Sau khi đã thiết kế thành công các cặp mồi, mẫu dò đặc hiệu, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng multiplex các cặp mồi và mẫu dò trên.
Đầu tiên, để mô phỏng mẫu thực địa, chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu chuẩn VR2332 (ATCC) đại diện cho PRRSV type NA (viết tắt là mẫu EU) và mẫu vaccine Amervac đại diện cho PRRSV type EU (viết tắt là mẫu EU) trong mẫu huyết thanh heo âm tính với PRRSV (mẫu từ heo sạch bệnh được kiểm tra với kháng thể bằng bộ kit ELISA). Mẫu huyết thanh âm tính này được cung cấp bởi Công ty thuốc Thú Y Trung Ương -Navetco. Thực hiện phản ứng multiplex Real time RT-PCR với các thành phần cơ bản tương tự như trong phản ứng monoplex. Kết quảđược trình bày trong hình 3.7 và bảng 3.3.
VR2332 IC7 Mẫu EU EU IC7 Mẫu NA
Bảng 3. 3: So sánh kết quả monoplex và multiplex Real-time RT PCR Phản ứng
Giá trị Ct
Monoplex Real time RT-PCR
Multiplex Real time RT-PCR
Mẫu EU 31,42 34,68
Mẫu NA 33,92 35,36
Chứng nội IC7 31,30 32,52
Kết quả trong hình 3.7 cho thấy phản ứng multiplex Real time RT-PCR chỉ
phát hiện PRRSV type EU trong mẫu EU và PRRSV type NA trong mẫu NA.
Điều này cho thấy phản ứng multiplex Real time RT-PCR có thể phát hiện và phân type PRRSV đúng với từng loại mẫu chứng. Tuy nhiên, khi so sánh với kết quả monoplex (bảng 3.3), chúng tôi thấy rằng sau khi tổ hợp nhiều thành phần với nồng độ giống như phản ứng monoplex, giá trị Ct của cả hai mẫu chứng EU và NA đều giảm từ 2-3 Ct. Đó là do trong phản ứng multiplex, có nhiều thành phần nên gây cạnh tranh lẫn nhau. Điều này có thể khắc phục bằng các bước tối ưu hóa phản ứng.
Như vậy, về cơ bản phản ứng multiplex Real time RT-PCR của chúng tôi đã thực hiện được nhiệm vụ của nó là đồng thời phát hiện và phân type PRRSV.