Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây Bục núi cao Mallotus japonicus Muell.Arg

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC T

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

PHAN THỊ THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY BỤC NÚI

CAO MALLOTUS JAPONICUS MUELL.-ARG

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN HOÀI NAM

Hà Nội - 2012

Trang 2

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY BỤC NÚI

CAO MALLOTUS JAPONICUS MUELL.-ARG

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

: TS Nguyễn Hoài Nam

Hà Nội - 2012

Trang 3

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Thảo và các anh chị Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thử nghiệm dược lý

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và phấn đấu để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của tập thể các cán bộ Viện Hóa Sinh biển đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án này Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ phòng Dược liệu biển, Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận

án

Luận án này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ đề tài Hợp tác Quốc tế theo Nghị định thư Việt Nam Bỉ giai đoạn 2007-2009, do GS.TS Châu Văn Minh làm chủ nhiệm

Tác giả luận án

Trang 4

Danh sách các chữ viết tắt

CC : Sắc ký cột (Collumn chromatography)

DPPH : 1,1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl

EGCG : Epigallocatechin gallate

GSHPO : Glutathione peroxidase

HHDP : Hexahydroxydiphenic acid

HTCO : Hoạt tính chống oxy hóa

MDA : Malonyl dialdehyd

Mp : Điểm nóng chảy (Melting point)

NMR : Phổ cộng hưởng từ nhân (Nuclear Magnetic Resonance) SOD : Superoxide dismutase

TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatomatography)

Vit : Vitamin

Trang 5

Mục lục

Danh sách các chữ viết tắt i

Mục lục ii

Danh mục các bảng iv

Danh mục các hình v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

I.1 KHÁI QUÁT VỀ CHI BA BÉT (MALLOTUS) 3

I.2 KHÁI QUÁT VỀ CÂY BỤC NÚI CAO (MALLOTUS JAPONICUS MUELL.-ARG.) 4

I.2.1 Thực vật học 4

I.2.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bục núi cao (Mallotus japonicus Muell -Arg.) 5

I.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa của cây Mallotus japonicus Muell.-Arg 12

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

II.1 MẪU THỰC VẬT 18

II.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 18

II.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 18

II.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 18

II.2.3 Sắc ký cột (CC) 19

II.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT 19

II.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) 19

II.3.2 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) 19

II.4 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 20

II.4.1 Phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 20

II.4.2 Phương pháp kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế bào gan phân lập trực tiếp 22

II.4.3 Phương pháp thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) 23

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25

III.1 THU MẪU THỰC VẬT VÀ XỬ LÝ MẪU 25

Trang 6

III.2 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 25

III.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT 27

III.3.1 Hợp chất 1: 5,7-dihydroxy-4'-methoxy-6-(3-methylbut-2-enyl)flavanone 27

III.3.2 Hợp chất 2: bergenin 30

III.3.3 Hợp chất 3: 29-norlupane-3,20-dione 31

III.3.4 Hợp chất 4: lupeol 34

III.3.5 Hợp chất 5: 25,26,27-trisnor-24-hydroxycycloartan-3-one 35

III.3.6 Hợp chất 6: 25,26,27-trisnor-3-ketocycloartan-24-oic acid 38

III.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY BỤC NÚI CAO 42

III.4.1 Kết quả thí nghiệm DPPH 42

III.4.2 Kết quả thí nghiệm bảo vệ tế bào gan khỏi tác nhân oxi hóa 42

III.4.3 Kết quả thí nghiệm MDA 43

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 45

Tài liệu tham khảo 46

Phụ lục 51

Trang 7

Danh mục các bảng

Bảng 1 Tổng hợp hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất phloroglucinol trên các dòng

tế bào ung thƣ nuôi cấy khác nhau (IC 50  g/ml) 8

Bảng 2 Kết quả thử hoạt tính chống ôxy hóa của các hợp chất 16

Bảng 3 Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 29

Bảng 4 Số liệu phổ NMR của 2 31

Bảng 7 Số liệu phổ NMR của 5 37

Bảng 8 Số liệu phổ NMR của 6 và các chất tham khảo 39

Bảng 9 Kết quả thử nghiệm DPPH 42

Bảng 10 Kết quả thí nghiệm bảo vệ tế bào gan khỏi tác nhân oxi hóa 43

Bảng 11 Kết quả thí nghiệm MDA 44

Trang 8

Danh mục các hình

Hình 1 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 28

Hình 2 Các tương tác HMBC (H  C) chính của hợp chất 1 29

Hình 3 Cấu trúc hóa học của 2 30

Hình 4 Cấu trúc hóa học của hợp chất 3, 3a và 3b 32

Hình 5 Các tương tác HMBC chính của hợp chất 3 32

Hình 6 Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 34

Hình 8 Các tương tác HMBC chính (H  C) của 5 38

Hình 10 Các tương tác COSY và HMBC chính của 6 39

Trang 9

MỞ ĐẦU

Thực vật là một nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá của mỗi quốc gia Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nên

có một hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo ước tính, Việt nam

có khoảng 13000 loài thực vật bậc cao có mạch trong đó có hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc [1]

Cùng với sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc

đã được khoa học y – dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng Nhiều loại thuốc được chiết xuất từ dược liệu Việt Nam như rutin, D.strophantin, berberin, palmatin, artermisinin, …[1] Do đó, nguồn tài nguyên thực vật chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cùng với điều kiện

tự nhiên thuận lợi đã, đang và sẽ là lĩnh vực khoa học, kinh tế, xã hội đầy tiềm năng trên đất nước ta

Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí và hiệu quả có tầm quan trọng đặc biệt Trong khuôn khổ đề tài hợp tác theo nghị định thư giữa chính phủ Việt

Nam và Bỉ, cây Bục núi cao (Mallotus japonicus Muell.-Arg.) đã được lựa

chọn nghiên cứu

Trong y học dân tộc Trung Quốc, Bục núi cao được dùng làm thuốc chữa viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa bộ máy tiêu hóa Vỏ thân cây

Trang 10

này được dùng chữa nôn mửa, ngoài ra còn có tác dụng sát trùng, nấu cao dán lên mụn nhọt có tác dụng đỡ mưng mủ và lên da non [2]

Trên cơ sở đó, chúng tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thành

phần hóa học và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cây Bục núi cao

Mallotus japonicus Muell.-Arg.”

Luận văn này tập trung nghiên cứu về thành phần hóc học của cây

Bục núi cao (Mallotus japonicus Muell.-Arg.) và hoạt tính chống oxy hóa

của chúng nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền

NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN GỒM

1 Phân lập một số hợp chất hóa học từ cây Bục núi cao (Mallotus

japonicus Muell.-Arg.)

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được

3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của một số hợp chất đã phân lập được

Trang 11

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

I.1 KHÁI QUÁT VỀ CHI BA BÉT (MALLOTUS)

Chi ba bét (Mallotus) là một chi khá lớn thuộc họ thầu dầu

(Euphorbiaceae), gồm khoảng 150 loài, phân bố tại các khu vực từ Ấn Độ, Sri Lanka đến Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam và khắp vùng Malesia

Về phía Nam, chúng phân bố tới miền Đông Fuji, miền Bắc và Đông Australia Lên phía Bắc, có thể gặp khá nhiều loài phân bố tại Trung Quốc,

Triều Tiên và Nhật Bản Rất nhiều loài Mallotus đã được sử dụng làm thuốc

để chữa nhiều bệnh khác nhau như: Bục núi cao M japonicus được sử dụng

trong y học dân tộc Trung Quốc để chữa bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng và

điều hòa các chức phận của bộ máy tiêu hóa Ở nước ta loài Bai bái M

contubernalis làm thuốc chữa các bệnh thấp khớp, u phong, mụn nhọt, ngứa;

loài Bục trườn M repandus được sử dụng ở Thái Lan để chữa bệnh viêm dạ

dày, viêm đau gan, viêm đau khớp và chữa rắn độc cắn [2,3]

Số loài trong chi ba bét (Mallotus) ở nước ta khá phong phú và đa

dạng Đây là nguồn tài nguyên thực vật đầy tiềm năng và có nhiều triển vọng trong y dược Một số loài đặc hữu của Việt Nam như: Ba bét gia lai

(Mallotus canii Thin), Ba bét hòa bình (Mallotus chuyenii Thin), Đỏ đọt (Mallotus eberhardtii Gagnep), Ba bét hòn hèo (Mallotus hanheoensis Thin), Si ta (Mallotus poilanei Gagnep), Ba bét sa thày (Mallotus

sathayensis), Ba bét nhẵn (Mallotus cuneatus Ridl.var.glabratus Thin)[1]

Một số loài có vùng phân bố tương đối rộng như: Ruối khế (Mallotus

anisopodus Airy.-Shaw.), Ba bét trắng (Mallotus apelta Muell.-Arg.), Bùng

bục (Mallotus barbatus Muell.-Arg.), Ba bét nhiều hoa (Mallotus

Trang 12

floribundus Muell.-Arg.), Bục núi cao (Mallotus japonicus Muell.-Arg.),

Cánh kiến (Mallotus philippinensis Muell.-Arg.),… [1]

I.2 KHÁI QUÁT VỀ CÂY BỤC NÚI CAO (MALLOTUS JAPONICUS

MUELL.-ARG.)

I.2.1 Thực vật học

Cây Bục núi cao có tên khoa học là Mallotus japonicus Muell.-Arg.,

thuộc họ Thầu dầu – Euphorbiaceae

Mô tả: Cây thân gỗ hoặc thân bụi nhỏ, cao từ 3 – 10m Lá hình khiên

hay gần tròn, màu xanh đậm Lá nguyên, hai tuyến gốc có kích thước 0,3; 0,8 mm, mặt dưới lông hình sao màu vàng nâu Lá đài 5, cụm quả dày đặc không phân nhánh Gai dài 3mm, trên có lông hình sao Bục núi cao là loài

có nhiều tiềm năng trong công nghiệp dược, song hầu như chưa được quan tâm điều tra và nghiên cứu [2,4]

Phân bố: Cây phân bố chủ yếu ở các khu vực núi cao có điều kiện khí

hậu mát và ẩm Ở nước ta mới gặp loài này ở Sa Pa (Lào Cai)

Trang 13

Công dụng: Trong y học dân tộc Trung Quốc, Bục núi cao đƣợc dùng

làm thuốc chữa viêm loét dạ dày, tá tràng và điều hòa bộ máy tiêu hóa Vỏ thân cây này đƣợc dùng chữa nôn mửa, ngoài ra còn có tác dụng sát trùng, nấu cao dán lên mụn nhọt có tác dụng đỡ mƣng mủ và lên da non [2]

Các thử nghiệm in vitro gần đây cho biết, một số hợp chất phân lập từ

bục núi cao có tác dụng kháng virus HIV-1, ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ và kháng khuẩn [2]

I.2.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Bục núi cao

(Mallotus japonicus Muell -Arg.)

Thành phần hóa học của loài M japonicus đƣợc các nhà khoa học Nhật

Bản quan tâm và nghiên cứu từ rất sớm, năm 1939 hợp chất bergenin (1) đã

đƣợc phát hiện từ vỏ cây và đến năm 1949 hợp chất rutin đƣợc phát hiện từ

lá của loài này [5]

O O

1

R1

H HO

OH

O O

Năm 1975, từ hạt của loài M japonicus, nhóm nghiên cứu của tác giả

Okabe đã phân lập đƣợc 8 hợp chất glycoside tim (cardiac glycoside) trong

Trang 14

đó có 3-O-α-L-rhamnopyranoside và 3-O--D-glucopyranosyl-(1

4)-α-L-rhamnopyranosides của corotoxigenin (2), mallogenin (3), coroglaucigenin (4) và panogenin (5) Cấu trúc hóa học của chúng được xác định bằng các dữ

kiện hằng số vật lý, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H-NMR và 13C NMR) kết hợp với các phương pháp hóa học (thủy phân và chuyển hóa) [5]

COCH3OH HO

H3C OCH3

HO

COCH3OH

CH3OCH3

COCH3OH HO

H3C OCH3

HO COCH3

OH O

Ac OH HO

H3C

OCH3

HO

Ac OH

R OH

Ac OH HO

H3C

OCH3

HO

CO-R OH

Các dẫn xuất phloroglucinol từ loài M japonicus được các nhà khoa

học quan tâm và nghiên cứu kỹ nhất Năm 1983, nhóm nghiên cứu của tác giả Shigematsu công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 02 dẫn xuất phloroglucinol mới là 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-

methyl-6-methoxybenzyl)-phloracetophenone (6) và

3-(3,3-dimethyl-2-

hydroxybut-3-enyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-phloroacetophenone (7) từ quả đã bỏ hạt của loài M japonicus [6] Đến năm

1985, nhóm nghiên cứu này công bố thêm 2 dẫn xuất phloroglucinol mới nữa là 3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-

methoxybenzyl)-phlorobutyrophenone (8) và

3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-6-methoxybenzyl)-phloroisobutyrophenone

Trang 15

là mallotophenone (10) và mallotochromene (11), cùng với hai hợp chất đã

được biết đến là 6-methoxybenzyl)-phlora-cetophenone và 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-

3-(3,3-dimethylallyl)-5-(3-acetyl-2,4-dihydroxy-5-methyl-methoxyacetophenone được phân lập từ vỏ quả loài M japonicus Các hợp

chất 10, 11 và 2,6-dihydroxy-3-methyl-4-methoxyacetophenone thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào cao trên các dòng tế bào ung thư KB và L-5178Y với giá trị IC50 tương ứng là 0,58/0,74, 2,40/6,10 và 2,10/1,25 μg/ml [7]

Ac OH HO

H3C

OCH3

HO

CO-R OH

OH

Ac OH HO

H3C OCH3

HO CO-R

Năm 1986, nhóm nghiên cứu của tác giả Arisawa tiếp tục công bố sự

phân lập và xác định cấu trúc của mallotolerin (12) và mallotochromanol

(13) từ vỏ quả loài Mallotus japonicus Muell.-Arg Hợp chất 12 thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào cao trên các dòng tế bào KB và L-5178Y với giá trị

IC50 tương ứng là 0,95 và 0,82 μg/ml [8] Các nghiên cứu tiếp theo của

nhóm tác giả này về thành phần hóa học của vỏ quả loài M japonicus đã

phân lập thêm được bốn dẫn xuất phloroglucinol mới là butyrylmallotochromene (14) and isobutyrylmallotochromene (15), isomallotolerin (16) and isomallotochromanol (17) Các hợp chất 14, 15, 16

thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao trên dòng tế bào KB với ED50 tương ứng là 2,55, 0,4 và 0,84 μg/ml [9,10]

Trang 16

Ac OH HO

H3C OCH3

HO

Ac OH

O

R

COCH3OH HO

H3C OCH3

HO

COCH3OH

OH

17 R = OH

Bảng 1 Tổng hợp hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất phloroglucinol

Mallophenone >20 >20 >20 >20 >20 >20 2,6-Dihydroxy-3-methyl-

4-methoxyacetophenone >20 >20 >20 >20 >20 >20

Mallotophenone (10) 2,40±0,17 6,30±0,60 3,75±0.24 4,80±0,23 3,65±0,49 10,08±0,58

Mallotojaponin (18) 0,58±0.03 0,60±0,04 0,54±0,04 0,70±0,06 0,81±0,08 1,14±0,05 Butyrylmallotojaponin 0,72±0,07 0,41±0,03 0,91±0,02 0,60±0,03 1,08±0,10 2,85±0,03 Isobutyrylmallotojaponin 0.98±0,10 1,10±0,12 3,05±0,43 1,75±0,92 2,50±0,40 3,00±0,45

Mallotochromene (11) 2,10±0,18 0,72±0,14 0,82±0,02 1,08±0,19 1,26±0,31 1,71±0,31 Butyrylmallotochromene

Mallotochromanol (13) >20 >20 >20 >20 >20 >20 Butyrylmallotochromanol

Trang 17

chất này có tác dụng kéo dài thời gian sống cao nhất ở liều 20 mg/kg Khi tăng lên liều 40 mg/kg thì lại gây độc đối với cơ thể chuột [11]

Các hợp chất tanin từ loài M japonicus cũng được các nhà khoa học quan

tâm nghiên cứu khá sớm Năm 1989, nhóm nghiên cứu của tác giả Saijo công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất tanin mới là 1,2-di-

1-O-digalloyl-3,6-(R)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucose (20), mallojaponin

(21), mallonin (22) và mallotusinin (23), cùng với 15 hợp chất đã được biết

đến là 2,3-(S)-HHDP-D-glucose (24)(HHDP - hexahydroxydiphenic acid),

pterocaryanin B (25), 6-O-galloyl-2,3,bis-(S)-HHDP-glucose (26),

4,6-di-O-galloyl-2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose (27), 1(

),6-di-O-galloyl-2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose (28), pterocaryanin C (29), 2,3,4,6-bis-(S)-HHDP-glucose, corilagin (30), punicafolin (31), geraniin

1(β)-O-galloyl-(32), elaeocarpusin (33), furosin (34), mallotinic acid (35), mallotusinic acid

(36), và terchebin (37) từ vỏ thân loài M japonicus Cấu trúc hóa học của

chúng được xác định bằng phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, kết

hợp với các phương pháp hóa học Trong đó, hợp chất 35 là một ellagitanin

rất hiếm với nhóm cấu trúc độc đáo dibenzofuran-dicarboxyl [12]

1,1'-(3,3',4,4'-tetrahydroxy)-O

OH

OH HO OH HO

O O OOC

OH OH

OR2

CO

OH

OH O O

CO O

O

HO OH

OH OH O

H H

O

OH

OH HO OH HO HO

OC

CO

O

CH2O

O O

OOC

OH OH

OR2

HO

HO OH

OH O

OC CO

H

Trang 18

OH

OH HO OH

OR1

OOC

OH OH

OR2HO

O OH

CH2HO

O O

OOC

OH OH

OR2

CO

OH OH O

O

CO O

O

O HO

OH

OH OH O

H H

19 R1 = Galloyl, R2 = H

H

O O

OR 1

R3O

O O

HO

O O

R2O

O

OH OH OH

O CO R2

Trang 19

DHHDP:

O OH OH

CO CO

O

HO

H

OH OH

OR2OC

CO OH OH O O

CO O

O

OH OH O

H H

H

HO

O HO

OH OH

CO CO

O HO

H

(R)HHDP:

O HOOC

OH

OH HO OH HO HO

OH

(R)Val:

Năm 1991, bốn dẫn xuất phloroglucinol, mallotophenone,

mallotochromene , mallotojaponin (18) và mallotolerin, phân lập từ vỏ quả

loài M japonicus được tiến hành đánh giá hoạt tính ức chế enzym phiên mã

ngược của HIV Kết quả cho thấy, trong 4 hợp chất nghiên cứu, mallotojaponin và mallotochromene thể hiện hoạt tính rất cao Sự khác nhau về khả năng ức chế khác nhau của các chất này là do sự mất đi và bản chất tự nhiên của mạch bên Kiểu ức chế hoạt động của enzym bởi mallotojaponin là cạnh tranh so với khuôn mồi (rA)n(dT)12-18 và không cạnh tranh so với cơ chất triphosphat, dTTP [13]

Năm 2000, các nhà khoa học Hàn Quốc đã tiến hành nghiên cứu khả

năng giải độc gan của bergenin phân lập từ loài M japonicus bằng phương

pháp thử nghiệm trên tế bào gan chuột nuôi cấy đã được gây độc bằng CCl4 Kết quả cho thấy, bergenin làm giảm mạnh hoạt lực của các enzym glutamic, piruvic transaminase và sorbitol dehydrogenasse được giải phóng

từ các tế bào gan đã gây độc bằng CCl4 Tác dụng giải độc gan của bergenin cũng được chứng minh bằng cách đánh giá hoạt lực của các enzym glutathione S-transferase và glutathione reductase và hàm lượng của glutathione trong tế bào gan đã gây độc bằng CCl4 [14] Ngoài ra, tác dụng

Trang 20

của hợp chất này lên các tế bào chuột đã được gây độc bằng galactosamine cũng đã được nghiên cứu Ở nồng độ 100 M, bergenin làm giảm sự tiết của các enzym glutamic piruvic transaminase và sorbitol dehydrogenase ra môi trường trong 14 h với 1,5 mM galactosamine tương ứng là 50,9 và 45% Đồng thời, sự suy giảm tổng hợp ARN kích thích bởi galactosamine (1,5 mM) được phục hồi bởi bergenin (100 M) cao hơn 2,5 lần so với đối chứng [14]

D-I.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa của cây Mallotus japonicus Muell.-Arg

Thời gian gần đây, nhiều cuộc nghiên cứu thường đề cập đến chất antioxydant (chất chống oxy hóa) Chất chống oxy hóa hiện đã được chứng minh mang lại rất nhiều lợi ích cho sức khỏe, từ ngăn ngừa ung thư và bệnh tim, đến việc giúp giảm tình trạng thoái hóa hoàng điểm mắt và bệnh Alzeimer

Các chuyên gia cho biết, điều khiến chúng mang lại nhiều lợi ích cho

cơ thể chính là do chất chống oxy hóa có khả năng vô hiệu hóa một nhóm thành phần có tính chất phản ứng và phá hủy cao, được gọi là các gốc tự do gây hại

Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong

cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào Trước đó, người ta cho là gốc này chỉ có ở ngoài cơ thể [15]

Trong cơ thể có rất nhiều loại gốc tự do, mà các gốc nguy hiểm hơn cả

là superoxide, ozone, hydrogene peroxide, lipid peroxy, nhất là hydroxyl, một gốc hoạt động và gây ra nhiều tổn thương

Trang 21

Do việc sinh ra các gốc tự do trong tế bào là không thể tránh khỏi, nên việc chống lại những tác hại của gốc tự do là tất yếu Trong điều kiện sinh

lý, cơ thể người có một hệ thống các chất có khả năng phản ứng để loại bỏ, phân hủy các dạng oxy hoạt động (các gốc tự do) Hệ thống các chất này được gọi chung là các chất chống oxy hóa Chất này có khả năng làm mất hoạt tính của gốc tự do tích tụ trong cơ thể, biến chúng thành những phân tử

vô hại, đồng thời cũng có khả năng duy trì cấu trúc và chức năng của tế bào

Đó là các enzyme ức chế sinh ra gốc, như :

Các chất chống oxy hóa chủ yếu trong tế bào của cơ thể người gồm những enzym như superoxide dismutase (SOD), catalase và glutathione peroxidase (GSHPO) [16]

Enzym SOD có mặt trong tất cả các tế bào có chuyển hoá oxy Chức năng

của enzym này là xúc tác quá trình phân huỷ superoxide [17]

2 2

O        

Catalase là một chất chống oxy hoá vì nó xúc tác phản ứng phân huỷ

H2O2 Tuy nhiên catalase không phân huỷ được các peroxit hữu cơ và cả

H2O2 khi ở nồng độ thấp [18,19]

2H2O2 2H2O + O2 GSHPO là enzym xúc tác cho phản ứng loại bỏ các H2O2 hữu cơ và

vô cơ H2O2 khi mới tạo ra với nồng độ thấp, xảy ra phản ứng của glutathione (GSH) với H2O2 nhờ enzym GSHPO xúc tác:

2GSH + LOOH GSSG + LOH + HGSHPO 2O

Trang 22

Enzym GSHPO có mặt ở ty thể, lạp thể và bào tương, nó chứa selen trong trung tâm hoạt động Vì vậy hàm lượng selen trong cơ thể liên quan chặt chẽ với hoạt độ của enzym này Enzym này không chỉ phân hủy H2O2

mà cả các peroxit hữu cơ khác Như vậy khả năng loại bỏ các peroxide phụ thuộc vào hoạt độ của enzym GSHPO và nồng độ của glutathione [20,21]

Hệ thống các chất chống oxy hoá có bản chất không phải enzym, còn gọi là các “ bẫy ” gốc tự do :

Có rất nhiều chất hoá học có khả năng chống oxy hoá thể hiện qua phản ứng thu dọn các gốc peroxide, oxy đơn bội, các gốc tự do khác, hoặc gián tiếp ngăn chặn quá trình oxy hoá sinh học Chúng có thể có sẵn trong

cơ thể hoặc được bổ sung từ bên ngoài Những nhóm chính là nhóm các chất polyphenol, các thiol, nhóm các phối tử của Fe (hay Cu), muối Se và phức của Se4+, nhóm các chất chứa nhiều nối đôi liên hợp [22,23]

- Nhóm các polyphenol: Thuộc nhóm này có vitamin E, vitamin C và các

flavonoid…

- Vitamin (Vit) E: là chất chống oxy hoá hoà tan trong lipit và phân

bố khắp nơi trong tế bào, nó được coi như là chất bảo vệ của các màng sinh học do khả năng ngăn cản quá trình peroxy hoá các axít béo chưa bão hoà của màng Vì tính chất ưa lipit nên vitamin E có thể liên kết mật thiết với phần hydrocarbon của các axit béo chưa bão hoà nối đôi, do đó có thể tiếp cận gần vị trí của quá trình peroxy hoá và dập tắt chuỗi phản ứng

Một điều đáng chú ý là vitamin E chỉ phát huy tác dụng khi cơ thể đủ selen Selen có tác dụng hoạt hoá vitamin E Hoạt tính chống oxy hoá của vitamin E có liên quan mật thiết với những chất chống oxy hoá hoà tan trong lipit ở huyết tương và hồng cầu người trưởng thành [24]

Trang 23

- Vitamin C: Một trong những tác nhân chống oxy hoá của vitamin C

là đưa vitamin E từ dạng oxy hoá về dạng khử:

Vit E (ox) + Vit C (kh)  Vit E (kh) + Vit C (ox) Hằng số tốc độ phản ứng khá lớn K = 1,55.106

M-1 giây -1 Cơ chế này giải thích cho sự ít thiếu hụt vitamin E ở người

Vitamin C còn có những tính chất chống oxy hoá khác ở môi trường nước như loại hydro peroxide Nhưng tính chất này chỉ thể hiện nếu không

có mặt của ion sắt Nếu có mặt ion sắt (như uống thuốc sắt quá liều, vỡ hồng cầu gây tổn thương cơ) thì vitamin C sẽ có tính oxy hoá mạnh Do đó trong thực nghiệm người ta dùng hỗn hợp ion sắt và vitamin C làm nguồn sinh gốc

tự do [25-27]

- Các flavonoid: flavonoid là một chất rất phổ biến trong thực vật, có

bản chất là polyphenol Khi đưa flavonoid vào cơ thể, chúng sẽ triệt tiêu các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý của cơ thể và tạo nên những gốc tự do mới bền vững hơn, không tham gia vào phản ứng dây truyền gốc và được coi là những "cái bẫy" để loại trừ các gốc tự do độc hại [28]

Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ cây bục núi cao, năm 2008 nhóm nghiên cứu của tác giả Tabata đã phân lập,

xác định cấu trúc và thử hoạt tính chống ôxy hóa của corilagin (38), geraniin (39), axit mallotinic (40), axit mallotusinic (41), rutin (42), và ellagic acid

(43) từ dịch chiết nước nóng của lá cây Mallotus japonicus Muell.-Arg [29]

Trang 24

a Kết quả biểu thị ở nồng độ 1 mM mẫu thử tương đương với số mM của trolox

b Kết quả biểu thị số đơn vị enzym superoxide dismutase (SOD) tương đương với

1 ml mẫu thử ở nồng độ 1 mM (U/ml)

Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống ôxy hóa cho thấy, các hợp chất 38,

39, 40, và đặc biệt là hợp chất 41 thể hiện hoạt tính khử gốc tự do DDPH rất

mạnh Một điều đáng lưu ý là tất cả bốn hợp chất tanin đều có hoạt tính tương đương hay thậm chí cao hơn so với epigallocatechin gallate (EGCG), một hợp chất đã được biết đến với hoạt tính chống ôxy hóa rất cao Hoạt tính của các hợp chất này có thể liên quan đến mật độ thế cao của các nhóm

Trang 25

hydroxyl Gốc tự do O2 được tạo ra ở giai đoạn đầu của phản ứng ôxy hóa trong cơ thể và sẽ sản sinh ra các gốc tự do gây hủy hoại tế bào Kết quả đánh giá hoạt tính thu dọn gốc tự do O2

của các hợp chất cho thấy, các tanin

phân lập từ lá cây M japonicus thể hiện hoạt tính mạnh hơn tất cả các chất

khác ngoại trừ EGCG Hoạt tính thu dọn gốc tự do DDPH và gốc O2



của

hợp chất 36 tương ứng mạnh gấp 3,4 và 16,6 lần so với quercetin, một hợp

chất được biết đến nhiều bởi có hoạt tính chống ôxy hóa rất mạnh và đã được dùng làm chất chuẩn dương trong một số phương pháp thử nghiệm

đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa in vitro Như vậy, tương tự như chè xanh

có chứa EGCG, lá loài M japonicus chứa các hợp chất chống ôxy hóa rất

mạnh và có thể là nguồn nguyên liệu tự nhiên tuyệt vời để sản xuất các chế phẩm có tác dụng chống ôxy hóa [29]

Trang 26

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

II.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây Bục núi cao được thu hái vào tháng 05 năm 2010 tại Sa Pa, Lào Cai Mẫu cây được GS.TSKH Nguyễn Nghĩa Thìn, Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội giám định

Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại bộ môn thực vật, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Viện Hoá Hóa sinh biển, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

II.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

II.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện

từ từ đến khi hiện màu

II.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp

Trang 27

II.2.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường

và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.)

II.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT

II.3.1 Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Thermo Scientific Mel – Temp 3.0 của Viện Hóa Sinh biển

II.3.2 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1

H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT135, DEPT90, HSQC và HMBC được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Phổ 13

C-NMR:

Trang 28

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trườ ng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo cho phổ 13

C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 ppm đến 240 ppm)

 Phổ DEPT (Distortionless Ebhancement by Polarisation Transfer): Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc bốn biến mất Tín hiệu phổ của

CH và CH3 nằm về một phía và của CH 2 về một phía trên phổ DEPT 1350 Còn trên phổ DEPT 900

thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

 Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều , cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều

 Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity):

Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

II.4 PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

II.4.1 Phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)

Nguyên lý:

DPPH có khả năng tạo ra các gốc tự do trong dung dịch ethanol bão hoà Khi cho các mẫu thử nghiệm vào hốn hợp này, nếu mẫu thử có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do thì nó sẽ làm giảm độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do đó Hoạt tính chống oxi hoá của các mẫu thử được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dung dịch thí nghiệm

Trang 29

sau phản ứng so với đối chứng không chứa chất thử khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng  = 515 nm

Phương pháp:

 Mẫu được pha loãng trong DMSO và nước cất vô trùng thành một dãy 05 nồng độ 128g/ml, 64g/ml, 32g/ml, 16g/ml,

8g/ml

 Cho mẫu vào đĩa 96 giếng

 Thêm dung dịch DPPH 1 mM trong methanol

 Ủ đĩa ở 37o

C trong 30 phút

 Xác định độ hấp thụ của dung dịc h sau phản ứng tại bước sóng

 = 515 nm trên máy Elisa

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Công thức tính toán:

Khả năng trung hòa các gốc tự do của mẫu thử được tính theo công thức sau:

SC% = (Ađối chứng – Amẫu thử)/Ađối chứng (%)

Trong đó: Ađối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử

Amẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử

Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa độ hấp thụ quang học tại bước sóng 515 nm và nồng độ DPPH trong dung dịch

Trang 30

II.4.2 Phương pháp kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế bào gan phân lập trực tiếp

a Phương pháp phân lập và nhân nuôi trực tiếp tế bào gan chuột

Chuột BALB/c khoẻ mạnh được sử dụng để tách tế bào tế bào gan Gây chết chuột bằng cồn 800, sau đó sử dụng panh, kéo mổ chuột, tách lấy gan Gan chuột sau khi tách được rửa bằng PBS có 10% kháng sinh sau đó dùng panh, kéo, kim tiêm gạt, tách tế bào gan trong PBS Thu dịch có tế bào gan, li tâm, loại bỏ dịch nổi Tế bào được hoà trong NH4Cl để phá vỡ hồng cầu Sau khi li tâm, tế bào thu được hoà lại vào môi trường MEME có 10% FBS và các thành phần cần thiết khác

b Phép thử sinh học kiểm tra khả năng chống oxy hoá của hoạt chất trên tế bào gan

Tế bào gan từ gan chuột sẽ được phân lập bằng trypsin 1% cho từng thí nghiệm Sau khi được phân lập, tế bào gan sẽ được đưa vào đĩa thí nghiệm 96 giếng với mật độ 1 x 104

tế bào/giếng để nuôi qua đêm trong tủ

ấm 5% CO2, ở 37oC Tế bào sau đó sẽ được ủ hoạt chất ở các nồng độ khác nhau trong 2h Tiếp theo, 100 M H2O2 sẽ được đưa vào mỗi giếng và ủ trong 2h Để xác định số tế bào gan sống sót sau tác động của H2O2 cũng như tác động bảo vệ của hoạt chất nghiên cứu, MTT nồng độ 1mg/ml (50

l/giếng) sẽ được đưa vào các giếng và ủ tiếp trong 4h ở 37oC Loại bỏ toàn

bộ dịch nổi và đưa vào mỗi giếng 100 l/giếng DMSO 100% và đo mật độ quang học của chất formazan tạo thành băng máy Microplate Reader ở bước sóng 492 nm Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần Các số liệu được xử lí bằng phần mềm TableCurve 2D phiên bản 4.0 và EXEL để tính giá trị trung bình ± sai số Độ chính xác của số liệu được tính bằng R2 Nếu R2 ≥ 0.95 thì

Trang 31

kết quả được xem là đáng tin cậy với sai số thống kê P ≤ 0.05 Trolox được

sử dụng là chất đối chứng

[OD(chất thử) - OD(H2O2)] x 100

% sống sót =

OD(Tế bào) - OD(H2O2)

Giá trị ED50 (nồng độ bảo vệ được 50% đối với sự sống sót của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve Chất thử nào có ED50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc ED50  4 g/ml (với chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính chống oxi hóa và bảo vệ tế bào gan

II.4.3 Phương pháp thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test)

a Nguyên tắc

Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với thiobarbituric acid, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử thiobarbituric acid tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng

532 nm Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0

C trong vòng 10 - 15 phút Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu Phương trình phản ứng như sau:

b Cách tiến hành

Pha thuốc thử TBA 0,8% Mỗi mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000μg/ml, 1500μg/ml, 1000μg/ml,

Trang 32

500μg/ml, 100μg/ml, 50μg/ml và10μg/ml (các mẫu pha trong dung dịch DMSO)

Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat (5 mM) theo tỉ lệ 1 : 10 (não : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C Lấy 0,5 ml dịch đồng thể, thêm vào 0,1 ml các nồng độ mẫu thử và 1,4 ml đệm phosphat, ủ ở 37 0

C trong 15 phút Kết thúc phản ứng bằng 1 ml trichloroacetic acid 10%, ly tâm 104 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml thiobarbituric acid 0,8% ở 1000C trong 15 phút và đo màu ở λ

= 532 nm Trolox được sử dụng làm chất đối chứng

Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) (%) được tính theo công thức:

HTCO (%) = [(ODchứng - ODthử) / ODchứng] × 100

Trong đó: ODchứng: mật độ quang của dung môi DMSO

ODthử: mật độ quang của mẫu thử

c Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test, F’test và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) và sử dụng hệ số LSD (least-significant difference) để kiểm tra sự sai khác có ý nghĩa so với đối chứng Nếu p < 0.05 được coi là sai

khác có ý nghĩa, nếu p > 0.05 sự sai khác là không có ý nghĩa thống kê

Trang 33

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

III.1 THU MẪU THỰC VẬT VÀ XỬ LÝ MẪU

Mẫu lá của cây Bục núi cao được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 500C, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 3,5 kg bột khô

III.2 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết phân đoạn dịch chiết methanol của cây Bục núi cao

MJC: Cặn CHCl 3 (22.5 g)

Bổ sung EtOAc

Trang 34

Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Bục núi cao

MJC5 (2.5g)

MJC (22.5 g)

Silica gel CC Hexan/Axeton 50/1-1/1

YMC axeton/H2O: 2.5/1

MJC2A

(700mg)

MJC1 (8g) MJC2 (5.2g) MJC3 (1.6g) MJC4 (2g)

Silica gel CC CHCl3/Hexan/MeOH: 1/3/0.1

2 (17mg)

MJC2B (1.2g)

MJC2C (798mg)

Silica gel CC Hexan/Axeton: 7/1

4 (Kết tinh, 250mg)

MJC2B2 (186mg)

YMC Axeton/H2O: 2/1

5

(7mg)

Silica gel CC Hexan/axeton:4.5/1

6

(11mg)

Silica gel CC CHCl3/Axeton: 25/1

1 (10mg)

Trang 35

Lá Bục núi cao khô (3,5 kg) được nghiền thành bột và chiết 3 lần bằng methanol (3  5 lit) ở nhiệt độ 500 C trên thiết bị chiết siêu âm thu được 50,3

g cặn chiết Cặn chiết này được hòa tan vào 2 lit nước cất và tiến hành chiết phân phân bố lần lượt với chloroform (3  2 lit) và etyl axetat (3  2 lit) thu được các cặn chiết tương ứng: chloroform (MJC, 22,5 g), etyl axetat (MJE, 9,3 g) và lớp nước (MJW)

Cặn chiết chloroform (MJC) được tiến hành phân tách thô thành 5 phân đoạn, MJC1-MJC5 bằng sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải

gradient n-hexan/axeton (50/1 - 1/1) Các hợp chất 3 (8 mg), 4 (250 mg), 5

(7 mg) và 6 (11 mg) được tinh chế từ phân đoạn MJC2 (2,8 g) bằng sắc ký

cột silica gel pha thường rửa giải bằng n-hexanethyl axetate (8/1) Từ phân

5,7-dihydroxy-4'-methoxy-6-(3-methylbut-2-Hợp chất 1 được phân lập dưới dạng chất bột màu vàng nhạt Phổ 1

NMR của nó đặc trưng cho một hợp chất prenyl flavanone với sự xuất hiện các tín hiệu proton của một nhóm prenyl [ 3,10 (2H, br d, J = 7,0 Hz, H- 1''), 5,11 (1H, dt, J = 1,0, 7,0 Hz, H-2''), 1,60 (3H, s, H-4'') và 1,68 (3H, s, H-5'')], một vòng thơm thế para [ 7,41 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2' và H-6') và 6,95 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3' và H-5')], một nhóm oximethine [ 5,45 (1H,

H-dd, J = 4,0, 12,5 Hz, H-2)], một nhóm methylene [ 3,21 (1H, dd, J = 12,5,

Trang 36

17,0 Hz, H-3) và 2,70 (1H, dd, J = 4,0, 17,0 Hz, H-3)] và một proton vòng

thơm bị cô lập [ 5,67 (1H, s, H-8)]

Hình 1 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1

Ngoài ra, trên phổ 1

H-NMR của 1 còn xuất hiện các tín hiệu đặc trưng

của một nhóm methoxi tại  3,75 (3H, s, 4'-OMe) và proton OH tại C-5 xuất hiện ở vùng trường thấp tại  12,39 (1H, s, 5-OH) do có sự hình thành liên kết hydro với nhóm xêtôn C-4 Phổ 13

C-NMR của 1 cho thấy sự xuất hiện 21

tín hiệu cacbon bao gồm 15 tín hiệu của khung flavanone, năm tín hiệu của gốc prenyl và một tín hiệu methoxy Các số liệu 13

C-NMR được gán với các

số liệu 1

H-NMR tương ứng trên cơ sở phân tích phổ HSQC (Bảng 3)

Sự còn lại duy nhất một proton ở vòng A cho phép dự đoán vị trí C-5 của vòng A cũng bị hydroxyl hóa và gốc prenyl có thể gắn vào C-6 hoặc C-

8 Từ đó, số liệu phổ 13

C-NMR của 1 được so sánh với các số liệu ở vị trí

tương ứng của 5,7-dihydroxy-4'-methoxy-8-(3-methylbut-2-enyl)flavanone

[30], và 4'-O-methylbonannione A [31], hai hợp chất có cùng cấu trúc khung

flavanone và có nhánh prenyl và geranyl gắn tương ứng tại C-8 và C-6 Kết quả so sánh cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về số liệu 13

C-NMR của phần khung flavanone với hai vị trí thế khác nhau (Bảng 3)