Để thiết kế thành công mồi và mẫu dò đ ặc hiệu cho phản ứng Real-time PCR cần tuân thủ những nguyên tắc sau:
- Kích thước sản phẩm nhân bản từ 75-200 bp. - Cần tránh cấu trúc thứ cấp nếu có thể.
- Chiều dài mồi khoảng 17-20 bp với hàm lượng GC từ 50-60%. - Kiểm soát nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi ở giữa 50 và 650C. - Thiết kế base G và C ở đầu cuối của mồi.
- Kiểm tra trình tự của mồi xuôi và ngược để đảm bảo không có sự bắt cặp bổ sung ởđầu 3’ (tránh tạo ra primer-dimer).
- Chiều dài mẫu dò khoảng 25-30 bp.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mẫu dò cao hơn của mồi từ 5-10oC.
Dựa vào các bài báo khoa học đã công bố chúng tôi nhận thấy vùng trình tự ORF 7 của PRRSV là vùng thích hợp cho việc thiết kế mồi và mẫu dò phát hiện và phân type PRRSV. Sơ đồ thiết kế cặp mồi và mẫu dò như trong hình 2.4.
Hình 2. 4. Sơ đồ thiết kế các mồi và mẫu dò phát hiện và phân type PRRSV
Thiết kế mồi và mẫu dò đồng thời phát hiện và phân type PRRSV được tiến hành theo các bước sau:
- Tải các trình tự ORF 7 của PRRSV type EU và PRRSV type NA đã được
công bố từcơ sở dữ liệu NCBI
- Dùng phần mềm ClustalX 1.81 để sắp gióng cột các trình tự ORF7 của hai type PRRSV nhằm tìm ra những vùng trình tự bảo tồn cao cũng như những vùng có trình tựđặc trưng cho cả hai type.
- Chọn ra vùng có sự tương đồng chung giữa hai type để sử dụng làm cặp mồi chung, và hai vùng riêng đặc trưng cho từng type để làm mẫu dò. - Kiểm tra các yêu cầu cần thiết của mồi và mẫu dò: % GC, nhiệt độ nóng
chảy …
- Kiểm tra lại sự đặc hiệu của mồi và mẫu dò bằng công cụ Basic Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
Bên cạnh đó, nhằm kiểm soát qui trình phát hiện Real time RT-PCR,
chúng tôi tiến hành thiết kế các mồi và mẫu dò đặc hiệu với chứng nội nội sinh. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng trình tự các cặp mồi của Erkens T. et al.,
PRRSV type EU PRRSV type NA PR6-F PR6-F PR6-R PR6-R PR6-P2 PR6-P1
(2006) và Nygard A.B. et al., (2007) cho sự phát hiện các gene mã hóa cho ribosomal protein L4 (RPL4), TATA box binding protein (TBP) và beta actin (ACTB) ở heo [17],[38],[44]. Song song đó, chúng tôi thiết kế thêm các mẫu dò đặc hiệu với các RPL4, TBP và ACTB.
Đầu tiên chúng tôi tải trình tự RPL4 (DQ845176), TBP (DQ178129) và
ACTB (DQ178122) của heo được công bố trên NCBI. Sau đó dùng phần mềm
AlleleID 7.0 đề tìm các mẫu dò tốt nhất.