Đểtăng cường độ nhạy của phản ứng multiplex Real time RT-PCR, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa phản ứng với các thông số về nhiệt độ lai, nồng độ các thành phần nguyên liệu như MgCl2, mồi, mẫu dò, Taq DNA polymerase. Ở mỗi thông số, chúng tôi khảo sát các giá trị khác nhau, đồng thời giữ nguyên giá trị của các thông số đã được tối ưu trước đó. Giá trị nào có Ct thấp nhất sẽ được chọn làm giá trị tối ưu cho thông số đó. Các thí nghiệm được khảo sát trên hai mẫu chứng: mẫu EU và mẫu NA được pha loãng trong huyết thanh âm tính.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành khảo sát một dãy nhiệt độ để chọn ra nhiệt độ lai tối ưu cho quy trình. Nhiệt độ lai là một nhân tố quan trọng cần phải được tối ưu trong phản ứng PCR. Nhiệt độ lai thấp làm mồi gắn vào mạch khuôn không đặc hiệu và do đó tạo ra những sản phẩm kí sinh. Nhiệt độ lai quá cao tạo điều kiện khắc nghiệt hơn cho mồi khi gắn vào mạch khuôn, vì thế sản phẩm sẽ có ít hoặc thậm chí không tạo thành được sản phẩm. Trong thí nghiệm này chúng tôi chọn dãy nhiệt độ từ 55-650C làm nhiệt độ khảo sát. Gradient nhiệt độ giữa các thí nghiệm do máy CFX 96 (Biorad) thiết lập. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3. 4: Giá trị Ct của mẫu EU và mẫu NA ở các nhiệt độ lai khác nhau Tên mẫu Nhiệt độ (0C) Mẫu EU Mẫu NA Chứng nội 65,0 36,07 34,16 N/A 64,5 36,83 33,94 N/A 63,3 35,13 34,05 37,13 61,4 34,44 35,04 32,50 59,0 33,72 33,51 31,36 57,0 33,93 33,86 30,98 55,7 34,08 32,62 31,09 55,0 34,27 33,86 30,86 Nhận xét
Dựa vào bảng giá trị Ct trên bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy:
− Mẫu EU: Giá trị Ct cho kết quả tốt nhất ở khoảng nhiệt độ từ 57-590C. Nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn 57-590C đều cho giá trị Ct càng cao (độ nhạy càng giảm).
Nhiệt độcàng tăng thì giá trị Ct càng tăng, độ nhạy càng giảm.
− Chứng nội IC7: Giá trị Ct cho kết quả tốt nhất tương ứng với nhiệt độ lai từ 55-570C. Khi nhiệt độ lai tăng, giá trị Ct càng tăng cho đến không thể phát hiện ở nhiệt độ 64,5-650C.
Như vậy, trong cùng một phản ứng, để đồng thời có một nhiệt độ lai tối ưu cho cả ba đối tượng cần phát hiện là PRRSV type EU, PRRSV type NA và chứng nội IC7, chúng tôi chọn nhiệt độ 570C làm nhiệt độ lai cho quy trình multiplex Real time RT-PCR.
3.3.2. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ MgCl2
Thông số tiếp theo mà chúng tôi khảo sát là nồng độ MgCl2. MgCl2 là thành phần cần thiết cho hoạt động của enzyme DNA polymerase vì là cofactor
của enzyme này. Nếu thành phần MgCl2 không đủ sẽ làm cho enzyme
polymerase hoạt động không hiệu quả, giảm độ nhạy của phản ứng. Nếu thành phần MgCl2 quá cao có thể làm enzyme hoạt động không còn đặc hiệu và kết quả là các sản phẩm kí sinh xuất hiện hoặc ức chế phản ứng.
Chúng tối tiến hành khảo sát thông số MgCl2 với các nồng độ 3,5 mM; 4,5 mM và 5,5 mM. Các thành phần khác của phản ứng Real time RT-PCR được giữ nguyên. Chương trình PCR đư ợc thiết lập như trên với nhiệt độ lai là 570C. Kết quảđược trình bày trong hình bảng 3.5.
Nhận xét:
Ở cả 2 mẫu chứng NA và EU, chúng tôi thấy rằng khi tăng nồng độ MgCl2 từ 3,5-5,5 mM, giá trị Ct của EU, NA và IC7 đều không có sự khác biệt. Dựa vào kết quả thực nghiệm kết hợp với tham khảo nồng độ MgCl2 trong các công trình đã công bố [16], [25], chúng tôi chọn nồng độ MgCl2 là 4,5 mM làm nồng độ hoạt động cho quy trình phát hiện của chúng tôi.
Nồng độ MgCl2 Giá trị Ct trung bình 3,5 mM 4,5 mM 5,5 mM Mẫu EU 33,68 33,27 33,89 Mẫu NA 33,79 33,66 33,36 IC7 30,46 30,58 30,27
3.3.3. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: nồng độ mồi PR6 PR6
Nồng độ mồi cũng là một yếu tố cần khảo sát trong quy trình tối ưu hóa phản ứng. Nồng độ mồi quá cao có khảnăng tạo primer-dimer mà không làm gia tăng hiệu quả nhân bản của phản ứng. Ngoài ra việc tăng nồng độ mồi còn có khả năng làm xuất hiện các sản phẩm kí sinh trong phản ứng.
Dựa vào các kết quả thực nghiệm, người ta khuyến cáo nồng độ mồi trong phản ứng PCR thường từ 0,2-1µ M. Ngoài ra, dựa vào tham khảo công trình của Egli C. et al. (2001) [16], Lurchachaiwong W. et al. (2008) [25] chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ mồi PR6 (PR6-F và PR6-R) ở ba nồng độ: 200 nM; 300 nM và 400 nM. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.6.
Nhận xét:
Dựa trên kết quả bảng 3.6, chúng tôi thấy rằng ở nồng độ mồi 400nM, ở cả hai mẫu chứng đều cho giá trị Ct của EU và NA cao nhất. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ mồi PR6 là 0,4 µM làm nồng độ hoạt động cho quy trình.
Bảng 3. 6. Giá trị Ct của hai mẫu chứng ở các nồng độ mồi PR6 Nồng độ PR6 Giá trị Ct trung bình 200 nM 300 nM 400 nM Mẫu EU 33,61 33,30 33,24 Mẫu NA 35,17 34,26 33,72 IC7 32,53 31,94 32,26
3.3.4. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: mẫu dò PR6-P1. P1.
Tương tự như mồi, nồng độ mẫu dò cũng là một thông số cần khảo sát vì nồng độ mẫu dò quá thấp sẽ ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng. Ngược lại nồng độ mẫu dò quá cao sẽ gây tốn kém vô ích. Nồng độ mẫu dò trong phản ứng thường dao động từ 50-250 nM. Dựa vào các kết quả tối ưu các thông sốở trên, chúng tôi thấy rằng tín hiệu kết thúc huỳnh quang (end-point) của EU luôn thấp hơn so với tín hiệu của NA. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát ba nồng độ mẫu
dò PR6-P1: 100 nM; 150 nM và 200 nM. Kết quảđược trình bày trong hình 3.8.
Hình 3. 8: Khảo sát nồng độ mẫu dò PR6-P1. A: mẫu EU; B: mẫu NA A B 200 nM 150 nM 100 nM IC7 IC7 200 nM 150 nM 100 nM Ct của EU Ct của NA
Dựa vào kết quả trên hình 3.8, chúng tôi thấy rằng đối với cả hai mẫu chứng, khi tăng nồng độ mẫu dò PR6-P1 đều không làm ảnh hưởng đến giá trị Ct của cả EU, NA và IC7. Tuy nhiên trên hình 3.8 cho thấy có sự tăng tín hiệu kết thúc huỳnh quang ở nồng độ mẫu dò 200 nM. Do đó chúng tôi chọn nồng độ
mẫu dò PR6-P1 200 nM làm nồng độ hoạt động cho quy trình multiplex Real
time RT-PCR đồng thời phát hiện và phân type PRRSV.
3.3.5. Tối ưu hóa phản ứng multiplex Real time RT-PCR: Taq DNA polymerase polymerase
Enzyme Taq polymerase là một nhân tố quan trọng của PCR vì nó ảnh hưởng đến hiệu suất cũng như đ ộ nhạy của phản ứng. Đặc biệt nồng độ Taq
polymerase cần được khảo sát để cung cấp đủ nguyên liệu trong trường hợp phản
ứng multiplex PCR.
Trong quy trình này chúng tôi tiến hành khảo sát bốn nồng độ Taq DNA
polymerase : 1 unit; 1,5 unit; 2 unit; 2,5 unit. Kết quả được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3. 7: Giá trị Ct của mẫu EU và mẫu NA Tên mẫu Nồng độ Taq polymerase Mẫu EU Mẫu NA Chứng nội 1 unit 31,13 35,58 32,46 1,5 unit 30,60 34,28 32,30 2 unit 30,22 34,24 32,07 2,5 unit 30,06 34,36 32,63
Dựa vào kết quả trên bảng 3.7, chúng tôi thấy rằng đối với cả hai mẫu chứng EU và NA, khi nồng độ Taq polymerase càng tăng thì giá trị Ct càng thấp. Tuy nhiên so sánh với giá trị Ct ở nồng độ 1,5 unit với nồng độ 2 và 2,5 unit thì sự khác biệt là không đáng kể (khoảng 0,5 Ct). Do đó chúng tôi chọn nồng độ
Taq DNA polymerase là 1,5 unit vì vừa đảm bảo hiệu quả vềđộ nhạy của phản ứng vừa đảm bảo về hiệu quả kinh tế.
3.4. Xác định ngưỡng phát hiện và sựđặc hiệu của quy trình
3.4.1. Ngưỡng phát hiện của quy trình
Ngưỡng phát hiện của quy trình hay còn gọi là nồng độ giới hạn mà tại đó phản ứng vẫn có dấu hiệu huỳnh quang [33] . Đểxác định ngưỡng phát hiện của
quy trình, chúng tôi tiến hành pha loãng bậc 10 mẫu VR2332 (ATCC) có nồng
độ 105,75 TCID50/200 µl trong mẫu huyết thanh âm tính thành sáu nồng độ: 103,75; 102,75; 101,75; 100,75; 10-0,25 và 10-1,75 TCID50/200 µl. Các mẫu này được tách chiết
RNA bằng phương pháp Phenol- Chloroform và được tiến hành Real Time RT-
PCR với các thành phần đã tối ưu. Kết quảđược trình bày trong hình 3.9 và giá trị Ct ở các bậc pha loãng được trình bày trong bảng 3.8.
Hình 3. 9: Độ nhạy của quy trình Real time RT-PCR
10-0,25 TCID 10-1,25 TCID 100,75 TCID 101,75 TCID 102,75 TCID 103,75 TCID IC
TCID50 (50% tissue culture infective dose) là liều lây nhiễm trên tế bào nuôi cấy 50% nghĩa là khi cho một lượng virus lây nhiễm lên tế bào nuôi cấy thì sẽ có 50% tế bào bị lây nhiễm [59]. Kết quả trên hình 3.9 và bảng 3.8 cho thấy quy trình của chúng tôi có thể phát hiện được PRRSV với liều lượng thấp nhất là 10-1,25 TCID50/0,2 ml tương ứng với 0,3 TCID50/ml với chu kì ngưỡng là 40,25. Điều này cho thấy quy trình mà chúng tôi xây dựng có giới hạn phát hiện là dưới
1 TCID50/ml PRRSV. Nhiều công trình sử dụng phương pháp Real time RT-PCR
được công bố gần đây cũng cho kết quả tương tự (công trình của Egli C., 2001; Kleiboeker S.B., 2005).
3.4.2. Sựđặc hiệu của phản ứng trên các vi sinh vật khác
Để chứng minh sựđặc hiệu của quy trình, chúng tôi tiến hành tách chiết và thực hiện phản ứng Real time RT-PCR trên các hai nhóm mẫu: (1) các mẫu chứa
các chủng virus: Transmissible gastroenteritis Coronavirus (TGEV, mẫu
ATCC), Porcine Rotavirus (ATCC) và Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV, mẫu tạo dòng); (2) các mẫu chứa các vi khuẩn Clostridium perfringenes (mẫu tạo
dòng), Salmonella spp.(ATCC) và E. coli (ATCC). Đây là các vi sinh vật thường
xuất hiện ở heo và là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cấp ở heo.
Đối với nhóm virus thì chúng tôi tách chiết RNA rồi phiên mã ngược thành
cDNA. Đối với nhóm vi khuẩn thì chúng tôi tách chiết DNA. Các cDNA và
DNA này được sử dụng để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng multiplex Real
103,75 102,75 101,75 100,75 10-0,25 10-1,25 NA 26,01 29,13 32,11 34,20 38,10 40,25 IC7 33,29 33,13 33,16 33,18 32,57 33,06 Nồng độ NA (TCID50/0,2 ml) Giá trị Ct trung bình
3.10.
Nhận xét:
Kết quả Real time RT-PCR trên hình 3.10 cho thấy không có tín hiệu xuất hiện ở tất cả các mẫu chứa E. coli , Salmonella spp, Clostridium perfringenes, TGEV, PEDV và Porcine Rotavirus. Nhưng đồng thời ở tất cả các mẫu này đều xuất hiện các tín hiệu điện di duy nhất trên bản gel agarose khi sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng (hình 3.11).
Từ các kết quả trên hình 3.10 và 3.11, chúng tôi có thể kết luận quy trình
multiplex Real time RT-PCR đồng thời phát hiện và phân type PRRSV của
chúng tôi có độ đặc hiệu cao, chỉ cho phép phát hiện PRRSV, không phát hiện các chủng vi sinh vật thường xuất hiện ở heo.
Hình 3. 10: Kiểm tra độ đặc hiệu của quy trình Real time RT-PCR
TGEV
Clostridium perfringenes
PEDV
Salmonella spp TGEV
Hình 3. 11: Kết quảđiện di sản phẩm PCR từ các vi khuẩn và virus
Ghi chú:
- Giếng 1: thang kích thước DNA 1 kp
- Giếng 2: sản phẩm PCR từ E. coli có kích thước 113 bp.
- Giếng 3: sản phẩm PCR từ Salmonella spp có kích thước 570 bp
- Giếng 4: sản phẩm PCR từ Clostridium perfringenes có kích thước 327 bp - Giếng 5: sản phẩm PCR từ TGEV có kích thước168 bp
- Giếng 6: sản phẩm PCR từ PEDV có kích thước 651 bp
- Giếng 7: sản phẩm PCR từ Porcine Rotavirus có kích thước 356 bp
3.4.3. Đánh giá khảnăng phát hiện và phân type của phản ứng multiplex Real Time RT-PCR trên mẫu có sự hiện diện đồng thời PRRSV type Real Time RT-PCR trên mẫu có sự hiện diện đồng thời PRRSV type NA và PRRSV type EU
Do việc sử dụng đồng thời các nguồn vaccine nhược độc có nguồn gốc từ
PRRSV type EU và PRRSV type NA, nên có khảnăng ởnước ta đang lưu hành
đồng thời cả hai type PRRSV. Chính vì vậy sẽ có thể có một tỉ lệ nhỏtrường hợp đồng nhiễm cả hai type trên cùng một mẫu heo nuôi. Trường hợp này đã được báo cáo trong công trình của Li V.Y.Y. et al (Hội nghị quốc tế vềPRRS năm
ủ ễ ọ ả ộ ự(2011) khi đánh giá t
100 bp 500 bp 1000 bp
ghi nhận 6/20 mẫu thực địa có sựđồng nhiễm cả hai type PRRSV [1]. Việc đồng nhiễm cả hai type PRRSV có thể dẫn đến nguy cơ tái tổ hợp giữa hai type
PRRSV [30]. Do đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra xem phản ứng Multiplex Real Time RT-PCR mà chúng tôi xây dựng có khảnăng phát hiện được sự hiện diện của hai type PRRSV trong cùng một mẫu hay không?
Đầu tiên chúng tôi tiến hành tạo các mẫu đồng nhiễm: (1) mẫu ES1 có nồng độ virus NA cao và virus EU thấp và (2) mẫu ES2 có nồng độ virus NA thấp và virus EU cao. Sau đó tiến hành phản ứng Real time RT-PCR đối chiếu giữa mẫu đồng nhiễm với các mẫu đơn nhiễm chứa lượng virus tương đương. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.9:
Bảng 3. 9: Giá trị Ct của mẫu đồng nhiễm và đơn nhiễm PRRSV
Tên mẫu EU NA ES1 ES2
Giá trị Ct 35,22 28,52 38,02/30,10
27,84 38,54 28,57/37,64
Nhận xét:
Kết quả trong bảng 3.9 cho thấy quy trình của chúng tôi có khảnăng phát hiện ở những mẫu chứa vật liệu di truyền của cả hai type PRRSV. So sánh giá trị Ct giữa mẫu đồng nhiễm và mẫu đơn nhiễm cho thấy ở mẫu đồng nhiễm có sựgia tăng giá trị từ 1-3 Ct (giảm độ nhạy) chứng tỏ có sự cạnh tranh giữa các mồi và mẫu dò. Kết quảđánh giá tương tự cũng đã được chứng minh trong công trình của Egli C. et al (2001).
Như vậy, qua thí nghiệm trên chúng tôi có thể kết luận phản ứng
multiplex Real Time RT-PCR mà chúng tôi xây dựng có thể phát hiện và phân type được mẫu huyết thanh đơn nhiễm cũng như đồng nhiễm hai type PRRSV.
Để kiểm tra khả năng phát hiện và phân type PRRSV của quy trình
Multiplex Real time RT-PCR mà chúng tôi xây dựng trên mẫu heo nuôi thực địa,
chúng tôi tiến hành so sánh quy trình với kit Real time thương mại (kit PRRSV
Real time RT-PCR của Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd, Trung Quốc) trên 20 mẫu
thực địa đã được kiểm tra bằng kháng thể ELISA (kit Herdchek*PRRS 2XR của
IDEXX) do công ty Thuốc Thú y Trung Ương-Navetco. Kết quả được trình bày
trong bảng 3.10.
Nhận xét:
Kết quả trên bảng 3.10 cho thấy quy trình Real time RT-PCR của chúng tôi cho kết quảtương đồng cả trên 20/20 mẫu heo với Kit PRRSV Real Time
RT-PCR của Shanghai ZJ Biotech Co., Ltd. Trong 20 mẫu heo được kiểm tra, có
6 mẫu âm tính, 1 mẫu dương tính PRRSV type EU và 13 mẫu dương tính với
PRRSV type NA.
Riêng đối với Kit Herdchek*PRRS 2XR của IDEXX phát hiện kháng thể PRRSV theo nguyên tắc ELISA, quy trình của chúng tôi chỉ cho kết quảđồng nhất trên 16/20 mẫu heo. 4 mẫu cho kết quả không trùng khớp là mẫu 5, 6, 10 và 16. Trong trường hợp mẫu heo âm tính với kháng thể PRRSV (mẫu 5 và 6) nhưng dương tính với hai quy trình Real Time RT-PCR, nguyên nhân của sự không đồng nhất có thểlà do độ nhạy của kit Herdchek*PRRS 2XR. Trường hợp ngược lại, mẫu heo dương tính với kháng thểPRRSV nhưng âm tính với hai quy
trình Real Time RT-PCR, nguyên nhân có thể là do kháng thể PRRSV trong mẫu
heo nuôi có nguồn gốc từvaccine nhược độc.
Như vậy, qua kết quả so sánh với hai bộ kit thương mại, chúng tôi có thể