NGHIÊN cứu QUY TRÌNH CHẾ tạo bộ KIT MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN một số tác NHÂN THƯỜNG gặp gây NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN tại các BỆNH VIỆN hà nội

BỆNH VIỆN THANH NHÀN BÁO CÁO KHOA HỌC TỔNG KẾT NĂM 2016 ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ TẠO BỘ KIT MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN THƯỜNG GẶP GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN TẠI CÁC BỆNH VIỆN HÀ NỘI Chủ nhiệm đề tài : Nguyễn Minh Hiền Lã Thị Huyền Đơn vị thực : Bệnh viện Thanh Nhàn Hà Nội - 2017 BỆNH VIỆN THANH NHÀN BÁO CÁO KHOA HỌC TỔNG KẾT NĂM 2016 ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ TẠO BỘ KIT MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN THƯỜNG GẶP GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN TẠI CÁC BỆNH VIỆN HÀ NỘI Đơn vị thực Chủ nhiệm đề tài (Ký tên đóng dấu) Hà Nội - 2017 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT CSYT DNA HSTC NKBV NVYT PCR Cơ sở y tế Deoxyribonucleic Acid Hồi sức tích cực Nhiễm khuẩn bệnh viện Nhân viên y tế Polymerase Chain Reaction MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV, nosocomial infection) thách thức mối quan tâm hàng đầu cơng tác chăm sóc sức khỏe Việt Nam tồn giới NKBV xem bệnh gây bệnh viện, bệnh nhiễm khuẩn mắc phải thời gian bệnh nhân nằm viện Những nghiên cứu cho thấy NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện, tăng việc sử dụng kháng sinh, tăng kháng kháng sinh chi phí điều trị [1] Cùng với xuất số bệnh gây vi sinh vật kháng thuốc, tác nhân gây bệnh mới, NKBV vấn đề nan giải nước phát triển Thống kê cho thấy tỉ lệ NKBV vào khoảng 5-10% nước phát triển lên đến 15-20% nước phát triển Các bệnh nguyên gây NKBV có mức độ đa kháng kháng sinh cao bệnh nguyên gây nhiễm khuẩn cộng đồng NKBV kéo dài thời gian nằm viện trung bình từ đến 15 ngày, làm gia tăng sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Do đó, chi phí NKBV thường gấp đến lần so với trường hợp khơng NKBV Chi phí phát sinh nhiễm khuẩn huyết bệnh viện $34,508 đến $56,000 viêm phổi bệnh viện $5,800 đến $40,000 vài nghiên cứu Tại Hoa Kỳ, hàng năm ước tính có triệu bệnh nhân bị NKBV, làm 90.000 người tử vong, làm tốn thêm 4,5 tỉ dollar viện phí [2] Tình hình NKBV Việt nam chưa xác định đầy đủ, có tài liệu giám sát NKBV công bố, tốn nhân lực tài lực NKBV toàn quốc chưa xác định [3] Nhiễm khuẩn bệnh viện nước ta nói riêng giới nói chung khó khăn lớn cho bệnh viện tỉ lệ nhiễm khuẩn ngày cao Do đó, vấn đề đặt hạn chế NKBV nhằm đảm bảo an toàn sức khỏe cho người bệnh, nhân viên y tế cho tồn xã hội Tác nhân gây NKBV có nhiều thay đổi vài thập kỷ qua Các vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn gram dương trực khuẩn Gram(-), nấm, ký sinh trùng Tuy nhiên, NKBV trực khuẩn Gram(-) đa kháng thuốc kháng sinh trở thành một tai họa thực cho bệnh viện Nuôi cấy vi sinh vật phương pháp phổ biến để phát vi khuẩn gây bệnh máu dịch thể nhiên phương pháp nhiều hạn chế thời gian độ nhạy không cao Để phát sớm vi sinh vật gây nhiễm khuẩn thể nghiên cứu gần đưa định hường phát DNA đặc hiệu vi khuẩn Việc phát DNA vi khuẩn mẫu bệnh phẩm bệnh nhân cho phương pháp có độ nhạy xác cao Tuy nhiên, chưa có phương pháp phát DNA vi khuẩn cho chuẩn để ứng dụng vào chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết Vì vậy, nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đốn nhanh, có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhu cầu thiết Multiplex PCR coi giải pháp cho vấn đề Đay sở để thực nghiên cứu: “Nghiên cứu quy trình chế tạo KIT Multiplex Realtime PCR phát số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện bệnh viện Hà Nội” Mục tiêu: Xây dựng quy trình chế tạo KIT Multiplex PCR phát số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện CHƯƠNG TỔNG QUAN Nhiễm khuẩn bệnh viện 1.1 Lịch sử phát nghiên cứu nhiễm khuẩn bệnh viện Trong thời trung cổ, bệnh viện thành lập để điều trị nạn nhân bệnh dịch hạch sau bệnh viện với nhân viên y tế phục vụ xã hội Năm 1869, Sir James Young Simpson thực nghiên cứu dịch tễ học bệnh viện với 4000 người bệnh Scotland Anh, ông nhận thấy tỷ lệ tử vong cao bệnh nhân lại bệnh viện điều trị hậu phẫu Ông sử dụng thuật ngữ "hospitalism" cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóc bệnh viện Sau nhiều năm cơng trình chuyên sâu tác giả Oliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Joseph Lister, Robert Koch, xác định yếu tố nguy liên quan đến nhiễm khuẩn bệnh viện (Semmelweis năm 1848, Eickhoff, 1981) giới thiệu nguyên tắc khắc phục rửa tay khử trùng dụng cụ sử dụng phẫu giảm lan truyền bệnh tật tử vong (Major, 1954) [4] Theo tổ chức Y tế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện được định nghĩa như sau: “Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải thời gian người bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng như không nằm giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện NKBV thường xuất hiện sau 48 giờ kể từ người bệnh nhập viện” [5] Để chẩn đoán NKBV người ta thường dựa vào định nghĩa tiêu chuẩn chẩn đốn cho vị trí NKBV (Hình 1), ví dụ như Nhiễm khuẩn vết mổ sau phẫu thuật, nhiễm khuẩn máu có liên quan đến dụng cụ đặt lòng mạch, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, Hiện theo hướng dẫn từ Trung tâm giám sát phòng bệnh Hoa Kỳ (CDC) Hội nghị quốc tế mở rộng định nghĩa ca bệnh cho vị trí nhiễm khuẩn khác hiện được áp dụng để giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện trên toàn cầu Dựa trên tiêu chuẩn lâm sàng sinh học, nhà khoa học xác định có khoảng 50 loại nhiễm khuẩn bệnh viện khác xảy bệnh viện Hình 1.1: Thời gian xuất hiện NKBV Nhiễm khuẩn liên quan đến sở Y tế (CSYT) không số chất lượng chuyên môn, mà số an toàn người bệnh, số đánh giá tuân thủ thực hành nhân viên y tế (NVYT), số đánh giá hiệu lực công tác quản lý một số nhạy cảm người bệnh xã hội [6] Nghiên cứu hiệu Chương trình kiểm sốt nhiễm khuẩn bệnh viện SENIC (Study on the Efficacy of Nosocomial Infection Control) năm 1970 -1976 khẳng định Chương trình kiểm sốt NKBV bao gồm giám sát áp dụng kỹ thuật làm giảm 33% NKBV Từ đó, nhiều bệnh viện cải tiến biện pháp kiểm soát NKBV đạt được nhiều thành công Từ năm 2007, Hiệp hội KSNK dịch tễ học Hoa Kỳ APIC (Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology) đưa mục tiêu “hướng đến không có NKBV” 10 tâm Trong trường hợp này, kĩ thuật multiplex PCR chứng tỏ độ nhạy độ đặc hiệu 100% việc phát chủng vi khuẩn Dự đoán giá trị âm tính dương tính kĩ thật multiplex PCR 100% 3.5 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu bệnh phẩm 3.5.1 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu bệnh phẩm cấy máu Nhằm mục tiêu đưa phương pháp multiplex PCR áp dụng vào thực tiễn để chẩn đoán phát nhanh nhiễm khuẩn huyết, thử nghiệm phương mẫu bệnh phẩm cấy máu trước Phương pháp multiplex PCR thử nghiệm 68 mẫu bệnh phẩm bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết nhận từ bệnh viện Thanh Nhàn Các mẫu mã hóa để tăng tính khách quan cho thử nghiệm Đầu tiên, DNA chủng vi khuẩn từ 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu tách chiết phương pháp đun sôi (theo mô tả phần vật liệu phương pháp nghiên cứu) Tiếp theo, dùng DNA tách chiết để làm khuôn cho phản ứng multiplex PCR Kết multiplex PCR điện di triểm tra gel agarose 1% so sánh với kết cấy máu Hình 3.9 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu bệnh phẩm cấy máu Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR số mẫu bệnh phẩm cấy máu Đối chứng âm, Marker 1kb, 3-17 Sản phẩm multiplex PCR mẫu BN1-BN15 76 Kết điện di kiểm tra gel agarose cho thấy sản phẩm PCR mẫu bệnh phẩm BN2 (đường chạy 4), BN4 (đường chạy 6), BN8 (đường chạy 10), BN10 (đường chạy 12), BN12 (đường chạy 14) cho kết dương tính với băng sáng rõ tương ứng với kích thước gen đích gltA (722 bp) chủng Acinetobacter baumannii, mdh (364 bp) chủng Klebsiella pneumonia, femA (296 bp) chủng Staphylococcus aureus, phoA (890 bp) chủng Escherichia coli oprL (504 bp) chủng Pseudomonas aeruginosa Các mẫu bệnh phẩm lại bao gồm BN1 (đường chạy 3), BN3 (đường chạy 5), BN5 (đường chạy 7), BN6 (đường chạy 8), BN7 (đường chạy 9), BN9 (đường chạy 11), BN11 (đường chạy 13), BN13 (đường chạy 15), BN14 (đường chạy 16), BN15 (đường chạy 17) cho kết âm tính Mẫu đối chứng (đường chạy 1) đối chứng âm cho kết âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tơi sử dụng có độ tinh khiết cao q trình thao tác thí nghiệm đảm bảo khơng bị nhiễm Các mẫu bệnh phẩm âm tính chủng vi khuẩn gây bệnh khác chứa chủng vi khuẩn quan tâm mà gen đích khơng khuếch đại khơng có chủng vi khuẩn Ngoài ra, tổng số 68 mẫu bệnh phẩm cấy máu mà chúng tơi khảo sát có mẫu dương tính âm tính khác Do đó, để khẳng định kết quả, tiến hành so sánh kết multiplex PCR 68 mẫu cấy máu với kết cấy máu để đánh khả phát sinh vật đích phương pháp multiplex PCR Kết so sánh thể Bảng 3.8 77 Bảng 3.8 So sánh kết quả multiplex PCR mẫu bệnh phẩm cấy máu với kết quả phương pháp cấy máu STT Mã bệnh nhân Kết multiple PCR Kết cấy máu BN1 Âm tính Âm tính BN2 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii BN3 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) BN4 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia BN5 Âm tính Âm tính BN6 Âm tính Âm tính BN7 Âm tính Trực khuẩn Gr(+) BN8 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus BN9 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 10 BN10 Escherichia coli Escherichia coli 11 BN11 Âm tính Âm tính 12 BN12 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 13 BN13 Âm tính Trực khuẩn Gr(-) 14 BN14 Âm tính Trực khuẩn Gr(-) 15 BN15 Âm tính Nấm candida Knisie 16 BN16 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 17 BN17 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 18 BN18 Âm tính Âm tính 19 BN19 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 20 BN20 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 21 BN21 Âm tính Citrobacter sp 22 BN22 Âm tính Âm tính 23 BN23 Âm tính Trực khuẩn Gr(-) 24 BN24 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 25 BN25 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 26 BN26 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 78 STT Mã bệnh nhân Kết multiple PCR Kết cấy máu 27 BN27 Âm tính Streptococus Pneumonie 28 BN28 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 29 BN29 Âm tính Nấm candida Knisie 30 BN30 Âm tính Nấm candida Knisie 31 BN31 Escherichia coli 32 BN32 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 33 BN33 Âm tính Trực khuẩn Gr(-) 34 BN34 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 35 BN35 Âm tính Âm tính 36 BN36 Âm tính Trực khuẩn Gr(-) 37 BN37 Âm tính Âm tính 38 BN38 Âm tính Streptococcus Pneumonie 39 BN39 Âm tính Nấm candida Knisie 40 BN40 Âm tính Pseudomonas sp 41 BN41 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 42 BN42 Âm tính Trực khuẩn Gr(-) 43 BN43 Âm tính Trực khuẩn Gr(+) 44 BN44 Âm tính Âm tính 45 BN45 Âm tính Citrobacter sp 46 BN46 Escherichia coli Escherichia coli 47 BN47 Escherichia coli Escherichia coli 48 BN48 Âm tính Cầu khuẩn Gr (+) 49 BN49 Escherichia coli Escherichia coli 50 BN50 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 51 BN51 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia 52 BN52 Escherichia coli 53 BN53 Âm tính 79 Escherichia coli Escherichia coli Tụ cầu da STT Mã bệnh nhân Kết multiple PCR Escherichia coli Kết cấy máu 54 BN54 Escherichia coli 55 BN55 Âm tính Tụ cầu da 56 BN56 Âm tính Âm tính 57 BN57 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 58 BN58 59 BN59 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 60 BN60 Âm tính Tụ cầu da 61 BN61 Âm tính Trực khuẩn gram(-) 62 BN62 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 63 BN63 Âm tính Tụ cầuda 64 BN64 Escherichia coli Escherichia coli 65 BN65 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 66 BN66 Âm tính Tụ cầu da 67 BN67 Âm tính Âm tính 68 BN68 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Dữ liệu thu Bảng 3.8 cho thấy kết phương pháp multiplex PCR hoàn tồn trùng khớp với kết cấy máu Trong có 21 mẫu dương tính gồm mẫu Staphylococcus aureus, mẫu Escherichia coli, mẫu Acinetobacter baumannii, mẫu Klebsiella pneumonia mẫu Pseudomonas aeruginosa Kết khẳng định phương pháp multiplex PCR có độ nhạy độ đặc hiệu cao, có khả phát đồng thời xác chủng vi khuẩn khác gây nhiễm khuẩn huyết Hơn nữa, kết cho thấy phương pháp multiplex PCR có độ tin cậy Do đó, chúng tơi tiếp tục tiến hành thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trực tiếp mẫu lâm sàng 80 3.5.2 Kết thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu lâm sàng Mẫu lâm sàng mà sử dụng nghiên cứu 15 mẫu máu bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp Đầu tiên, DNA vi khuẩn từ mẫu máu tách chiết kit Qiagen theo dẫn kit Tuy nhiên, vi khuẩn mẫu máu chưa qua ni cấy nên có số lượng DNA thu chứa phần lớn DNA người Do đó, xử lý DNA người, làm giàu DNA vi khuẩn trước tiến hành PCR Kết phản ứng multiplex PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% thể Hình 3.9 Hình 3.10 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR mẫu lâm sàng Hình ảnh điện di sản phẩm multiplex PCR mẫu lâm sàng (máu bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết) 1-15 Sản phẩm multiplex PCR 1-15 mẫu lâm sàng, 16 Marker 1kb, 17 Đối chứng âm Kết điện di gel agarose cho thấy sản phẩm PCR mẫu máu số (đường chạy 4), (đường chạy 6), (đường chạy 8), 14 (đường chạy14) xuất băng sáng rõ có kích thước tương ứng với gen mdh (364 bp) chủng Klebsiella pneumonia, phoA (890 bp) chủng Escherichia coli, femA (296 bp) chủng Staphylococcus aureus gltA (722 bp) chủng Acinetobacter baumannii Riêng mẫu số 12 (đường chạy 81 12) xuất hai băng có kích thước 364 bp (mdh) 890 bp (phoA) Như vậy, mẫu dương tính với chủng Klebsiella pneumonia, mẫu dương tính với Escherichia coli, mẫu dương tính với Staphylococcus aureus, mẫu 14 dương tính với Acinetobacter baumannii, mẫu 12 dương tính với Klebsiella pneumonia Escherichia coli Mẫu đối chứng âm (đường chạy 17) cho kết âm tính chứng tỏ hóa chất mà chúng tơi sử dụng có độ tinh khiết cao q trình thao tác thí nghiệm đảm bảo không bị nhiễm Kết thu cho thấy phương pháp multiplex PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hiệu việc phát nhanh đồng thời sinh vật đích mẫu lâm sàng Phương pháp multiplex PCR có nhiều ưu điểm bật việc phát nhanh đồng thời nhiều vi khuẩn đích so với PCR đơn mồi Kĩ thuật multiplex PCR thiết lập dễ dàng nhiều phòng thí nghiệm bao gồm phòng thí nghiệm y học thực phẩm miễn phòng thí nghiệm trang bị máy PCR Mặc dù hầu hết phương pháp nuôi cấy truyền thống hữu dụng có giá trị, song phương pháp phát nhanh chủng vi khuẩn gây bệnh PCR công cụ khơng thể thiếu phòng thí nghiệm vi sinh y học Phát chủng gây nhiễm khuẩn phương pháp nuôi cấy truyền thống xét nghiệm hóa sinh ngày để có kết quả, PCR cần khoảng Việc chẩn đoán nhanh quan trọng bệnh nhân để có liệu pháp điều trị hợp lý, giảm thời gian nằm viện chi phí điều trị KẾT LUẬN - Đã nuôi cấy 1434 mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm khuẩn bệnh viện khoa HSTC phân lập 331 chủng vi khuẩn gây bệnh (tỷ lệ dương tính: 23,1%) Trong bao gồm 88 chủng có Acinetobacter baumannii, 17 chủng 82 Pseudomonas aeruginosa, 56 chủng Klebsiella pneumoniae, 38 chủng Escherichia coli, 25 chủng Staphylococcus aureus - Đã tách dòng khảo sát gen 16s, gen đích glt, phoA, femA, mdh, oprL chủng Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa - Đã thực thử nghiệm kỹ thuật Multiplex PCR phát tác nhân nghiên cứu mẫu chủng nuôi cấy mẫu bệnh kết độ nhạy đạt 100% so với kết nuôi cấy 83 KIẾN NGHỊ Nhóm nghiên cứu hồn thành nội dung kỳ báo cáo toán kinh phí, kính mong sở KHCN xem xét cấp tiếp kinh phí để nhóm nghiên cứu thực nội dung tiến độ kế hoạch 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO Abraham, S., et al., (2014), Carbapenemase-producing bacteria in companion animals: a public health concern on the horizon J Antimicrob Chemother, 69(5): p 1155-7 Quyên, T.n.T., (2012), Khảo sát kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus và chủng Staphylococcus spp tại Bệnh viện Nhân dân Gia Định Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh, 2012 Nga, C.M., (2008), Sự kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh thường gặp bệnh viện Thống Nhất năm 2006 Tạp chí Y Học TP Hờ Chí Minh, 12,194-200 Eickhoff, T.C., (1982), Nosocomial infections-1981 J Antimicrob Chemother, Suppl A: p 87-92 Organization, W.H., (2002), Prevention of Hospital-Acquired Infections A Practical Guide, 2nd ed Geneva: WHO Press, Lương Ngọc Khuê, P.Đ.M., (2012), Tài liệu đào tạo phòng và kiểm soát nhiễm khuẩn Y tế, p p 1-22 Nguyễn Văn Hiếu, Đ.Đ.A., Trần Thúy Hạnh, Nguyễn Gia Bình (2008), tình trạng đa kháng thuốc chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập Hà Nội Tạp chí Y học dự phòng, 5(97): p 65-70 Khải, T.V., (2014), Xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện yếu tố liên quan bệnh nhân nằm điều trị khoa hồi sức tích cực- chống độc bệnh viện đa khoa Thống năm 2014 Kỷ yếu Đề tài nghiên cứu khoa học bệnh viện đa khoa Thống nhất Đồng Nai Trương Anh Thư, N.V.H., Nguyễn Đạt Anh (2014), Tỉ lệ mắc nhiễm khuẩn bệnh viện sử dụng kháng sình số bệnh viện phía bắc Việt Nam Tạp chí Y học lâm sàng 10 Bowler, P.G., et al., (1999), Infection control properties of some wound dressings J Wound Care, 8(10): p 499-502 11 Liesenfeld, O., et al., (2014), Molecular diagnosis of sepsis: New aspects and recent developments Eur J Microbiol Immunol (Bp), 4(1): p 1-25 12 Yang, S., et al., (2002), Quantitative Multiprobe PCR Assay for Simultaneous Detection and Identification to Species Level of Bacterial Pathogens J Clin Microbiol, 40(9): p 3449-54 13 Yang, S., et al., (2008), Rapid PCR-based diagnosis of septic arthritis by early Gram-type classification and pathogen identification J Clin Microbiol, 46(4): p 1386-90 14 Poppert, S., et al., (2005), Rapid Diagnosis of Bacterial Meningitis by Real-Time PCR and Fluorescence In Situ Hybridization J Clin Microbiol, 43(7): p 3390-7 15 Moter, A., M Musci, and D Schmiedel (2002), Molecular Methods for Diagnosis of Infective Endocarditis Infect Dis Clin North Am, 16(2): p 393-x 16 Miller, R.J.H., et al., (2016), Development and evaluation of a novel fast broad-range 16S ribosomal DNA PCR and sequencing assay for diagnosis of bacterial infective endocarditis: multi-year experience in a large Canadian healthcare zone and a literature review BMC Infect Dis, 16 17 Karna, S.L.R., et al., (2016), RNA-Seq Transcriptomic Responses of Full-Thickness Dermal Excision Wounds to Pseudomonas aeruginosa Acute and Biofilm Infection PLoS One, 11(10) 18 Pirnay, J.P., et al., (2000), Quantitation of Pseudomonas aeruginosa in wound biopsy samples: from bacterial culture to rapid `real-time' polymerase chain reaction Crit Care, 4(4): p 255-62 19 Dowd, S.E., et al., (2008), Survey of bacterial diversity in chronic wounds using pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing BMC Microbiol, 8: p 43 20 Selva, L., et al., (2013), Detection of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae Type B by Real-Time PCR from Dried Blood Spot Samples among Children with Pneumonia: A Useful Approach for Developing Countries PLoS One, 8(10) 21 Vandesompele, J., et al., (2002), Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes Genome Biol, 3(7): p research0034.1-research0034.11 22 Untergasser, A., et al., (2012), Primer3-new capabilities and interfaces Nucleic Acids Res, 40(15): p e115 23 Liao, Y., et al., (2013), Combination of fluorescence color and melting temperature as a two-dimensional label for homogeneous multiplex PCR detection Nucleic Acids Res, 41(7): p e76 24 Ugozzoli L et al., (2002), Fluorescent multicolor multiplex homogeneous assay for the simultaneous analysis of the two most common hemochromatosis mutations Anal Biochem, 307: p 47–53 25 Gadsby, N.J., et al., (2016), Comprehensive Molecular Testing for Respiratory Pathogens in Community-Acquired Pneumonia Clin Infect Dis, 62(7): p 817-23 26 Thong, K.L., et al., (2011), Simultaneous detection of methicillinresistant Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa by multiplex PCR Trop Biomed, 28(1): p 21-31 27 Anbazhagan, D., et al., (2011), Development of conventional and realtime multiplex PCR assays for the detection of nosocomial pathogens Braz J Microbiol, 42(2): p 448-58 28 Martin-Pena, R., et al., (2013), Rapid detection of antibiotic resistance in Acinetobacter baumannii using quantitative real-time PCR J Antimicrob Chemother, 68(7): p 1572-5 29 Nomanpour, B., et al., (2011), Rapid, cost-effective, sensitive and quantitative detection of Acinetobacter baumannii from pneumonia patients Iran J Microbiol, 3(4): p 162-9 30 Wang, H.Y., et al., (2014), Multiplex real-time PCR assay for rapid detection of methicillin-resistant staphylococci directly from positive blood cultures J Clin Microbiol, 52(6): p 1911-20 31 Kais, M., et al., (2006), Quantitative detection of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis in lower respiratory tract samples by real-time PCR Diagn Microbiol Infect Dis, 55(3): p 169-78 32 Phùng Thị Bích Thủy, K.T.R.H., Phan Thu Chung, Tạ Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Liêm, (2012), Ứng dụng kỹ thuật real time PCR đa mồi chẩn đoán nguyên gây nhiễm trùng huyết trẻ em Bệnh viện Nhi trung ương Tạp chí y học Việt nam tháng – số đặc biệt 2012, 397: p 336-341 33 Trần Huy Hồng, N.H.T., Nguyễn Bình Minh, Trần Như Dương, Trần Vân Phương, Lương Minh Hòa, Đặng Đức Anh Nguyễn Trần Hiển (2012), Citrobacter freundii mang gen New Delhi - metallo - betalactamase (NDM-1) kháng carbapenem phân lập bệnh viện năm 2010-2011 Tạp chí y học dự phòng, Tập XXII, số (133) 34 Trịnh Văn Sơn, N.Đ.M., Lê Hữu Song (2016), Giá trị PCR đa mồi (SEPTIFAST) xác định mầm bệnh gây nghiễm khuẩn huyêt Truyền nhiễm Việt Nam, Số đặc biệt: p 79-80 35 Lý Ngọc Kính, N.T.B.H.v.c., et al., (2011), Tình hình sử dụng kháng sinh người bệnh bị nhiễm khuẩn bệnh viện số đơn vị điều trị tích cực Y học thực hành, 736(5): p 48- 52 36 Thảo, P.T.N., (2011), Giá trị tiên lượng cytokin nhiễm khuẩn huyết Y học Thành phố Hờ Chí Minh, 15: p 68-72 37 Miglietta, F., et al., (2015), Procalcitonin, C-reactive protein and serum lactate dehydrogenase in the diagnosis of bacterial sepsis, SIRS and systemic candidiasis Infez Med, 23(3): p 230-7 38 Bế Hồng Thu, L.v.H., (2013), Đánh giá thực trạng nhiễm trùng bệnh viện trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai từ 1/1/2009 đến 31/12/2010 Y học thực hành, 884(10): p 19-23 39 Balyimez, A., et al., (2013), Characterization of the Pseudomonas aeruginosa metalloendopeptidase, Mep72, a member of the Vfr regulon BMC Microbiol, 13: p 269 40 Miller, M.B., et al., (2005), Comparison of conventional susceptibility testing, penicillin-binding protein 2a latex agglutination testing, and mecA real-time PCR for detection of oxacillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus J Clin Microbiol, 43(7): p 3450-2 41 Kim, Y.K., et al., (2008), [Molecular typing of Staphylococcus aureus isolated from blood on the basis of coagulase gene polymorphism and toxin genes] Korean J Lab Med, 28(4): p 286-92 42 Mehrotra, M., G Wang, and W.M (2000), Johnson, Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance J Clin Microbiol, 38(3): p 1032-5 43 Bartual, S.G., et al., (2005), Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumannii J Clin Microbiol, 43(9): p 4382-90 44 De Vos, D., et al., (1997), Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes, oprI and oprL J Clin Microbiol, 35(6): p 1295-9 45 Rashno Taee, S., et al., (2014), Detection of algD, oprL and exoA Genes by New Specific Primers as an Efficient, Rapid and Accurate Procedure for Direct Diagnosis of Pseudomonas aeruginosa Strains in Clinical Samples Jundishapur J Microbiol, 7(10) 22-24,46,47,51-53,56,59,61,63,65,67,69,74 1-21,25-45,48-50,54-55,57,58,60,62,64,66,68,70-73,75- ... thực nghiên cứu: Nghiên cứu quy trình chế tạo KIT Multiplex Realtime PCR phát số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện bệnh viện Hà Nội Mục tiêu: Xây dựng quy trình chế tạo KIT Multiplex. ..BỆNH VIỆN THANH NHÀN BÁO CÁO KHOA HỌC TỔNG KẾT NĂM 2016 ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHẾ TẠO BỘ KIT MULTIPLEX REALTIME PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN THƯỜNG GẶP GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN TẠI CÁC... Multiplex PCR phát số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện CHƯƠNG TỔNG QUAN Nhiễm khuẩn bệnh viện 1.1 Lịch sử phát nghiên cứu nhiễm khuẩn bệnh viện Trong thời trung cổ, bệnh viện thành lập