣợc, đƣợc thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên 7 loại vi khuẩn gây bệnh thử nghiệm là: Vi khuẩn gây bệnh đốm nâu trên hoa lan (Acidovorax avenae subsp. Cattlyae), vi khuẩn gây bệnh khối u hình chóp trên thân cây (Agrobacterium tumefaciens), vi khuẩn gây bệnh bạc lá bông gạo (Burkholderia glumae), vi khuẩn gây bệnh thối loét cà chua (Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis), vi khuẩn gâybệnh thối nhũn trên thân và lá (Pectobacterium carotovara subsp. Carotorova), vi khuẩn gây bệnh vết đốm trên quả và lá (Xanthomonas arboricola pruni), vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên quả và lá (Ralstonia solanacearum). Phƣơng pháp thử nghiệm đƣợc trình bày nhƣ mục 2.2.2.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 50
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ mẫu thực nghiệm. thực nghiệm.
4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết.