Nghiên cứu xây dựng qui trình real time PCR phát hiện vi khuẩn rickettsia gây bệnh ở người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƢỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƢỜI Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS BÙI TIẾN SỸ TS LÊ HỒNG ĐIỆP Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Thu Hằng, học viên cao học khóa 2015-2017 trường ĐH Khoa học Tự nhiên – ĐH Quốc gia Hà Nội, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan Đây luận văn trực tiếp thực khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108 hướng dẫn thầy TS.BS Bùi Tiến Sỹ TS Lê Hồng Điệp Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Học viên Nguyễn Thị Thu Hằng LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS.BS Bùi Tiến Sỹ TS Lê Hồng Điệp trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Song, PGS.TS Phan Quốc Hồn tạo điều kiện để tơi thực luận văn Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; cảm ơn anh chị Khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tôi xin trân trọng cảm ơn tồn thể thầy , giáo Khoa Sinh học cũng thầy cô giáo trường ĐH Khoa học Tự Nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Thu Hằng MỤC LỤC Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Rickettsiaceae .1 1.1.1 Lịch sử, phân loại đặc điểm Rickettsiaceae 1.1.2 Các bệnh Rickettsiaceae gây 1.1.3 Các vector lây truyền .3 1.2 Đặc điểm dịch tễ học bệnh Rickettsiaceae 1.2.1 Spotted Fever Group 1.2.2 Typhus Group 1.2.3 Scrub Typhus Group 1.3 1.3.1 Đặc điểm lâm sàng, chế gây bệnh Rickettsiaceae Spotted fever Group .8 1.3.2 Typhus Group: 11 1.3.3 Scrub Typhus Group .11 1.4 Điều trị 12 1.5 Các phương pháp pháp chẩn đoán Rickettsiaceae 12 1.5.1 Phương pháp Weil – Felix 12 1.5.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập mầm bệnh 13 1.5.3 Phương pháp ELISA 14 1.5.4 Phương pháp kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 15 1.5.5 Phương pháp PCR, nested PCR 16 1.5.6 Phương pháp real-time PCR 18 1.6 Tình hình bệnh Rickettsiaceae Việt Nam 20 Chƣơng - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên liệu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.2.3 Thiết bị, máy móc: 23 2.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp thiết kế mồi, probe 24 2.3.2 Tách chiết ADN 24 2.3.3 Khuếch đại gen vi khuẩn phản ứng PCR 26 2.3.4 Phương pháp điện di gel agarose .26 2.3.5 Phương pháp giải trình tự xác định lồi 27 2.3.6 Phương pháp nhân dòng 29 2.3.7 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng real-time PCR 32 2.3.8 Đánh giá độ nhạy kĩ thuật real-time PCR 33 2.4 Áp dụng hai kĩ thuật real-time PCR để chẩn đoán mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm O tsutsugamushi Rickettsia 33 Chƣơng - KẾT QUẢ 34 3.1 Xây dựng kĩ thuật real-time PCR phát vi khuẩn O tsutsugamushi loài Rickettsia .34 3.1.1 Thiết kế primer, probe đặc hiệu cho phản ứng PCR, real-time PCR 34 3.1.2 Thiết kế plasmid chuẩn dương cho phản ứng real-time PCR 36 3.1.3 Đánh giá độ đặc hiệu kĩ thuật real-time PCR 41 3.1.4 Đánh giá độ nhạy kĩ thuật Real-time PCR 43 3.2 Ứng dụng real-time PCR phát Rickettsiaceae mẫu bệnh phẩm nghi ngờ 46 3.2.1 Một số đặc điểm bệnh nhân nghi ngờ nhiễm Rickettsiaceae 46 3.2.2 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae kỹ thuật real-time PCR 47 3.2.3 Một số đặc điểm bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae 49 KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC VIẾT TẮT ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay IFA Indirect Fluorescent Antibody IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LPS Lipopolysaccharide O tsutsugamushi Orientia tsutsugamushi PCR Polymerase chain reaction RMSF Rocky Mountain spotted fever SCA Surface cell antigen SFG Spotted fever group STG Scrub typhus group TG Typhus group TSA Type-specific antigen DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Phân loại Rickettsiaceae Hình 1.2: Hình ảnh Rickettsia tế bào vật chủ Hình 1.3: Các vector lây truyền tác nhân gây bệnh Rickettsia Hình 1.4: Chu kỳ nhiễm bệnh Sốt Mò Hình 1.5: Phân bố loài Rickettsiaceae gây bệnh Hình 1.6: Phân bố lồi Rickettsia Hình 1.7: Tình hình dịch tễ STG 2000-2014 Hình 1.8: Sự lây nhiễm vi khuẩn nhóm SFG tế bào nội mơ Hình 1.9: Rickettsia rickettsii nhiễm trùng tế bào nội mạch Hình 1.10: Bệnh nhân nhiễm RMSF 10 Hình 1.11: Đặc điểm bệnh STG 11 Hình 1.12: Nguyên lý phương pháp ELISA .14 Hình 1.13: Biểu đồ đường biểu diễn tín hiệu cường độ huỳnh quang khuếch đại 18 Hình 2.1: Sơ đồ vector cloning pTZ57R/T 29 Hình 3.1: Trình tự vùng bảo thủ gen gltA 35 Hình 3.2: Trình tự vùng bảo thủ gen 56 kDa .35 Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng nested PCR, semi nested PCR, real-time PCR .37 Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng PCR vòng 38 Hình 3.5: Độ tương đồng trình tự PCR O2 từ mẫu SM1604 với liệu Genbank O tsutsugamushi 39 Hình 3.6: Độ tương đồng trình tự PCR R2 từ mẫu SM1608 với liệu Genbank Rickettsia .39 Hình 3.7: Kết kiểm tra plasmid pOri pRick PCR với cặp mồi M13 41 Hình 3.8: Độ đặc hiệu kỹ thuật real-time PCR 42 Hình 3.9: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu pOri .44 Hình 3.10: Đường chuẩn tuyến tính, tín hiệu khuếch đại thu pRick 44 Hình 3.11: Biểu đồ tỷ lệ dương tính với 50 phản ứng real-time PCR lặp lại 45 Hình 3.12: Đường biểu diễn tín hiệu khuếch đại phản ứng real-time PCR 45 Hình 3.13: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo giới tính 47 Hình 3.14: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi 47 Hình 3.15: Tín hiệu khuếch đại real-time PCR phát O tsutsugamushi 48 Hình 3.16: Kết real-time PCR phát O tsutsugamushi Rickettsia bệnh phẩm nghi ngờ .48 Hình 3.17: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo giới tính 50 Hình 3.18: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo nhóm tuổi 50 Hình 3.19: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo địa lý .51 Hình 3.20: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo tháng năm 51 DANH MỤC BẢNG, BIỂU Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR .26 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự 27 Bảng 2.3: Thành phần tinh sản phẩm PCR giải trình tự 28 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ligation 30 Bảng 2.5: Thành phần điều kiện phản ứng PCR sử dụng 32 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng real-time PCR .32 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng real-time PCR phát vi khuẩn 33 Bảng 3.1: Danh mục cặp mồi, probe thiết kế 36 Bảng 3.2: Kết tạo plasmid chuẩn dương real-time PCR cho vi khuẩn 41 Bảng 3.3: Độ đặc hiệu phản ứng real-time PCR 43 cao với 36,78% (Hình 3.14) Có thể thấy đối tượng có nguy nhiễm bệnh tất nhóm tuổi từ 19 – 92 tuổi, gặp nhóm độ tuổi lao động Hình 3.13: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo giới tính Trong đó: 67,82% bệnh nhân nam, 32,18% bệnh nhân nữ Hình 3.14: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân theo độ tuổi 3.2.2 Xác định tỷ lệ nhiễm Rickettsiaceae kỹ thuật real-time PCR Tiến hành phản ứng real-time PCR để phát O tsutsugamushi Rickettsia 87 bệnh phẩm nghi ngờ sốt Rickettsiaceae theo qui trình phần phương pháp trình bày Kết tín hiệu huỳnh quang ghi nhận sau phản ứng real-time PCR xác định O tsutsugamushi thể hình 3.15, tương tự xác định Rickettsia Kết khẳng định dương tính xuất 47 tín hiệu dương ống đối chứng dương, nội chuẩn (IC) mẫu nghiên cứu, đồng thời khơng ghi nhận tín hiệu ống đối chứng âm Hình 3.15: Tín hiệu khuếch đại real-time PCR phát O tsutsugamushi Hình 3.16: Kết real-time PCR phát O tsutsugamushi Rickettsia bệnh phẩm nghi ngờ Với 87 bệnh phẩm máu mô lấy vết loét, thu kết 33,33% dương tính với mầm bệnh Trong mẫu dương tính với chiếm 3,45% 26 mẫu dương tính với Rickettsia tương ứng với 29,88% (hình 3.16) Kết chúng tơi phù hợp với công bố tác giả Nguyễn Vũ Trung cộng sự, nghiên cứu tỷ lệ lưu hành Rickettsiaceae cộng đồng kỹ thuật huyết Nhóm nghiên cứu khẳng định tỷ lệ phơi nhiễm với 48 Rickettsia lớn so với nhiễm O tsutsugamushi [66] Trong Hang LK Nguyen cộng nghiên cứu 63 mẫu bệnh nhân nghi ngờ sốt mò (do O tsutsugamushi) có vết lt điển hình, nhóm nghiên cứu phát 42 mẫu (67%) dương tính với O tsutsugamushi khơng có mẫu dương tính với Rickettsia [42] Trong nghiên cứu chúng tơi có 03 bệnh nhân có vết lt điển hình sốt mò O tsutsugamushi mẫu máu từ bệnh nhân khẳng định dương tính với O tsutsugamushi âm tính với Rickettsia Kết khẳng định không phát Rickettsia bệnh có vết lt điển hình, đồng thời không phát O tsutsugamushi mẫu không tìm thấy vết lt Với 33,33% dương tính, cho thấy tỷ lệ cao đáng kể 87 bệnh nhân có biểu sốt chưa rõ nguyên nhân với trường hợp xuất vết lt điển hình dương tính O tsutsugamushi Như vậy, thấy Rickettsiaceae nguyên gây bệnh đáng ý Từ trước đến nay, nghiên cứu Việt Nam thường tập trung vào bệnh STG với vết lt điển hình mà quan tâm, nghiên cứu với trường hợp sốt ko có vết loét Bệnh Rickettsiaceae gây lây truyền nhiều loại vector lây nhiễm khác bọ chét, loài bọ ve, mọt, rận, bọ phấn hay đặc biệt muỗi Hơn nữa, bệnh khơng phải tất có triệu chứng vết lt, có bệnh khơng xuất vết lt gây khó khăn cho việc chẩn đốn [38] Phân tích sâu chủng Rickettsia chúng tơi giải trình tự ngẫu nhiên 02 mẫu dương tính với Rickettsia cho thấy trình tự thu gần với chủng R typhi 3.2.3 Một số đặc điểm bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae Trong số 29 ca bệnh nhiễm O.tsutsugamushi Rickettsia có 19 bệnh nhân nam chiếm tỷ lệ 65,52%; 10 bệnh nhân nữ chiếm tỷ lệ 34,48% Độ tuổi bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae chủ yếu từ 29-86 tuổi Tuy nhiên có bệnh nhân trẻ em tuổi chiếm tỷ lệ 3,45% Nhóm tuổi 17-60 chiếm tỷ lệ cao với 62,07% Nhóm tuổi lớn 60 tuổi chiếm tỷ lệ tương đối cao 34,48% Qua phân tích phân bố tỷ lệ bệnh nhân, nhận thấy có tương đồng nhóm bệnh nhân nghi ngờ nhóm bệnh nhân mắc bệnh Kết tương tự với 49 công bố Phạm Thanh Thủy (2007), Suputtamongkol cộng (2009) thấy bệnh nhân nhiễm Rickettsia gặp lứa tuổi [1][64] Hình 3.17: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo giới tính Hình 3.18: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo nhóm tuổi Về phân bố theo địa lý, người bệnh sinh sống tỉnh thành khác có bệnh nhân đến từ Lào chiếm 3,45% Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân chủ yếu tập trung Hà Nội với 62,07% (hình 3.19) Nghiên cứu chúng tơi thực bệnh viện Trung ương Quân đội 108 thành phố Hà Nội, thuận tiện việc thăm khám bệnh bệnh nhân thuộc Hà Nội khu vực lận cận 50 Hình 3.19: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo địa lý Hình 3.20: Biểu đồ tỷ lệ bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceae theo tháng năm Số người nhiễm Rickettsiaceae chủ yếu tập trung từ tháng đến tháng hàng năm, cao vào tháng 5, tháng với tỷ lệ tương ứng 18,18% 20,45% (hình 3.20) Mặc dù có sai khác với tỷ lệ nghi ngờ nhiễm bệnh, điều lý giải đặc điểm lồi trùng chân đốt có khả lây truyền bệnh thường phát triển mạnh vào tháng có khí hậu nóng ẩm năm Kết tương tự tỷ lệ phân bố ca SFG theo báo cáo CDC Hoa Kỳ (Centers For Disease Control and Prevetion, USA) [76] 51 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu đưa số kết luận sau: Xây dựng thành cơng qui trình Real-time PCR để phát Orientia Rickettsia với: - Cặp mồi probe đặc hiệu cho real-time PCR: O.tsu108S-F3 ̶ O.tsu108S-R3 ̶ O.tsu108S-Pro Orientia Rick.S-CS-F1 ̶ Rick.S-CS-R1 ̶ Rick.S-CS-Pro1 Rickettsia - Độ đặc hiệu độ nhạy hai qui trình tương ứng 100% 20 copies/phản ứng Áp dụng kĩ thuật phát nguyên gây bệnh 87 mẫu bệnh nhân nghi ngờ có trường hợp dương tính với Orientia chiếm 3,45%, 26 trường hợp dương tính với Rickettsia khác chiếm 29,88% 52 KIẾN NGHỊ Do hạn chế thời gian nên nghiên cứu chưa tiến hành với quy mô lớn để phát Rickettsiaceae Hướng nghiên cứu dự kiến đề tài: Phân tích kỹ đặc điểm dịch tễ học bệnh Rickettsiaceae Giải trình tự mẫu dương tính với O tsutsugamushi Rickettsia vùng gen thực vùng gen khác nhằm phân tích phân loại sinh học 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phạm Thanh Thủy (2007) ―Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, phương pháp chẩn đốn điều trị bệnh sốt mò,‖ Đại học Y Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Amano K., Tamura A., Ohashi N., Urakami H., Kaya S., et al (1987) ―Deficiency of peptidoglycan and lipopolysaccharide components in Rickettsia tsutsugamushi.,‖ Infect Immun., vol 55, no 9, pp 2290–2292 Anderson B E., Tzianabos T (1989) ―Comparative sequence analysis of a genus-common rickettsial antigen gene.,‖ J Bacteriol., vol 171, no 9, pp 5199–5201 Andersson S G E., Zomorodipour A., Andersson J O., Sicheritz-Pontén T., Alsmark U C M., et al (1998) ―The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria,‖ Nature, vol 396, no 6707, pp 133–140 Aung A K., Spelman D W., Murray R J., Graves S (2014) ―Rickettsial infections in Southeast Asia: implications for local populace and febrile returned travelers,‖ Am J Trop Med Hyg., vol 91, no 3, pp 451–460 Aydin S (2015) ―A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA,‖ Peptides, vol 72, pp 4–15 Bechah Y., Capo C., Mege J.-L., Raoult D (2008) ―Rickettsial diseases: from Rickettsia–arthropod relationships to pathophysiology and animal models.‖ Berman S J., Kundin W D (1973) ―Scrub typhus in South Vietnam: a study of 87 cases,‖ Ann Intern Med., vol 79, no 1, pp 26–30 Bozeman F M., Elisberg B L (1963) ―Serological diagnosis of scrub typhus by indirect immunofluorescence,‖ Proc Soc Exp Biol Med., vol 112, no 3, pp 568–573 10 Civen R., Ngo V (2008) ―Murine typhus: an unrecognized suburban 54 vectorborne disease,‖ Clin Infect Dis., vol 46, no 6, pp 913–918 11 Cowan G (2000) ―Rickettsial diseases: the typhus group of fevers—a review,‖ Postgrad Med J., vol 76, no 895, pp 269–272 12 Cruickshank R (1927) ―The Weil-Felix reaction in typhus fever,‖ Epidemiol Infect., vol 27, no 1, pp 64–69 13 Dasch G A., Halle S., Bourgeois A L (1979) ―Sensitive microplate enzymelinked immunosorbent assay for detection of antibodies against the scrub typhus rickettsia, Rickettsia tsutsugamushi.,‖ J Clin Microbiol., vol 9, no 1, pp 38–48 14 Dumler J S., Walker D H (2005) ―Rocky Mountain spotted fever–changing ecology and persisting virulence,‖ N Engl J Med, vol 353, no 6, pp 551– 553 15 Edwards MS F R (2004) ―Rickettsial diseases,‖ in Pediatric Infectious Diseases, 5th ed, pp 2497–2515 16 Engvall E., Perlmann P (1971) ―Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G,‖ Immunochemistry, vol 8, no 9, pp 871–874 17 Ericsson C D., Jensenius M., Fournier P.-E., Raoult D (2004) ―Rickettsioses and the international traveler,‖ Clin Infect Dis., vol 39, no 10, pp 1493– 1499 18 Fournier P.-E., Roux V., Raoult D (1998) ―Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rOmpA,‖ Int J Syst Evol Microbiol., vol 48, no 3, pp 839–849 19 Fournier P E., Raoult D (2004) ―Suicide PCR on skin biopsy specimens for diagnosis of Rickettsioses,‖ J Clin Microbiol., vol 42, no 8, pp 3428–3434 20 Groß D., Schäfer G (2011) ―100th Anniversary of the death of Ricketts: Howard Taylor Ricketts (1871–1910) The namesake of the Rickettsiaceae family,‖ Microbes Infect., vol 13, no 1, pp 10–13 21 Hamaguchi S., Cuong N C., Tra D T., Doan Y H., Shimizu K., et al (2015) ―Clinical and epidemiological characteristics of scrub typhus and murine 55 typhus among hospitalized patients with acute undifferentiated fever in northern Vietnam,‖ Am J Trop Med Hyg., vol 92, no 5, pp 972–978 22 Izzard L., Fuller A., Blacksell S D., Paris D H., Richards A L., et al (2010) ―Isolation of a novel Orientia species (O chuto sp nov.) from a patient infected in Dubai,‖ J Clin Microbiol., vol 48, no 12, pp 4404–4409 23 Jiang J U., Temenak J J., Richards A L (2003) ―Real‐Time PCR Duplex Assay for Rickettsia prowazekii and Borrelia recurrentis,‖ Ann N Y Acad Sci., vol 990, no 1, pp 302–310 24 Jr A K (1995) Tsutsugamushi Disease Tokyo: University of Tokyo Press 25 Kelly D J., Fuerst P A., Ching W.-M., Richards A L (2009) ―Scrub typhus: the geographic distribution of phenotypic and genotypic variants of Orientia tsutsugamushi,‖ Clin Infect Dis., vol 48, no Supplement_3, pp S203–S230 26 Kim D.-M., Kim H L., Park C Y., Yang T Y., Lee J H., et al (2006) ―Clinical usefulness of eschar polymerase chain reaction for the diagnosis of scrub typhus: a prospective study,‖ Clin Infect Dis., vol 43, no 10, pp 1296–1300 27 Kim D.-M., Park G., Kim H S., Lee J Y., Neupane G P., et al (2011) ―Comparison of conventional, nested, and real-time quantitative PCR for diagnosis of scrub typhus.,‖ Journal of clinical microbiology, vol 49, no pp 607–12 28 Kim G., Ha N.-Y., Min C.-K., Kim H.-I., Yen N T H., et al (2017) ―Diversification of Orientia tsutsugamushi genotypes by intragenic recombination and their potential expansion in endemic areas,‖ PLoS Negl Trop Dis., vol 11, no 3, p e0005408 29 Kim Y.-S., Yun H.-J., Shim S K., Koo S H., Kim S Y., et al (2004) ―A comparative trial of a single dose of azithromycin versus doxycycline for the treatment of mild scrub typhus,‖ Clin Infect Dis., vol 39, no 9, pp 1329–1335 30 Koh G C K W., Maude R J., Paris D H., Newton P N., Blacksell S D (2010) ―Diagnosis of Scrub Typhus,‖ American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, vol 82, no pp 368–370 56 31 Kramme S., Khoa N D., Tannich E., Rybniker J., Fleischer B., et al (2009) ―Orientia tsutsugamushi bacteremia and cytokine levels in Vietnamese scrub typhus patients,‖ J Clin Microbiol., vol 47, no 3, pp 586–589 32 Kularatne S A M., Gawarammana I B (2009) ―Validity of the Weil-Felix test in the diagnosis of acute rickettsial infections in Sri Lanka,‖ Trans R Soc Trop Med Hyg., vol 103, no 4, pp 423–424 33 Lee S.-H., Kim D.-M., Cho Y S., Yoon S H., Shim S K (2006) ―Usefulness of eschar PCR for diagnosis of scrub typhus,‖ J Clin Microbiol., vol 44, no 3, pp 1169–1171 34 Lee Y.-M., Kim D.-M., Lee S.-H., Jang M.-S., Neupane G P (2011) ―Phylogenetic analysis of the 56 kDa protein genes of Orientia tsutsugamushi in Southwest Area of Korea,‖ Am J Trop Med Hyg., vol 84, no 2, pp 250– 254 35 Liang C., Zhao J., Li J., Chang L., Yu H., et al (2012) ―Spotted fever group Rickettsia in Yunnan Province, China,‖ Vector-Borne Zoonotic Dis., vol 12, no 4, pp 281–286 36 Lim C., Paris D H., Blacksell S D., Laongnualpanich A., Kantipong P., et al (2015) ―How to determine the accuracy of an alternative diagnostic test when it is actually better than the reference tests: a re-evaluation of diagnostic tests for scrub typhus using Bayesian LCMs,‖ PLoS One, vol 10, no 5, p e0114930 37 Lin P.-R., Tsai H.-P., Tsui P.-Y., Weng M.-H., Kuo M.-D., et al (2011) ―Genetic Typing of The 56-kDa Type-specific antigen gene of Orientia tsutsugamushi strains isolated from Chiggers from wild-caught rodents in Taiwan,‖ Appl Environ Microbiol 38 Merhej V., Angelakis E., Socolovschi C., Raoult D (2014) ―Genotyping, evolution and epidemiological findings of Rickettsia species,‖ Infect Genet Evol., vol 25, pp 122–137 39 Mullis K B (1990) ―Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction.,‖ in Annales de biologie clinique, 1990, vol 48, 57 no 8, pp 579–582 40 Nadjm B., Thuy P T., Trang V D., Dang Ha L., Kinh N V, et al (2014) ―Scrub typhus in the northern provinces of Vietnam: an observational study of admissions to a national referral hospital,‖ Trans R Soc Trop Med Hyg., vol 108, no 11, pp 739–740 41 Nakayama K., Yamashita A., Kurokawa K., Morimoto T., Ogawa M., et al (2008) ―The whole-genome sequencing of the obligate intracellular bacterium Orientia tsutsugamushi revealed massive gene amplification during reductive genome evolution,‖ DNA Res., vol 15, no 4, pp 185–199 42 Nguyen H L K., Pham H T T., Nguyen T V, Hoang P V M., Le M T Q., et al (2017) ―The genotypes of Orientia tsutsugamushi, identified in scrub typhus patients in northern Vietnam,‖ Trans R Soc Trop Med Hyg., vol 111, no 3, pp 137–139 43 Ngwamidiba M., Blanc G., Ogata H., Raoult D., FOURNIER P (2005) ―Phylogenetic Study of Rickettsia Species Using Sequences of the Autotransporter Protein‐Encoding Gene sca2,‖ Ann N Y Acad Sci., vol 1063, no 1, pp 94–99 44 Ngwamidiba M., Blanc G., Raoult D., Fournier P.-E (2006) ―Sca 1, a previously undescribed paralog from autotransporter protein-encoding genes in Rickettsia species,‖ BMC Microbiol., vol 6, no 1, p 12 45 Ogata H., Audic S., Abergel C., Fournier P.-E., Claverie J.-M (2002) ―Protein coding palindromes are a unique but recurrent feature in Rickettsia,‖ Genome Res., vol 12, no 5, pp 808–816 46 Panpanich R., Garner P (2009) ―Antibiotics for treating scrub typhus,‖ Cochrane Database Syst Rev, vol 47 Paris D H., Aukkanit N., Jenjaroen K., Blacksell S D., Day N P J (2009) ―A highly sensitive quantitative real‐time PCR assay based on the groEL gene of contemporary Thai strains of Orientia tsutsugamushi,‖ Clin Microbiol Infect., vol 15, no 5, pp 488–495 48 Paris D H., Blacksell S D., Stenos J., Graves S R., Unsworth N B., et al 58 (2008) ―Real-time multiplex PCR assay for detection and differentiation of rickettsiae and orientiae,‖ Trans R Soc Trop Med Hyg., vol 102, no 2, pp 186–193 49 Parola P., Paddock C D., Socolovschi C., Labruna M B., Mediannikov O., et al (2013) ―Update on tick-borne rickettsioses around the world: a geographic approach,‖ Clin Microbiol Rev., vol 26, no 4, pp 657–702 50 Parola P., Raoult D (2001) ―Ticks and tickborne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat,‖ Clin Infect Dis., vol 32, no 6, pp 897–928 51 Prakash J A J., Kavitha M L., Mathai E (2011) ―Nested polymerase chain reaction on blood clots for gene encoding 56 kDa antigen and serology for the diagnosis of scrub typhus,‖ Indian J Med Microbiol., vol 29, no 1, p 47 52 Qiang Y., Tamura A., Urakami H., Makisaka Y., Koyama S., et al (2003) ―Phylogenetic Characterization of Orientia tsutsugamushi Isolated in Taiwan According to the Sequence Homologies of 56‐kDa Type‐Specific Antigen Genes,‖ Microbiol Immunol., vol 47, no 8, pp 577–583 53 Raoult D., Parola P (2007) ―Rickettsial Diseases (Infectious Disease and Therapy),‖ in Rickettsial Diseases 54 Regnery R L., Spruill C L., Plikaytis B D (1991) ―Genotypic identification of rickettsiae and estimation of intraspecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes.,‖ J Bacteriol., vol 173, no 5, pp 1576–1589 55 Roux V., Raoult D (1995) ―Phylogenetic analysis of the genus Rickettsia by 16S rDNA sequencing,‖ Res Microbiol., vol 146, no 5, pp 385–396 56 Roux V., Raoult D (2000) ―Phylogenetic analysis of members of the genus Rickettsia using the gene encoding the outer-membrane protein rOmpB (ompB).,‖ Int J Syst Evol Microbiol., vol 50, no 4, pp 1449–1455 57 Roux V., Rydkina E., Eremeeva M., Raoult D (1997) ―Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae,‖ Int J Syst Evol Microbiol., vol 47, no 2, pp 252–261 58 Rovery C., Brouqui P., Raoult D (Sep 2008) ―Questions on Mediterranean 59 Spotted Fever a Century after Its Discovery,‖ Emerg Infect Dis., vol 14, no 9, pp 1360–1367 59 Rovery C R D (2008) ―Meditteranean Spotted Fever,‖ in Infect Dis Clin N Am, pp 515–530 60 Saisongkorh W., Chenchittikul M., Silpapojakul K (2004) ―Evaluation of nested PCR for the diagnosis of scrub typhus among patients with acute pyrexia of unknown origin,‖ Trans R Soc Trop Med Hyg., vol 98, no 6, pp 360–366 61 Silpapojakul K (1997) ―Scrub typhus in the Western Pacific region.,‖ Ann Acad Med Singapore, vol 26, no 6, pp 794–800 62 Socolovschi C., Pagés F., Raoult D (2012) ―Rickettsia felis in Aedes albopictus mosquitoes, Libreville, Gabon,‖ Emerg Infect Dis., vol 18, no 10, p 1687 63 Stenos J., Graves S R., Unsworth N B (2005) ―A highly sensitive and specific real-time PCR assay for the detection of spotted fever and typhus group Rickettsiae,‖ Am J Trop Med Hyg., vol 73, no 6, pp 1083–1085 64 Suputtamongkol Y., Suttinont C., Niwatayakul K., Hoontrakul S., Limpaiboon R., et al (2009) ―Epidemiology and clinical aspects of rickettsioses in Thailand,‖ Ann N Y Acad Sci., vol 1166, no 1, pp 172– 179 65 Tamura A., Ohashi N., Urakami H., Miyamura S (1995) ―Classification of Rickettsia tsutsugamushi in a New Genus, Orientia gen nov., as Orientia tsutsugamushi comb nov.,‖ Int J Syst Evol Microbiol., vol 45, no 3, pp 589–591 66 Trung N V., Thuong N., Toan T K., Huong T T K., Hoa T M., et al (2017) ―Seroprevalence of Scrub Typhus, Typhus, and Spotted Fever among Rural and Urban Populations of Northern Vietnam.‖ 67 Tzianabos T., Anderson B E., McDADE J E (1989) ―Detection of Rickettsia rickettsii DNA in clinical specimens by using polymerase chain reaction technology.,‖ J Clin Microbiol., vol 27, no 12, pp 2866–2868 60 68 Unsworth N B., Stenos J., McGregor A R., Dyer J R., Graves S R (2005) ―Not only ‗Flinders Island‘spotted fever,‖ Pathology, vol 37, no 3, pp 242–245 69 Varghese G M., Janardhanan J., Mahajan S K., Tariang D., Trowbridge P., et al (2015) ―Molecular epidemiology and genetic diversity of Orientia tsutsugamushi from patients with scrub typhus in regions of India,‖ Emerg Infect Dis., vol 21, no 1, p 64 70 Le Viet N., Laroche M., Pham H L T., Viet N L., Mediannikov O., et al (2017) ―Use of eschar swabbing for the molecular diagnosis and genotyping of Orientia tsutsugamushi causing scrub typhus in Quang Nam province, Vietnam,‖ PLoS Negl Trop Dis., vol 11, no 71 Walker D H (2007) ―Rickettsiae and rickettsial infections: the current state of knowledge,‖ Clin Infect Dis., vol 45, no Supplement_1, pp S39–S44 72 Walker D and D B (2007) ―Rickettsia and Orientia,‖ in Manual of Clinical Microbiology, 9th ed, p 1042 73 Walker DH B S (1996) ―Rickettsiae,‖ in Medical Microbiology, 4th ed., University of Texas Medical Branch 74 Wongprompitak P., Duong V., Anukool W., Sreyrath L., Mai T T X., et al (2015) ―Orientia tsutsugamushi, agent of scrub typhus, displays a single metapopulation with maintenance of ancestral haplotypes throughout continental South East Asia,‖ Infect Genet Evol., vol 31, pp 1–8 75 www.cdc.gov/mmwr/volumes/65/rr/rr6502a1 76 www.cdc.gov/rmsf/stats/index.html 77 www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ 78 www.thermofisher.com 61 ... đề tài: Nghiên cứu xây dựng qui trình real- time PCR phát vi khuẩn Rickettsia gây bệnh người. ” Với hai mục tiêu chính: Xây dựng kĩ thuật real- time PCR phát vi khuẩn O tsutsugamushi loài Rickettsia. .. Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH REAL- TIME PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN RICKETTSIA GÂY BỆNH Ở NGƢỜI Chuyên ngành Mã số : Sinh học thực nghiệm : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG... ứng real- time PCR 36 3.1.3 Đánh giá độ đặc hiệu kĩ thuật real- time PCR 41 3.1.4 Đánh giá độ nhạy kĩ thuật Real- time PCR 43 3.2 Ứng dụng real- time PCR phát Rickettsiaceae mẫu bệnh