Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định đƣợc nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh.
Giống nhƣ sắc ký lớp mỏng, phƣơng pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong quá trình sắc ký.
Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất đƣợc sử dụng làm cột. Trong luận án này, sử dụng cột hấp phụ silica gel.
Kỹ thuật sắc ký cột
- Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: - Nhồi cột.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 33 - Đƣa chất cần phân tách lên cột - Rửa cột
Hình ảnh các bƣớc sắc ký cột (Hình 2.4):
2.2.1.4.Phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc.
Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện đại. Tuy nhiên, phƣơng pháp phổ biến nhất là các phƣơng pháp đo phổ nhƣ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR,
13
C-NMR, DEPT,…).
Phổ khối lƣợng (MS).
Phổ khối lƣợng dựa trên sự phân tách chất tƣơng ứng khối lƣợng phân tử và nguyên tử bằng cách sử dụng từ trƣờng và điện trƣờng để tác động lên các hạt tích điện (ion) trong chân không. Phổ khối không xác định trực tiếp khối lƣợng của ion mà xác định tỉ lệ giữa khối lƣợng (m) và điện tích (z) của ion (m/z). Ở các phân tử nhỏ, điện tích của ion thƣờng là 1 nên giá trị m/z của phổ khối liên quan trực tiếp tới khối lƣợng của ion. Dƣới những điều kiện nhất định, phân tử các chất bị mất đi electron tạo nên ion phân tử (hay còn gọi la ion mẹ) M+. Ion mẹ này có thể tiếp tục “vỡ” ra thành các mảnh nhỏ hơn là các ion con và các mảnh trung hòa. Vì khối lƣợng của các electron rất nhỏ có thể bỏ qua, nên khối lƣợng của M+ chính là khối lƣợng của phân tử.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 34
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những quy định nhất định. Các chất có cấu trúc tƣơng tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lƣợng phân tử và các mảnh của phân tử, cùng với các phƣơng pháp phổ khác ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc của một chất chƣa biết. So sánh phổ khối của một chất với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất đó dễ dàng và chính xác.
Trong kỹ thuật này, các phân tử hợp chất bị bắn phá bởi chùm electron năng lƣợng cao, biến các phân tử thành ion. Sau đó, các ion này đƣợc tăng tốc trong một điện trƣờng. Tiếp theo, các ion tăng tốc đƣợc phân tách tƣơng ứng với tỉ lệ khối lƣợng/điện tích (m/z –số khối) trong một từ trƣờng hay điện trƣờng. Mỗi ion có một tỉ lệ m/z nhất định và đƣợc phát hiện bởi một thiết bị đo số lƣợng ion đập vào nó. Mỗi số khối của mỗi mảnh ion bị bắn phá sẽ cho một pic tƣơng ứng trên phổ đồ.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR).
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân viết tắt là NMR (Nuclear Magnetic Resonance ), là một phƣơng pháp phân tích hiện đại, đƣợc sử dụng rộng rãi trong hóa học.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kĩ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.
Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR độ chuyển dịch hoá học của các proton đƣợc xác định trong thang TMS từ 0 ppm đến 14 ppm tuỳ thuộc vào
HVTH: Bá Thị Dƣơng 35
cấu trúc hoá học của phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ chuyển dịch hoá học khác nhau. Dựa vào độ chuyển dịch hoá học, diện tích pic cũng nhƣ tƣơng tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất.
Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu phổ vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng đƣợc tính bằng ppm với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm).
Phổ DEPT: Phổ này cho các tín hiệu phổ phân loại các bậc carbon khác nhau. Trên phổ DEPT 135 không cho tín hiệu của carbon bậc 4, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, còn tín hiệu của CH2 nằm về phía đối diện. Trên phổ DEPT 90 chỉ có duy nhất tín hiệu phổ của CH. Kết hợp phổ 13C-NMR và phổ DEPT sẽ cho ta biết chính xác số carbon bậc 1, 2, 3, 4.
Phổ hồng ngoại (IR) [3].
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong vùng từ 10000 đến 100 cm-1
và biến thành năng lƣợng của dao động phân tử. Sự biến đổi năng lƣợng dao động này luôn đi kèm với sự biến đổi năng lƣợng quay. Sự hấp thụ này có định lƣợng và biểu hiện thành các dải hấp thụ với cƣờng độ khác nhau, gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại (IR). Mỗi loại dao động hấp thụ ở một tần số hay độ dài sóng xác định, phụ thuộc vào khối lƣợng tƣơng đối của các nguyên tử, hằng số lực các dây nối và cấu trúc hình học của nguyên tử. Do đó, phổ hồng ngoại cho phép xác định thông tin về cấu trúc hóa học nhƣ cấu dạng và nhóm chức đặc trƣng của hợp chất hữu cơ. 2.2.2. Phương pháp thử hoạt hoạt tính kháng khuẩn.
- Các chủng vi khuẩn gây bệnh trên thực vật nhƣ: Đốm nâu trên hoa lan, khối u hình chóp trên thân cây, bạc lá bông gạo, thối loét, thối nhũn hay
HVTH: Bá Thị Dƣơng 36
vết đốm trên cây cà chua…v.v đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu Công nghệ Hóa học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Chemical Technology).
- Theo phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ in vitro [5].
- Môi trƣờng nuôi cấy TSB (Tryptone Soya Broth) : Đƣợc sử dụng để phục hồi các chủng vi sinh. Thành phần môi trƣờng nhƣ sau: Casein thuỷ phân 17,0g/l, Đậu nành thuỷ phân 3,0g/l, Sodium chloride 5g/l, Dipotassium phosphate 2,5g/l, Dextrose 2,5g/l, pH = 7,3.
- Các chủng đƣợc hoạt hóa trƣớc khi nuôi cấy với nồng độ 105
CFU/ml, - Thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, thời gian 24 giờ đến 48 giờ cho hầu hết các chủng (trừ hai chủng X.arboricola pruni và P. syringae pv.
actinidiae KW11 ở 25oC).
- Nồng độ thử: Pha lỏng 2 đến 4 nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ đƣợc lặp lại 2 lần.
+ Đối với chất thử nồng độ từ 600 – 9,5 µg/ml. + Đối với dịch chiết nồng độ từ 2000 – 31,25 µg/ml. - Đối chứng âm: DMSO 2%.
- Đối chứng dƣơng: Chloramphenicol (40 – 0,63 µg/ml), streptomycin sulfate (2000 µg/ml).
Sau khi ủ ở điều kiện trên, đọc độ đục ở bƣớc sóng 600 nm, thu đƣợc các giá trị OD của các giếng điều khiển.
[OD(đ/c) - OD(test)] x 100
% ức chế =
OD(đ/c) OD(đ/c): OD đối chứng.
OD (test): OD thử.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 37
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Xử lý mẫu thực nghiệm và nghiên cứu điều kiện chiết chiết xuất anthraquinon từ mẫu thực nghiệm. anthraquinon từ mẫu thực nghiệm.
3.1.1. Xử lý mẫu thực nghiệm.
Mẫu thực vật là củ của cây Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf), thu mua tại phố Lãn Ông – Hà Nội. Mẫu sau khi mua về đƣợc rửa sạch, chặt thành những miếng mỏng, sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60oC, rồi nghiền thành bột. Bảo quản trong túi nilon và lƣu giữ trong bình hút ẩm.
3.1.2. Nghiên cứu điều kiện chiết xuất anthraquinon từ mẫu thực nghiệm.
3.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết.
Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu bằng dung môi metanol, thay đổi điều kiện nhiệt độ chiết ở nhiệt độ phòng (25oC) và chiết nóng (chiết soxhlet).
Tiến hành thí nghiệm:
- Mẫu M1: Cân 100g bột củ Đại hoàng cho vào bình tam giác 500 ml
có nút nhám, cho thêm 300 ml metanol, tiến hành chiết 3 lần, ở nhiệt độ phòng, thời gian 24 giờ, lọc thu dịch chiết. Gom dịch các lần chiết lại, lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát hàm lƣợng cao chiết). Phần còn lại đƣợc loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc.
- Mẫu M2: Cân 100g bột củ Đại hoàng cho vào bình cầu 1000 ml, cho
thêm 600 ml metanol, tiến hành chiết soxhlet, gia nhiệt trong thời gian 2 giờ. Lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát hàm lƣợng cao chiết), phần còn lại đƣợc loại dung môi dƣới áp suất giảm th cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc.
- Xác định hàm lƣợng cao chiết, so sánh hàm lƣợng cao chiết theo hai phƣơng pháp chiết trên bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với hệ dung môi triển
HVTH: Bá Thị Dƣơng 38
khai là n-hexan/etyl axetat (9/1 v/v và 6/4 v/v). Hiện vết dƣới ánh sáng đèn UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử Ce(SO4)2, đốt ở 110o
C. 3.1.2.2.Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất chiết.
Tiến hành ngâm chiết nguyên liệu bằng dung môi metanol, chiết nóng (chiết soxhlet). Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết đến hiệu xuất chiết, để xác định điều kiện chiết tối ƣu, tại các điều kiện thời gian chiết là: 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ.
Tiến hành thí nghiệm:
Cân 100g bột củ Đại hoàng, cho 600 ml metanol vào bình cầu 1000 ml, tiến hành chiết soxhlet, gia nhiệt tại nhiệt độ sôi metanol. Trong các điều kiện thời gian MT1 (0,5 giờ), MT2 (1 giờ), MT3 (2 giờ), MT4 (4 giờ). Lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát hàm lƣợng cao chiết), phần còn lại đƣợc loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc, xác định hàm lƣợng cao chiết thu đƣợc.
Khảo sát sơ bộ và so sánh hàm lƣợng cao chiết bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), hệ dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat (9/1 v/v và 6/4 v/v). Hiện vết dƣới ánh sáng đèn UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử Ce(SO4)2, đốt ở 110o
C.
3.1.2.3.Nghiên cứu ảnh hƣởng của dung môi đến hàm lƣợng anthraquinon. Cao chiết thu đƣợc theo mẫu MT3 (2 giờ) ở trên, acid hóa dịch chiết Cao chiết thu đƣợc theo mẫu MT3 (2 giờ) ở trên, acid hóa dịch chiết bằng dung dịch acid HCl 5% đến pH = 2 – 3, thấy xuất hiện kết tủa. Phần kết tủa đƣợc lọc và chiết trong các loại dung môi khác nhau nhƣ: n-hexan, diclometan, etyl axetat (mục đích chiết các thành phần anthraquinon dạng phenolic tự do có hàm lƣợng cao hơn).
HVTH: Bá Thị Dƣơng 39
Cân 10g cao chiết ở mẫu MT3 (2 giờ), acid hóa dịch chiết bằng 50 ml dung dịch acid HCl 5% đến pH = 2 – 3, thấy xuất hiện kết tủa. Phần kết tủa đƣợc lọc và chiết 3 lần với 200 ml dung môi khác nhau tƣơng ứng: MH (chiết trong n-hexan), MD (chiết trong diclometan), ME (chiết trong etyl axetat) trong bình cầu 500 ml. Sau đó đặt trong điều kiện cách thủy có sinh hàn hồi lƣu, thời gian 30 phút. Tiến hành lọc, thu phần dịch và phần cặn tủa. Gom dịch các lần chiết, lấy 2 ml dịch chiết vào ống đựng mẫu (làm mẫu khảo sát sơ bộ anthraquinon), phần còn lại loại dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc cao chiết, sấy khô ở nhiệt độ 60oC. Cân khối lƣợng cao chiết thu đƣợc, xác định hàm lƣợng thu đƣợc trong các thí nghiệm với các dung môi khác nhau.
Khảo sát sơ bộ và so sánh hàm lƣợng anthraquinon có trong dịch chiết bằng các phƣơng pháp sử dụng dung môi khác nhau. Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC), hệ dung môi triển khai là n-hexan/etyl axetat (9/1 v/v và 6/4 v/v). Hiện vết anthraquinon dƣới ánh sáng đèn UV (bƣớc sóng 254 và 365 nm) hoặc phun thuốc thử Ce(SO4)2, đốt ở 110o
C.
3.2. Chiết xuất mẫu thực nghiệm và phân đoạn hóa cặn chiết.
Từ kết quả nghiên cứu khảo sát điều kiện chiết anthraquinon từ mẫu Đại hoàng (Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf), nhƣ đã trình bày ở mục 3.1.2, chúng tôi tiến hành thực nghiệm với nguyên liệu lớn 3 kg bột củ Đại hoàng, các bƣớc tiến hành đƣợc trình bày nhƣ mô tả dƣới đây.
HVTH: Bá Thị Dƣơng 40
3.2.1. Xử lý bột Đại hoàng.
Sơ đồ 3.1:Sơ đồ xử lý bột Đại hoàng.
Cân 3 kg bột Đại hoàng đã đƣợc sơ chế theo mục 3.1.1. Chiết 3 lần, mỗi lần với 7 lít dung môi metanol, thời gian 24 giờ, ở nhiệt độ phòng. Tiến hành lọc qua lớp vải thô thu dịch chiết, gom dịch chiết, đem lọc lại bằng giấy lọc để loại hết tạp cơ học. Sau đó, loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc 881,6 g cao chiết metanol, các bƣớc đƣợc trình bày nhƣ sơ đồ 3.1. ở trên.
3.2.2. Xử lý cao chiết metanol.
Phần cao chiết metanol lại tiếp tục đƣợc xử lý nhƣ sau (Sơ đồ 3.2):
Bột Đại hoàng - Chiết 3 lần bằng metanol ở nhiệt độ phòng, 24 giờ. - Lọc thô Bã Dịch chiết metanol - Lọc
- Loại dung môi
HVTH: Bá Thị Dƣơng 41
Acid hóa 881,6 g cao chiết metanol bằng 4 lít dung dịch acid HCl 5% đến pH= 2 – 3, thấy xuất hiện kết tủa. Lọc thu đƣợc 236,7 g kết tủa A và dịch chiết B.
Kết tủa A, lắc 3 lần với diclometan, mỗi lần 750 ml. Lọc và gom dịch lọc của 3 lần, loại dung môi dƣới áp suất giảm, thu đƣợc 32,9 g cặn chiết diclometan.
Cao metanol
- Acid hóa bằng dung dịch acid HCl 5% đến pH = 2 – 3.
- Lọc
Kết tủa A Dịch chiết B
Chiết với diclometan (3 lần )
Dịch diclometan Cặn không tan
Loại dung môi (dƣới áp suất giảm)
Cặn diclometan
HVTH: Bá Thị Dƣơng 42
3.3. Phân lập một số hoạt chất có trong cặn diclometan.
3.3.1. Khảo sát sơ bộ cặn diclometan bằng sắc ký lớp mỏng.
Khảo sát sắc ký lớp mỏng cặn diclometan, với hệ dung môi triển khai n-hexan/etyl axetat (H/E) với tỷ lệ: 9/1; 8/2; 7/3; 6/4. Hiện vết dƣới ánh sáng đèn UV bƣớc sóng 254 nm và Ce(SO4)2, đốt ở 110oC, kết quả nhƣ hình 3.1.
Hình 3.1: Hình ảnh khảo sát sắc ký lớp mỏng (TLC) của cặn diclometan Hệ dung môi n-hexan : etyl axetat (H/E) = 9/1, nhận thấy trên bản mỏng sau khi hiện dƣới ánh sáng đèn UV 254 nm cho 3 chấm màu vàng có độ đậm nhạt khác nhau và khoảng cách tƣơng đối xa nhau, các vết đƣợc hiện rõ hơn sau khi hiện Ce(SO4)2. Với các hệ dung môi n-hexan: etyl axetat (H/E) = 8/2, và 7/3 nhận thấy trên bản mỏng với độ phân cực tăng dần có số lƣợng vết càng nhiều. Ở bản mỏng với hệ dung môi n-hexan: etyl axetat (H/E) = 6/4 sau khi hiện bản mỏng ở UV 254 nm và hiện thuốc thử Ce(SO4)2 có 4 vết màu vàng và nhiều vết màu xanh và quan trọng hơn các vết có giá trị Rf khác biệt nhau tƣơng đối lớn và có độ đậm nhạt khác nhau. Vì vậy, chúng tôi chọn hệ dung môi n-hexan : etyl axetat (H/E) để sắc ký cột cặn diclometan trong điều kiện tƣơng tự trên.
3.3.2. Phân lập cặn diclometan.
Tiến hành chạy sắc ký cột với 20 g cặn diclometan: