Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii và Piper hymenophyllum Miq., họ Hồ tiêu (Piperaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE CỦA HAI LOÀI Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii VÀ Piper hymenophyllum Miq., HỌ HỒ TIÊU (Piperaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ : 62.72.04.06 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. ĐỖ QUYÊN 2. PGS. TS. NGUYỄN MINH CHÍNH HÀ NỘI 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án này là công trình khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Đỗ Quyên và PGS. TS. Nguyễn Minh Chính. Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả thực hiện luận án Hoàng Việt Dũng ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học cùng đồng nghiệp và bạn bè công tác tại nhiều cơ quan và đơn vị khác nhau. Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Đỗ Quyên và PGS. TS. Nguyễn Minh Chính, hai người thầy luôn tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã luôn nhận được sự phối hợp và giúp đỡ của các cá nhân ở nhiều cơ quan và đơn vị khác nhau. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị đồng nghiệp và bạn bè công tác tại Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội; Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân y; Viện Hóa sinh biển, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Khoa Dược, Đại học Catholic, Daegu, Hàn Quốc. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội; Đảng ủy, Ban Giám đốc - Học viện Quân y cùng các bộ môn và phòng ban chức năng của hai cơ quan đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn tất cả những giúp đỡ quý báu này! Hoàng Việt Dũng iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về chi Piper L. 3 1.1.1. Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Piper L. 3 1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Piper L. 3 1.1.1.2. Đặc điểm phân bố chi Piper L. trên thế giới và ở Việt Nam 3 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Piper L. 5 1.1.1.4. Danh lục các loài thuộc chi Piper L. ở Việt Nam 7 1.1.2. Thành phần hóa học 9 1.1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới 9 1.1.2.2. Nghiên cứu trong nước 23 1.1.3. Công dụng, tác dụng sinh học và độc tính của chi Piper L. 24 1.1.3.1. Công dụng của chi Piper L. 24 1.1.3.2. Tác dụng sinh học và độc tính của chi Piper L. 27 1.2. Tổng quan về nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 36 1.2.1. Acetylcholin, enzym acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 36 1.2.1.1. Acetylcholin 36 1.2.1.2. Enzym acetylcholinesterase 37 1.2.1.3. Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 38 1.2.2. Một số phương pháp thường dùng trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 38 1.2.2.1. Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman 38 1.2.2.2. Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B 40 iv CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Nguyên vật liệu 44 2.1.1. Mẫu nghiên cứu 44 2.1.2. Hóa chất, dung môi 44 2.1.3. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 44 2.2. Phương pháp nghiên cứu 45 2.2.1. Phân tích đặc điểm thực vật 45 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 46 2.2.2.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất 46 2.2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được 48 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 48 2.2.3.1. Triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 48 2.2.3.2. Đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của hai loài nghiên cứu 544 2.3. Xử lý số liệu 555 2.4. Địa điểm thực hiện 555 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 566 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật 56 3.1.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật của loài HVD-002-11 56 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài HVD-002-11 56 3.1.1.2. Đặc điểm vi phẫu của loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii 57 3.1.1.3. Đặc điểm bột phần trên mặt đất của loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii 59 3.1.2. Kết quả nghiên cứu về thực vật của loài HVD-004-11 61 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái và định tên khoa học loài HVD-004-11 61 3.1.2.2. Đặc điểm vi phẫu của loài Piper hymenophyllum Miq. 62 3.1.2.3. Đặc điểm bột phần trên mặt đất của loài Piper hymenophyllum Miq. 64 3.2. Kết quả nghiên cứu về hóa học 66 v 3.2.1. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii 66 3.2.1.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii 66 3.2.1.2. Kết quả nhận dạng hợp chất phân lập được từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii 71 3.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của loài Piper hymenophyllum Miq. 82 3.2.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập hợp chất từ loài Piper hymenophyllum Miq. 82 3.2.2.2. Kết quả nhận dạng hợp chất phân lập được từ loài Piper hymenophyllum Miq. 85 3.3. Kết quả triển khai phương pháp và áp dụng để đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của hai loài nghiên cứu 102 3.3.1. Triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 102 3.3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của hai loài nghiên cứu 107 3.3.2.1. Hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các mẫu cắn chiết xuất từ hai loài nghiên cứu 107 3.3.2.2. Hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các chất phân lập được từ hai loài nghiên cứu 109 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 111 4.1. Về đặc điểm thực vật 111 4.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của hai loài nghiên cứu 111 4.1.2. Đặc điểm vi học của hai loài nghiên cứu 113 4.2. Về thành phần hóa học 115 4.3. Về nghiên cứu đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 121 4.3.1. Về triển khai phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro 121 vi 4.3.2. Về kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym acetylcholinesterase in vitro của các mẫu thử được chiết xuất và phân lập từ hai loài nghiên cứu 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127 KẾT LUẬN 127 KIẾN NGHỊ 128 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT A Độ hấp thụ (Absorbance) ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) ACh Acetylcholin AChE Enzym acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholin iodid br Rộng (broad) BuOH Buthanol 13 C-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) CC Sắc ký cột (Column chromatography) COSY Correlation spectroscopy d Tín hiệu đôi (doublet) dd Doublet of doublet dt Doublet of triplet DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer DMSO Dimethylsulfoxid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EI Ion hóa điện tử (Electro Ionization) ESI Ion hóa phun mù điện tử (Electro Spray Ionization) EtOAc Ethylacetat FAB Fast Atom Bombardment HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HR Phân giải cao (High Resolution) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence 1 H-NMR Cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) IC 50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) IU Đơn vị quốc tế (International Unit) viii I% Phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế J Hằng số tương tác LD 50 Liều gây chết 50% (Lethal Dose 50%) M Đa tín hiệu (multiple) MPLC Sắc ký lỏng áp suất trung bình (Medium Pressure Liquid Chromatography) MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) mult. Độ bội tín hiệu (multiplicity) m/z Khối lượng/điện tích ion NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) NST Nhiễm sắc thể Nxb. Nhà xuất bản ODS Octadecylsilyl P. Piper PAF Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu (Platelet-activating factor) PHM Cắn trong phân đoạn dung môi methanol chiết xuất từ loài Piper hymenophyllum Miq. PHH Cắn trong phân đoạn dung môi n-hexan chiết xuất từ loài Piper hymenophyllum Miq. PHC Cắn trong phân đoạn dung môi cloroform chiết xuất từ loài Piper hymenophyllum Miq. PHE Cắn trong phân đoạn dung môi ethylacetat chiết xuất từ loài Piper hymenophyllum Miq. PHB Cắn trong phân đoạn dung môi n-butanol chiết xuất từ loài Piper hymenophyllum Miq. PHN Cắn trong phân đoạn dung môi nước chiết xuất từ loài Piper hymenophyllum Miq. PHPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế (Preparative High Performance Liquid Chromatography) ix pp. Trang (page) PTM Cắn trong phân đoạn dung môi methanol chiết xuất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii PTH Cắn trong phân đoạn dung môi n-hexan chiết xuất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii PTC Cắn trong phân đoạn dung môi cloroform chiết xuất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii PTE Cắn trong phân đoạn dung môi ethylacetat chiết xuất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii PTB Cắn trong phân đoạn dung môi n-butanol chiết xuất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii PTN Cắn trong phân đoạn dung môi nước chiết xuất từ loài Piper thomsonii (C. DC.) Hook. f. var. thomsonii PTLC Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative Thin Layer Chromatography) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) s Tín hiệu đơn (single) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) STT Số thứ tự t Tín hiệu ba (triplet) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TLCT Trọng lượng cơ thể TLTK Tài liệu tham khảo Giá trị trung bình δ Độ dịch chuyển hóa học X [...]... acetylcholinesterase của hai loài Piper thomsonii (C DC.) Hook f var thomsonii và Piper hymenophyllum Miq., họ Hồ tiêu (Piperaceae) với 3 mục tiêu sau: 1 Mô tả đặc điểm hình thái, xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm vi học của 2 loài nghiên cứu 2 Xác định được thành phần hóa học của 2 loài nghiên cứu 3 Triển khai được phương pháp và áp dụng để đánh giá hoạt tính ức chế AChE in vitro của dịch chiết toàn phần, ... tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất PT1 72 Cấu trúc hóa học của hợp chất PT2 73 Các tương tác HMBC chính của hợp chất PT2 74 Cấu trúc hóa học của hợp chất PT3 75 Các tương tác HMBC chính của hợp chất PT3 76 Cấu trúc hóa học của hợp chất PT4 77 Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất PT4 78 Cấu trúc hóa học của hợp chất PT5 78 Các tương tác HMBC chính của hợp chất PT5 79 Cấu trúc hóa học của. .. phẫu thân của loài Piper hymenophyllum Miq 63 Ảnh vi phẫu lá của loài Piper hymenophyllum Miq 64 Đặc điểm bột phần trên mặt đất của loài Piper hymenophyllum Miq 65 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cắn n-hexan của loài Piper thomsonii 69 (C DC.) Hook f var thomsonii Sơ đồ phân lập hợp chất từ cắn ethylacetat của loài Piper 70 thomsonii (C DC.) Hook f var thomsonii Cấu trúc hóa học của hợp chất PT1 và gibbilimbol... Chi Piper L là chi lớn nhất trong họ Hồ tiêu và là một trong những chi có số lượng loài lớn nhất trong ngành thực vật hạt kín Vì thế, đã có khá nhiều những nghiên cứu về thành phần hóa học của chi này được thực hiện Theo một nghiên cứu năm 1996, trong khoảng thời gian gần một thế kỷ (từ năm 19071996), đã có 85 loài trên tổng số hơn 1.000 loài thuộc chi Piper L được nghiên cứu về thành phần hóa học và. .. và COSY chính của hợp chất PH2 90 Cấu trúc hóa học của hợp chất PH3 91 Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất PH3 92 Cấu trúc hóa học của hợp chất PH4 93 Cấu trúc hóa học của hợp chất PH5 94 xiv STT Hình 3.33 Hình 3.34 Hình 3.35 Hình 3.36 Hình 3.37 Hình 3.38 Tên hình Trang Cấu trúc hóa học của hợp chất PH6 96 Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất PH6 97 Cấu trúc hóa học của hợp chất PH7... nghiệm ex vivo và tác dụng cải thiện trí nhớ trên thử nghiệm in vivo [38], [143] Bên cạnh đó, tiềm năng nghiên cứu về chi Piper L là khá lớn bởi có hơn 1.000 loài thuộc chi này phân bố trên thế giới Chỉ riêng ở Việt Nam, số loài thuộc chi Piper L là 46 [5], [16] Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‘ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase. .. Galanthamin và Huperzin A đều có tác dụng ức chế R R AChE và có nguồn gốc thực vật [61], [88] Gần đây, kết quả nghiên cứu sàng lọc dược liệu cho thấy dịch chiết của một số loài thuộc chi Piper L như: P lolot C DC., P betle L., P nigrum L có tác dụng ức chế AChE in vitro [17], [63] Trong một vài nghiên cứu khác, hợp 1 chất piperin (alcaloid phổ biến nhất có mặt trong chi Piper L.) thể hiện tác dụng ức chế. .. tương tác HMBC chính của hợp chất PT6 81 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cắn cloroform của loài Piper 85 hymenophyllum Miq Sơ đồ phân lập hợp chất từ cắn ethylacetat của loài Piper 86 hymenophyllum Miq Cấu trúc hóa học của hợp chất PH1 và hợp chất tham khảo PH1a 87 Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất PH1 88 Cấu trúc hóa học của hợp chất PH2 và hợp chất tham khảo PH2a 89 Các tương tác HMBC và COSY... phân đoạn và hợp chất phân lập được từ 2 loài nghiên cứu 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chi Piper L 1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố và đặc điểm thực vật của chi Piper L 1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Piper L Theo hệ thống phân loại thực vật của 3 tác giả gồm: Hutchinson (1974) [6], Cronquist A (1988) [40] và Takhtajan (2009) [26], chi Hồ tiêu (Piper L.) được xếp nằm trong họ Hồ tiêu (Piperaceae), ... (2009), họ Piperaceae gồm có 7 chi [26] Theo hai tác giả Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Kim Đào, họ Hồ tiêu phân bố ở Việt Nam có 5 chi gồm: Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper, Lepianthes, trong đó, chi Piper L có 46 loài [5], [16] 1.1.1.2 Đặc điểm phân bố chi Piper L trên thế giới và ở Việt Nam * Trên thế giới Chi Piper L là một thành viên của gia đình họ Hồ tiêu (Piperaceae) Với số lượng trên 1.000 loài, . trên, chúng tôi tiến hành đề tài: ‘ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase của hai loài Piper thomsonii (C. DC. ) Hook. f. var. thomsonii. 4.1. Về đặc điểm thực vật 111 4.1.1. Đặc điểm hình thái và xác định tên khoa học của hai loài nghiên cứu 111 4.1.2. Đặc điểm vi học của hai loài nghiên cứu 113 4.2. Về thành phần hóa học 115. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE CỦA HAI LOÀI Piper