Nguyên tắc: tạo dòng gene là phương pháp nh ằm chèn một đoạn gene mục tiêu vào một vector có khảnăng sao chép độc lập với tế bào vật chủ. Vector sau khi được gắn chèn sẽ được đưa vào tế bào chủ để tiến hành nhân lên với số lượng lớn. Tạo dòng gene bao gồm các chiến lược: tạo dòng đầu bằng, tạo dòng đầu dính, tạo dòng đầu A-T. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp tạo dòng thích hợp.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành tạo hai dòng plasmid chứa trình tự
mục tiêu của PRRSV type NA và PRRSV tye EU theo chiến lược đầu bằng. Sơ
đồ tạo dòng được trình bày trong hình 2.5.
Hình 2. 5. Sơ đồ tạo dòng PRRSV type EU và type NA làm chứng dương
2.1.1.1. Thu nhận vùng trình tự mục tiêu bằng phản ứng PCR
Thành phần phản ứng PCR nhân bản vùng trình tự ORF7 bằng cặp mồi
PR10 với enzyme Pfu DNA polymerase gồm:
Buffer Pfu 10X (Promega): 2,5 µl
Trình tự mục tiêu PRRSV được nhân bản bằng Pfu
pBluescript Sma I Sma I pBlue tái tổ hợp EU EU NA pBlue tái tổ hợp NA
dNTP 10mM (Promega – U1410): 1,0 µl
Mồi Pr-10_f 10µM: 1,0 µl
Mồi Pr-10_r 10µM: 1,0 µl
Mẫu cDNA (EU/NA) 1,0 µl
Pfu Polymerase (Promega- M7741) 0,5 µl
Dd H2O: 7,0 µl
Chương trình PCR như sau:
− Bước 1: 95oC trong 5 phút
− Bước 2 (lặp lại 35 chu kì) 94oC trong 30 giây 55oC trong 30 giây 72oC trong 1 phút
− Bước 3 72oC trong 6 phút
Sau khi PCR xong, kiểm tra kết quả phản ứng bằng cách điện di trên gel agarose 1,5%.
2.1.1.2. Phản ứng cắt plasmid pBluescript với enzyme Sma I
Buffer J 10X (Promega) 4,0 µl
Dung dịch BSA 10X (Promega) 4,0µl
Sma I 1,0 µl
Plasmid pBluescript (1µg/µl) 2,0 µl
Dd H2O 29 µl
Ủở 25oC trong 4 giờ.
2.1.1.3. Tinh sạch sản phẩm cắt
− Sản phẩm cắt được tinh sạch theo các bước sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
− Cho vào một thể tích phenol: cloroform (1:1), vortex đều. − Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi phía trên. − Cho vào 200 ul cloroform. Vortex đều cho đến khi thấy trắng đục. − Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi
− Cho vào 1/10 thể tích dung dịch Natri acetate 3M, pH 5,2. − Cho thêm hai thể tích ethanol tuyệt đối
− Giữở -200C trong 2h
− Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.
− Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. − Để tủa khô, hòa trong 20 µl TE 1X.
2.1.1.4. Phản ứng nối: pBluescript đã cắt với SmaI 1 µl Sản phẩm PCR-NA/EU 3 µl Buffer 10X 1,0 µl T4 ligase (3u/µl) 1,0 µl ddH2O 4,0 µl
Đặt phản ứng ở 160C trong 16 giờ. Sau đó biến nạp toàn bộ sản phẩm của phản ứng nối với tế bào E.coli khả nạp
2.1.1.5. Biến nạp hỗn hợp phản ứng nối vào tế bào E.coli DH5α
Nguyên tắc
Phương pháp biến nạp Calcium chloride (CaCl2) lạnh dựa trên hiện tượng ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập vào tế bào E.coli dễ dàng hơn. Tiếp theo là giai đoạn sốc nhiệt nhằm kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trường dinh dưỡng được thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao chép, phiên mã, dịch mã genee để tạo nên các protein tương ứng. Tùy thuộc vào đặc điểm của vector dùng trong tạo dòng mà ta chọn môi trường trãi đĩa thích h ợp nhằm tạo điều kiện dễ dàng cho việc sàng lọc.
Quy trình biến nạp bao gồm các bước sau :
Bước 1 : Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5α
− Cấy chuyền các tế bào E. coli DH5α từ ống nghiệm giữ giống vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB. Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC.
− Cấy 500 µl dịch nuôi cấy trên vào 50 ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC trong 2 giờđến khi đạt giá trị OD600 từ 0,3-0,6.
− Tiến hành ly tâm thu sinh khối tế bào ở vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
− Hòa sinh khối trong 25 ml dung dịch CaCl2 100 mM lạnh. Ủ trong đá 30 phút
− Ly tâm thu sinh khối tế bào với vận tốc 5000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
− Huyền phù nhẹ nhàng sinh khối tế bào trong 1 ml dung dịch CaCl2 100 mM. Giữ tế bào khả nạp trên đá nhằm chuẩn bịcho bước biến nạp.
Bước 2: Biến nạp hỗn hợp phản ứng nối vào tế bào E.coli DH5α khả nạp
− Cho toàn bộ phản ứng nối vào 100 µl tế bào khả nạp. − Ủtrong đá 30 phút.
− Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây. − Chuyển vào khay đá, ủ trong 2 phút.
− Bổsung 900 µl môi truong dinh dưỡng LB và nuôi ủ hoạt hóa trong 1 giờ − Ly tâm thu sinh khối ở vận tốc 10.000 vòng/phút trong 1 phút. Cô đ ặc và trãi hết dịch vi khuẩn trên đĩa môi trư ờng LB Agar Ampicillin/IPTG/Xgal, ủ ở 37oC trong 16 giờ.
2.1.1.6. Sàng lọc khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp
Thành phần phản ứng PCR khuẩn lạc gồm:
− Master mix 2x (h-tag): 12,5 µl
− Mồi T7 promoter 10µM: 1,0 µl
− Mồi Pr10-r 10µM: 1,0 µl
− DNA Mẫu 1 ít tế bào vi khuẩn
− Dd H2O: 10,5 µl
2.1.1.7. Kiểm tra kết quả tạo dòng bằng giải trình tự plasmid tái tổ hợp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Plasmid tái tổ hợp được gửi giải trình tự bằng phương pháp Sanger (Macrogene-Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng Blast nhằm kiểm tra khẳng định đã tạo dòng đúng trình tự mục tiêu.