Bước đầu xây dựng quy trình phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người bằng phương pháp PCR kết hợp reverse dot lot

B TR GIÁO D C VẨ ẨO T O NG IH CM TP.HCM KHOA CÔNG NGH SINH H C - - KHÓA LU N T T NGHI P Tên đ tài: B C U XÂY D NG QUY TRÌNH PHÁT HI N TH I CÁC TÁC NHÂN VI KHU N T PH M GÂY B NH CHO CON NG NG CÁC M U B NH I B NG PH NG PHÁP PCR K T H P REVERSE DOT LOT KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT GVHD: ThS TR NG KIM PH SVTH : NGUY N TR NG NGH A MSSV : 1053010486 Khóa : 2010 ậ 2014 Tp H Chí Minh, tháng n m 2014 NG Kh lu n t t nghi p β014 L IC M N Em xin chân thành c m n Quý Th y Cô Khoa Công ngh Sinh H c tr ng i h c M TP.HCM đƣ t n tình d y b o em nh ng n m v a qua, truy n đ t nh ng ki n th c quý báu đ lƠm hƠnh tr ng cho em b c vƠo đ i Em kính g i l i c m n chơn thƠnh đ n Cô Lê Huy n i Th y đƣ t n tình c v n, truy n đ t cho em nh ng ki n th c chun mơn b ích Em xin chân thành c m n Th y L o đ c Thu n đƣ t o u ki n cho em c th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p t i ph ng th nghi m Sinh H c Phơn T c bi t em xin chơn thƠnh bƠy t l ng bi t n sơu s c c Tr ng Kim Ph ng ng vi n vƠ gi p đ t ng b i đƣ ch r h c c ng nghi n c u h m nh t i c ng d n t n t nh đ ng em tr nh th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p Em xin chơn thƠnh c m n C ng Ty C Ph n C ng Ngh Vi t vi khu n c ng nh lƠ b h đƣ h ch ng ch t th nghi m gi p em hoƠn thƠnh đ tƠi kh lu n t t nghi p Em xin chơn thƠnh c m n nh C o B o Hi n đƣ t n t nh h tr k thu t gi p đ em tr nh th c hi n đ tƠi kh Nhơn d p nƠy em c ng xin bƠy t t m l ng c chuy n gi o lu n t t nghi p m nh đ i v i anh ch , b n vƠ em ph ng th nghi m Sinh H c Phơn T đƣ nhi t t nh gi p đ em th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p Cu i em xin g i l i bi t n sơu s c c ng h m nh đ n gi đ nh ng i thơn đƣ đ ng vi n em r t nhi u tr nh th c hi n đ tài khóa lu n t t nghi p Sinh viên Nguy n Tr ng Ngh Nguy n Tr ng Nghĩa ι Kh lu n t t nghi p β014 DANH M C CH VI T T T Kí hi u vi t t t Di n gi i A Adenine AMP Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat BLAST Basic Local Alignment Search Tool BP Baird Parker Bp Base Pair C Cytosine cAMP Cyclic Andenosine monophosphate cDNA complementary DNA CFU Colony Forming Unit DNA Deoxyribonucleic acid EIEC Enteroinvasive E.coli EPEC Enteropathogenic E.coli ETEC Enterotoxigenic E.coli G Guanidine IDT Integrated DNA technologies IMViC Indole, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate ISA Iso-sensitest agar ITS Internal Transcribed Spacer LB Labile heat LPS Lippolysaccharide MR Methyl Red mRNA messenger RNA NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical density PCR Polymerase Chain Reaction pH Potential Hydrogen RDB Reverse dot blot Nguy n Tr ng Nghĩa ιι Kh lu n t t nghi p β014 rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic acid rRNA ribosomal Ribonucleic Acid S Semi-conserved SEs Staphylococcal enterotoxins SNP Single nucleotide polymorphism ST Stable heat T Thymin Ta Temperature annealing TLTK Tài li u tham kh o Tm Temperature melting TMB 3,3,5,5- tetramethylbenzidine tRNA Transfer Ribonucleic Acid U Universal UV Ultraviolet, tia t ngo i V Variable VP Voges Proskauer VTEC Verotoxigenic E.coli Nguy n Tr ng Nghĩa ιιι Kh lu n t t nghi p β014 DANH M C B NG BI U B ng I.1 B ng th nghi m sinh hóa phân bi t nhóm vi khu n gây b nh đ ng ru t[25] 14 B ng II.1 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i 16S F – 16S_R 28 B ng II.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i 16S_F – 16S_R 29 B ng II.3 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i 23S_F – 23S_R .29 B ng II.4 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i βγS F – 23S_R .29 B ng III.1 Các vùng gen s d ng phát hi n vi sinh v t gây b nh 33 B ng III.2 Các k thu t sinh h c phân t s d ng xác đ nh nhanh vi khu n gây b nh 34 B ng III.3 Các c p m i s d ng nghiên c u 35 B ng III.4 Các m u dò s d ng nghiên c u m u dò 36 B ng III.5 B ng thơng s v t lí c a m i d a vào phân tích IDT .44 B ng III.6 B ng ch s OD c a m u DNA tách chi t t vi khu n đ i ch ng s d ng nghi n c u 57 B ng III.7 Ch s OD c a 15 m u DNA tách chi t s d ng nghi n c u 57 B ng III.8 V trí ch m m u dò màng lai 62 B ng III.9 Thông tin m u b nh ph m s d ng nghiên c u 82 B ng III.10 K t qu c y trang (s khu n l c) m t đ t bào CFU/ml .83 Nguy n Tr ng Nghĩa ιϖ Kh lu n t t nghi p β014 DANH M C HỊNH V Hình I.1 Hình thái t bào E.coli[75] Hình I.2 Hình thái t bào Staphylococcus aureus[76] .5 Hình I.3 Hình thái t bào Salmonella[77] Hình I.4 Hình thái t bào Shigella[78] .7 Hình I.5 Hình thái t bào Vibrio cholera[79] Hình I.6 Hình thái t bào Y enterocolitica[80] H nh I.7 Các b Hình I.8 Minh h c m t chu k PCR.[81 .16 ph ng pháp RDB[81 22 Hình III.1 K t qu BLAST m i 16S_F 38 Hình III.2 K t qu BLAST m i 16S_R 39 Hình III.3 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a c p m i 16S_F – 16S_R b ng công c Annhyb 40 Hình III.4 K t qu BLAST m i 23S_F 41 Hình III.5 K t qu BLAST m i 23S_R 42 Hình III.6 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a c p m i 23S_F – 23S_R b ng công c Annhyb 43 Hình III.7 K t qu BLAST m u dò SAL 45 Hình III.8 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò SAL b ng cơng c Annhyb 46 Hình III.9 K t qu BLAST m u dò SHI 47 Hình III.10 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò SHI b ng cơng c Annhyb 48 Hình III.11 K t qu BLAST m u dò SAU .49 Hình III.12 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò SAU b ng cơng c Annhyb 50 Hình III.13 K t qu BLAST m u dò VCH 51 Hình III.14 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò VCH b ng cơng c Annhyb 52 Nguy n Tr ng Nghĩa ϖ Kh lu n t t nghi p β014 Hình III.15 K t qu BLAST m u dò YER .53 Hình III.16 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò YER b ng công c Annhyb 54 Hình III.17 K t qu BLAST m u dò ECO .55 Hình III.18 K t qu kh o sát kh n ng b t c p c a m u dò ECO b ng công c Annhyb 56 Hình III.19 K t qu n di kh o sát nhi t đ lai c a c p m i 16S_F – 16S_R 58 Hình III.20 K t qu n di s n ph m PCR m u vi khu n đ i di n v i c p m i 16S rDNA 60 Hình III.21 K t qu n di s n ph m PCR c a ch ng E coli v i c p m i 23S rDNA 61 Hình III.22 K t qu ph n ng lai RDB ch ng chu n Staphylococcus aureus 62 Hình III.23 K t qu lai RDB ch ng chu n Yersinia enterocolitica .63 Hình III.24 K t qu lai RDB ch ng chu n Salmonella spp Shigella spp 63 Hình III.25 K t qu n di s n ph m PCR m u b nh ph m đ i di n v i c p m i 16S_F – 16S_R .66 Hình III.26 K t qu ph n ng lai RDB m u b nh ph m s 66 Hình III.27 K t qu n di s n ph m PCR m u b nh ph m đ i di n v i c p m i 23S_F – 23S_R .67 Hình III.28 K t qu minh h ng ng phát hi n vi khu n c a ph n ng RDB m u b nh ph m nhi m Staphylococcus aureus 69 Hình III.29 K t qu n di s n ph m PCR m u h n h p loài vi khu n khác 70 Hình III.30 K t qu lai RDB m u h n h p loài vi khu n khác .70 Nguy n Tr ng Nghĩa ϖι Kh lu n t t nghi p β014 M CL C L I C M N i DANH M C CH VI T T T ii DANH M C B NG BI U iv DANH M C HÌNH V v M C L C vii TV N PH N I I.1 T NG QUAN TÀI LI U .3 S L C V CÁC NHÓM VI KHU N GÂY B NH TH NG G P .3 I.1.1 Escherichia coli I.1.1.1 c m hình thái I.1.1.2 c m sinh h sinh d ng I.1.1.3 Thông tin b gen I.1.1.4 Phân lo i I.1.2 Staphylococcus aureus I.1.2.1 c m hình thái I.1.2.2 c m sinh h I.1.2.3 I.1.3 sinh d ng Thông tin b gen Salmonella spp .6 I.1.3.1 c m hình thái I.1.3.2 c m sinh h I.1.3.3 I.1.4 sinh d ng Thông tin b gen Shigella spp I.1.4.1 c m hình thái I.1.4.2 c m sinh h I.1.4.3 I.1.5 sinh d ng Thông tin b gen Vibrio cholerae I.1.5.1 c m hình thái Nguy n Tr ng Nghĩa ϖιι ... n ng PCR v i c p m i 23S_F – 23S_R .29 B ng II.4 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i βγS F – 23S_R .29 B ng III.1 Các vùng gen s d ng phát hi n vi sinh v t gây b nh 33 B ng III.2 Các. .. Hình I.5 Hình thái t bào Vibrio cholera[79] Hình I.6 Hình thái t bào Y enterocolitica[80] H nh I.7 Các b Hình I.8 Minh h c m t chu k PCR. [81 .16 ph ng pháp RDB[81 22 Hình... hóa phân bi t nhóm vi khu n gây b nh đ ng ru t[25] 14 B ng II.1 Thành ph n ph n ng PCR v i c p m i 16S F – 16S_R 28 B ng II.2 Chu k nhi t cho ph n ng PCR v i c p m i 16S_F – 16S_R